一種林可霉素產生菌的篩選方法

專利名稱：一種林可霉素產生菌的篩選方法
技術領域：
本發明涉及林可霉素產生菌的篩選方法，特別是涉及一種可以提高林可霉 素產量的突變菌的篩選方法。
背景技術：
林可霉素，又稱潔霉素，是由林肯鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis)產生的 林可酰胺類抗生素，組分包括氨基酸和糖，是由1^-酪氨酸和戊糖磷循環(戊糖-5-磷酸和景天糖-7-磷酸)的中間產物縮合而成，整個生物合成途徑包括2個分支 一個由L-酪氨酸合成丙基脯氨酸(PPL)，另一個由景天糖-7-磷酸構成a —甲硫林 可胺(a-MIL)，是經三級有氧發酵生產的。抗革蘭氏陽性菌，臨床主要用于治療 革蘭氏陽性菌引起的感染，具有療效顯著，副反應少，不易產生交叉耐藥性等 特點，廣泛運用于臨床。另外其深加工衍生物用量不斷地加大，是一種很有前 途的抗生素，所以提高林可霉素的生產水平勢在必行！而篩選高產林可霉素的 菌株是提高林可霉素的生產水平最為有效的途徑之一。
目前，篩選高產林可霉素的菌株的方法有:用紫外線/氯化鋰復合誘變劑對 林可霉素產生菌進行處理，并用高效的瓊脂塊培養法對菌株進行篩選.結果:篩
選出的菌株在搖瓶中的發酵單位比對照菌株提高了 21.73%;而用熱誘變對林可 霉素產生菌進行處理，并用高效的瓊脂塊培養法對菌株進行篩選，結果:篩選出 的菌株在搖瓶中的發酵單位比對照菌株提高了 23.53%;這些篩選林可霉素高產 菌株方法，對林可霉素產量提高不大，效果仍不甚理想。 發明內容因此人類對提高林可霉素產量的高產菌株的篩選方法仍存在需求，至今為 止，還沒有發現任何有關本發明的報道，本發明人經過反復研究，終于找到了 提高林可霉素產量的高產菌株的篩選方法,完成了本發明。針對上述情況，為
克服現有技術的缺陷，本發明的目的就在于提供一種提高林可霉素產量的突變 菌株的篩選方法。
為達到上述目的，本發明所述的篩選方法如下:
將冷凍保藏的沙土管接入斜面培養成熟后，作為出發菌種，刮去適量孢子 經無菌水稀釋后，注入N"進行誘變處理，在含有蛋氨酸的培養基上培養，用瓊 脂塊培養法進行初篩，用一級、二級發酵培養基發酵培養進行復篩，將選出的 高產突變株進行遺傳穩定性試驗，即可獲得目的菌株。
所述誘變劑N"注入劑量為5-50keV，抗性物質蛋氨酸濃度百分比為 0.1-4.0%。
所述一級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1,0—3.0%、
豆粉1.0—3.0%、蛋白胨0.3~~0.7%、葡萄糖0.5—i.5%、 KN03 0.1—0.3%、 NaH2P040.4—1.0%、 CaCO30.1~~0.5%、余量為水，pH6—8;
250mL三角瓶裝液30mL, 25—35"， 220r/min條件下培養40~60h;
所述二級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1.0—3.0%、 葡萄糖0,5—1.5%、豆餅粉0.5—2.0%、水解蛋白0.5—1.0%、 (NH4)2S04 0.1~0.5 %、 Mg2S040.05—0.2% 、 KH2P040.01—0.05% 、 CaC03 0.1—1.0% 、余量為 水，pH6—8;
250mL三角瓶裝液30mL，由一級發酵液按5°/。接種量接種，25—35。C， 220r她條件下培養100—120h;在本發明中，由于質、能、荷三因子的協同作用，離子束注入引起大量受 體原子移位、重組和生物大分子的變異，形成新的分子結構和基因，產生豐富 的基因突變，因而離子注入可以在損傷較輕的情況下獲得較高的突變率。利用 林肯鏈霉菌對自身產物及其前體物的抗性篩選，有明確的方向性，更有利于加 快篩選工作的進程，擴大篩選的規模，增加正突變率。本發明以林可霉素前體 物-蛋氨酸為添加劑，利用林可霉素抗性篩選法作為誘變育種的輔助篩選手段， 結合氮離子注入誘變，進行定向育種，大幅提高了篩選效率。
