專利名稱：一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。屬食品、醫藥、化工領域。
背景技術：
鞣花斷2 ， 3 ， 7 ， 82tet rahydroxybenzopyrano[ 5 ， 4 ， 3cde ]benzopyran一5 ， lO—dione)，是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的一種天然多酚組分，它是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內酯。它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花單寧、苷等)存在于自然界。純鞣花酸是一種黃色針狀晶體，熔點(妣啶)大于36(TC，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。鞣花酸分子式CmH60s，分子量為302，其結構如下
、o
近十年來，由于發現了鞣花酸的抗突變、抗癌變效應，以及對化學致癌物質的抑制作用，引起了人們廣泛的關注。鞣花酸的制備方法主要有以下幾種方法
一種是從植物中提取鞣花酸。自然界中，紅木莓、草莓、石榴以及蕨類等植物中含有少量鞣花酸(1 %)。目前，國際上約有四五家工廠在以草莓、石榴為原料，可生產出含量為5 %左右的天然鞣花酸提取物，用于食品添加劑；用此工藝可生產高純度的鞭花酸，但由于原料成本較高、且原料中鞣花酸含量的限制而實際意義不大。
一種是通過倍酸(或其酯)的氧化聚合。沒食子酸在過氧化物酶的氧化作
用下，(見Nrusingha C.Mishra and Barry Gold. Synthesis of 13c-and 14c-labrleddllagic acid[J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1990，8: 927-94)其主要產物是鞣花酸。此工藝過程中，鞣花酸的產率為20% 30%。但沒食子酸(酯)的制備過程繁瑣復雜，酶也需要精制純化，而且產物中還有一種未知的醌類物質，其與鞣花酸的比例為l : 2.4，給產品的分離純化帶來了一定的困難，目前較少用此法進行鞣花酸的生產。
微生物法生產鞣花酸是利用橡碗單寧為原料，在發酵過程中產生鞣花酸，由于鞣花酸不溶于水，發酵過程中有大量的菌絲體產生，并且這種方法反應時間長，為后續的分離純化帶來了很大的困難。也不易于得到高純度的鞣花酸。
發明內容
本發明的目的是提供一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。通過發酵獲得含降解鞣花單寧的酶的菌體，經過超聲破碎，得到粗的單寧酶，與石榴皮中提取的鞣花單寧發生酶促反應，分離純化獲得純度較高的鞣花酸。實現降低成本，廢物利用，提高鞣花酸產量和純度的目的。
本發明的以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法，通過可降解鞣花單寧的單寧酶與輮花單寧進行酶促反應，得到鞣花酸粗產品，經溶劑結晶純化獲得純鞣花酸，具體步驟和條件為
A鞣花單寧的提取
將烘干的石榴皮粉碎后，加入到體積濃度為20 60%的乙醇水溶液中，置于功率為80-100W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次25-40分鐘，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液；
B單寧酶的發酵培養
將黑曲霉Aspergillus niger3.316接種于發酵種子培養基中，25-3(TC下培
5養20-24小時，移至產酶培養基中，25-3(TC下培養4-6天，離心并用去離子 水洗滌，獲得含單寧酶的菌體，加入pH-5.0的檸檬酸緩沖液后得到菌懸液， 菌懸液于冰浴中在功率400-600W的超聲波作用下進行20-30分鐘超聲破碎， 得到粗的單寧酶；
C酶促轉化反應
將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至原來體積的1-2倍，用 NaOH水溶液調節pH至5.0-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液 與稀釋后的鞣花單寧溶液的體積比為1: 2-3， 25-3(TC下酶促轉化反應40-48 小時，反應液經過濾，得到粗鞣花酸產品；
D溶劑結晶純化
將步驟C得到的鞣花酸粗產品加入甲醇，在70 80。C溫度下萃取3 9 小時后，將萃取液濃縮至飽和，降至室溫結晶，反應液過濾后，濾餅經水洗、 干燥，得到淡黃色鞣花酸產品，純度為95%以上。
所述的發酵培養基的組成和含量是NaN03 1.5-2.5 g/1 ， K2HP04 0.5-1.5g/l， MgS04-7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， FeS04 0,008-0.015 g/l， 蔗糖25-35 g/l，其余為水。