本發明采用林可霉素抗性篩選結合離子注入誘變方法，選育林可霉素產生
菌獲得較好的效果，通過多輪選育得到一株發酵效價提高81.4%且遺傳性狀穩
定的突變菌株。并研究了不同離子注入參數對菌株存活率的影響，總結離子注
人對林肯鏈霉菌產生的生物學效應，為進一步優化離子注入參數用于選育高產 林可霉素產生菌株提供參考，使用林可霉素抗性作為篩選手段大大提高了正突
變菌株的選育效率。


下面結合附圖對本發明作進一步說明。
圖1是本發明一實施例進行離子注入誘變菌株存活率曲線圖。
具體實施例方式
本發明所述的篩選方法如下-
將冷凍保藏的沙土管接入斜面培養成熟后，作為出發菌種，刮去適量孢子 經無菌水稀釋后，注入N"進行誘變處理，在含有蛋氨酸的培養基上培養，用瓊 脂塊培養法進行初篩，用一級、二級發酵培養基發酵培養進行復篩，將選出的 高產突變株進行遺傳穩定性試驗，即可獲得目的菌株。所述誘變劑N^注入劑量為5-50keV，抗性物質蛋氨酸濃度百分比為 0.1-4.0%。
所述一級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1.0—3.0%、
豆粉1.0—3.0%、蛋白胨0.3~0.7%、葡萄糖0.5—1.5%、 KN03 0.1_0.3%、 NaH2P040.4—1.0%、 CaCO30.1~0.5%、余量為水，pH6—8;
250mL三角瓶裝液30mL， 25—35。C， 220r/min條件下培養40—60h;
所述二級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1.0—3.0%、 葡萄糖0.5—1.5%、豆餅粉0.5_2.00%、水解蛋白0.5—1.0o%、 (NH4)2S04 0.1—0.5 %、 Mg2S040.05—0.2% 、 KH2P040.01—0.05%、 CaCO30.1—1.0%、余量為水， pH 6—8;
250mL三角瓶裝液30mL,由一級發酵液按5%接種量接種，25—35°C， 220r/min條件下培養100—120h; 1材料與方法 1. 1菌種
出發菌株林肯鏈霉菌816A，由南陽普康藥業有限公司菌種研究所保存； 1. 2培養基及培養條件 斜面與平板分離培養基營養瓊脂培養基
一級發酵培養基淀粉2.0%、豆粉2.0%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1.0%、 KNO30.2%、 NaH2PO40.7%、 CaCO30.3%、余量為水，pH7.0;
250mL三角瓶裝液30mL， 30°C， 220r/min條件下培養48h;
二級發酵培養基淀粉2.0%、葡萄糖1.0%、豆餅粉1.5%、水解蛋白0.5 %、 (NH4)2SO4 0.20%、 Mg2SO40.1% 、 KH2PO40.03% 、 CaCO30.5% 、余量水，pH7.2;
250mL三角瓶裝液30mL，由一級發酵液按5%接種量接種，30°C， 220r/min 條件下培養108h;
生物鑒定培養基八疊球菌抗菌活性測定培養基pH 7.5 8.0，中國藥品生 物制品檢定所
1. 3誘變劑及處理方法
林肯鏈霉菌經斜面培養基活化后，孢子成熟，室溫下，用無菌水洗下斜面 孢子并用接種環輕刮斜面表面，將菌懸液加到盛有玻璃珠的無菌水中，放入搖 床220r/min， 30°C，培養30min，使孢子充分分散和活化，然后用微孔過濾注射 器過濾除去菌絲體，濾液即為誘變用的出發菌株，孢子懸液過濾后取O.lmL孢 子濾液均勻涂布于無菌培養皿上，以無菌風吹至干燥后進行N^"注入，N"注入 機為LZD900多功能N"注入機，本實驗用能量為5 50keV的W進行不同注量 的離子注入進行誘變，靶室真空度為10Pa，以5s脈沖式注入，間隔15s。 IsT注 入后，取出平皿，用1.5mL無菌水洗脫，梯度稀釋到10'6涂布到含有不同濃度 (0.3 3.0%)蛋氨酸的平板培養基上，30。C培養箱中培養至長出單菌落，空白 平板作對照，計數單菌落數目，以作存活率統計，然后繼續培養至成熟，挑長 勢良好的單菌落接斜面，成熟后用以篩選；
存活率誘變過的菌株，在固體平面培養基生長的菌落數與未誘變對照菌 株在固體平面培養基生長的菌落數的比值，即是其存活率。
1. 4篩選方法
初篩采用瓊脂塊培養法進行初篩抑菌活力(抑菌比，IR^抑菌圈直徑(mm) /菌落直徑(mm);具體方法將菌株3(TC培養3d，用打孔器將單菌落連同瓊脂塊一同取出放入空培養皿中(80 90瓊脂塊)，在3(TC 、相對濕度75%靜止培 養5d，刮取少量的成熟孢子傳入斜面，然后再將每個瓊脂塊移到含抗菌的生物 鑒定平板上(120 150瓊脂塊)，37。C培養16 18h,測定抑菌圈直徑，挑出抑菌 圈明顯大于對照菌(未作誘變處理)抑菌圈的菌落，做進一步搖瓶實驗，對照組菌 落瓊脂塊應放在同一生物檢定平板上培養，對照菌落的數量應不低于總瓊脂塊 的20% ，放置位置須遍布檢定平板的各個部位。
復篩發酵液經濾紙過濾后采用管蝶法測生物效價
1.5遺傳穩定性試驗
挑取經篩選的對八疊球菌有較強抑制效果的突變菌株進行傳代培養，連續 傳7 10代，對每一代進行搖瓶發酵培養，收集發酵液，對發酵原液過濾后采 用管蝶法測其抑菌效果，從而判斷遺傳穩定特性。
2實驗結果
2.1離子注入存活率曲線
實驗以816A為原始出發菌株，進行離子注入誘變，注入離子為氮離子，不 同注入能量誘變條件下菌株816A的存活率曲線如圖1所示。 2.2篩選結果
挑取菌落形態良好，生命力強的菌落進行擴大培養，之后按材料與方法所 述進行培養與篩選，得到的初篩結果見表2。表2復合誘變處理對菌株的復篩結果
菌株發酵效價(u)提高率 (%)
123平均CK(816A)25022491248724930.0
816A-001334634653518344338.1
816A-033367838233715373950.0
816A-139342534663397342937.6
816A-142411341254058409964.4
816A-251337934153426340736.6
816A-455420340794138414066.1
816A-469392137863790383253.7
816A-675354637513602363345.7
816A-782450144734595452381.4
816A掘401943264377424170.1
由表2可以看出，經復篩后，菌株816A-782產林可霉素的能力有明顯的提 高，產量較原來出發菌株搖瓶發酵提高了81.4%，此時的誘變條件為N+注入能 量為20keV,蛋氨酸的含量為0.8%。
2. 3高產菌株的選育與遺傳穩定試驗
在能量為20keV氮離子最佳注入參考劑量下進行多次平行離子注入誘變， 挑選林可霉素抗性菌株進行發酵測定林可霉素產量，得到多株高產菌株。將產 菌株在斜面培養基上連續傳7代，其產孢子速率基本一致。將各代菌種加液體 培養基發酵，生物測效價測定林可霉素產量。從表3中可以看到，這些菌株傳7 代，菌種發酵效價下降均不高于5%，表明遺傳穩定性較好，其中816A-782發 酵產量較出發菌株提高最多，約81.4%。表3遺傳穩定性試驗結果
傳代數搖瓶效價(u)
CK816A-142816A-455816A-782816A掘