所述的產酶培養基的組成和含量為鞣花單寧10-16g/l，KH2PO40.5-1.5 g/l， K2HPO40.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KC1 0.4-0.8 g/l， MgS04'7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，乳糖5-15g/1，吐溫-80 1.5-3ml/l，用NaOH水溶液調節 pH值為4-4.5。
為了提高產品的純度在步驟D的溶劑結晶純化中，萃取分二至三次完成， 每次1 3小時。
本發明的方法實質是利用酶的催化效率高，選擇性強，作用條件溫和等 特點，通過發酵并提取可降解鞣花單寧的單寧酶后，與鞣花單寧發生酶促反 應生成鞣花酸，經分離純化后獲得高純度的鞣花酸。
本發明的優點是工藝簡單，制備過程綠色化，三廢排放少，適合大規模的生產，產品品質好。我國是石榴種植大國，其果皮除被部分用于中藥材 以外，大部分都被人們拋棄，造成了很大的浪費。本發明以石榴皮為原料， 原材料成本低，可提高農產品的附加值。本發明采用酶法生產鞣花酸，由于 酶的反應條件溫和，無需高溫，高壓等操作，改善了生產環境，大大節約化 學物質的消耗量，且三廢污染小，容易治理。采用酶促反應，其特異性高， 專一性的降解鞣花單寧中的酯鍵，具有轉化效率高、反應時間短，副產物少 的特點。
具體實施例方式
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為40%的乙醇的 水溶液中，于功率80W的超聲波作用下，超聲處理25分鐘，取出收集濾液， 剩余的殘渣再重復上述超聲處理二次，得到的鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮 回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液240L。 B單寧酶的發酵培養
發酵種子培養基的組份和含量為NaN03 2 g/l， K2HP04 lg/1 ， MgS04.7H20 0.6 g/l， KC10.6g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖30g/l，其余為水。滅 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在30。C， 165rpm下搖床培養 24小時，以5%接種量移至產酶培養基中，產酶培養基的組份和質量含量 鞣花單寧I6g/1， KH2P04 1 g/l， K2HP04 1 g/l， NaN03 2 g/l， KC1 0.6 g/l， MgS04'7H20 0.6g/l， FeS04 0.01 g/l，乳糖10g/l，吐溫-80 2ml，用5mol/L 的NaOH溶液調節pH值為4。在28。C， 165rpm下搖床培養4天，離心并用 去離子水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入 0.01mol/L檸檬酸緩沖液(pH=5.0)后得到菌懸液，菌懸液于400w的功率下 于冰浴中進行破碎，破碎時間為30分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉化反應將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至350L，用5mol/L的NaOH 調節pH:5.2，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 3。在3(TC， 90rpm下用搖床轉化反應48小時。反應液 經過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結晶
將得到的粗產品用甲醇75t:萃取，萃取次數為3次，每次1小時，固液 分離，合并液體，蒸發濃縮，冷卻結晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末。原料含鞣花單寧為10.13%，得率為原料的4.1% ，純度為96.5%。
實施例2:
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為60%的乙醇水 溶液中，功率100W的超聲波作用下，超聲處理30分鐘，取出收集濾液，剩 余的殘渣再重復上述超聲處理二次，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收 乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液200L。 B單寧酶的發酵培養