Fl2柳 0419945614241
F224934050420045304200
F3247742"418945094199
F42500401040945184205
F523893卿412444594200
F624004000420544724179
F723893954417944234170
2. 4突變株的驗證結果
將出發菌株816A與突變株816A-782在120m3大生產發酵罐上試驗，培養 條件(壓力、溫度、通氣量、攪拌轉速等)均相同，培養時間176士3h，試驗結 果如下表4。
表4突變株816A-782的生產驗證結果
菌株發酵效價(U)提高率
123平均(%)
CK(816A)65096楊64156443
816A-782723871267191718512
從表4可以看出，在120mS生產罐上突變株816A-782的發酵效價比出發菌 株816A提高12W，效果明顯。推廣后，年提高林可霉素產量近300噸，增加產 值近億元。
3結論
本發明釆用林可霉素抗性篩選結合離子注入誘變方法，選育林可霉素產生 菌獲得較好的效果，通過多輪選育得到一株產量提高81%且遺傳性狀穩定的高產菌。并研究了不同離子注入參數對菌株存活率的影響，總結離子注人對林肯 鏈霉菌產生的生物學效應，為進一步優化離子注入參數用于選育高產林可霉素 產生菌株提供參考，使用林可霉素抗性作為篩選手段大大提高了高產菌株的選 育效率。
1權利要求
1、一種林可霉素產生菌的篩選方法，所述的篩選方法如下將冷凍保藏的沙土管接入斜面培養成熟后，作為出發菌種，刮去適量孢子經無菌水稀釋后，注入N+進行誘變處理，在含有蛋氨酸的培養基上培養，用瓊脂塊培養法進行初篩，用一級、二級發酵培養基發酵培養進行復篩，將選出的高產突變株進行遺傳穩定性試驗，即可獲得目的菌株。
2、 根據權利要求1所述的林可霉素產生菌的篩選方法，其特征在于所述誘變劑^注入劑量為5-50keV，抗性物質蛋氨酸濃度百分比為0.1-4.0%。
3、 根據權利要求1所述的林可霉素產生菌的篩選方法，其特征在于所述一級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1.0—3.0%、豆粉l.O—3.0%、蛋白胨0.3~0.7%、葡萄糖0.5—1.5%、 KN03 0.1—0.3%、 NaH2P04 0.4—1.0% 、 CaCO30.1—0.5%、余量為水，pH6—8。
4、 根據權利要求1所述的林可霉素產生菌的篩選方法，其特征在于所述二級發酵培養基是由下列重量百分比的原料制成的淀粉1.0—3.0%、葡萄糖0.5—1.5%、豆餅粉0.5—2.0%、水解蛋白0.5—1.0%、 (NH4)2S04 0.1—0.5%、 Mg2S040.05—0.2% 、 KH2P04 0.01—0.05% 、 CaC03 0.1—1.0% 、余量為水，pH6—8。
5、 根據權利要求2所述的林可霉素產生菌的篩選方法，其特征在于所述蛋氨酸的濃度百分比為0.3—3.0%。
全文摘要
本發明公開了一種林可霉素產生菌的篩選方法，該方法采用離子注入技術對林可霉素產生菌林肯鏈霉菌進行誘變與抗性篩選復合處理，使用N⁺作為離子源，研究了N⁺注入對林可霉素生產菌所產生的生物學效應，通過其自身產物林可霉素前體物抗性篩選法獲得多株遺傳穩定性較好的高產突變株，使其中突變株發酵單位比出發菌株提高了81.4％。
文檔編號C12N15/01GK101638650SQ200910065399
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月1日 優先權日2009年7月1日
發明者馮劍波, 劉海波, 張新靜, 李紅德, 鋒 王, 晴 趙, 高同偉 申請人:南陽普康藥業有限公司