所述的發酵種子培養基的組份和含量為NaN03 1.5g/l， K2HP04 0.5g/l， MgSO4.7H2O0.5g/l， KC10.5g/1， FeS04 0.01 g/l，蔗糖25 g/l，其余為水。滅 菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在28。C， 165rpm下搖床培養 22小時，以5%接種量移至產酶培養基中，產酶培養基的組份和含量鞣花 單寧10g/l， KH2PO40,5g/l， K2HPO40.5g/l， NaN03 1.5 g/l， KC1 0.4 g/l， MgSO4.7H2O0.4g/l， FeS04 0.008 g/l，乳糖5g/l，吐溫-80 3ml/l，用5mol/L的 NaOH調節pH值為4.3。在28。C， 165rpm下搖床培養6天，離心并用生理 鹽水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入O.lmol/L 檸檬酸緩沖液后(pH=5.0)得到菌懸液，菌懸液于500W的功率下于冰浴中 進行破碎，破碎時間為25分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉化反應
8將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至300L,用5mol/L的NaOH 調節pH-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 2.5。在28r， 100rpm下用搖床轉化反應40小時。反應 液經過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結晶
將得到的粗產品用甲醇75'C萃取，萃取次數為2次，每次2小時，固液 分離，合并液體，蒸發濃縮，冷卻結晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末，原料含鞣花單寧為11.5%，得率為原料的4.3%，純度為98%。
實施例3:
A鞣花單寧的提取
將烘干的80千克石榴皮粉碎后，加入到600L體積濃度為50%的乙醇水 溶液中，于功率90W的超聲波作用下，超聲處理40分鐘，取出收集濾液， 剩余的殘渣再重復上述超聲處理一次，得到的單寧酸的乙醇水溶液濃縮回收 乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液200L。 B單寧酶的發酵培養
發酵種子培養基的組份和含量為NaN03 2.5 g/l， K2HP041.5g/l， MgS04.7H20 0.8g/l， KCL0.8g/1， FeSO40.015g/l，蔗糖35 g/l， 其余為水。 滅菌后，立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316，在25。C， 165rpm下搖床培 養24小時，以5%接種量移至產酶培養基中，產酶培養基的組份和含量:鞣花 單寧13g/l， KH2P04 1.5g/l， K2HP04 1.5 g/l， NaN032.5 g/l， KC1 0.8 g/l， MgSO4.7H2O0.8g/l， FeSO40.015g/l，乳糖15g/l，吐》顯-80 1.5ml/l，用5mol/L 的NaOH調節pH值為4.5。在25。C， 165rpm下搖床培養5天，離心并用生 理鹽水洗滌至洗出液為pH=7，收集菌體，按每克濕菌體5ml的比例加入 0.05mol/L擰檬酸緩沖液(pH=5.0)后得到菌懸液，菌懸液于600W的功率下 于冰浴中進行破碎，破碎時間為20分鐘，離心，得到的上清液為粗酶液。 C轉化反應
9將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至400L，用5mol/L的NaOH 調節pH-5.0，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧 溶液的體積比為l: 2。在25'C， 110rpm下用搖床轉化反應44小時。反應液 經過濾，得到粗鞣花酸。 D溶劑結晶
將得到的粗產品用甲醇75。C萃取，萃取次數為3次，每次2小時，固液 分離，合并液體，蒸發濃縮，冷卻結晶，過濾晶體，干燥，得到淡黃色鞣花 酸粉末，原料含鞣花單寧為9.1%，得率為原料的3.9%，純度為98.8%。
權利要求
1. 一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法，通過單寧酶與鞣花單寧的酶促反應，得到鞣花酸粗產品，經溶劑結晶純化獲得純鞣花酸，具體步驟和條件為A鞣花單寧的提取將烘干的石榴皮粉碎后，加入到體積濃度為20～60％的乙醇水溶液中，置于功率為80-100W的超聲波作用下超聲處理2-3次，每次25-40分鐘，得到鞣花單寧的乙醇水溶液，濃縮回收乙醇后，得到鞣花單寧濃縮液；B單寧酶的發酵培養將黑曲霉Aspergillus niger3.316接種于發酵培養基中，25-30℃下培養20-24小時，移至產酶培養基中，在25-30℃下培養4-6天，離心并用去離子水洗滌，獲得含單寧酶的菌體，加入pH＝5.0的檸檬酸緩沖液得到菌懸液，菌懸液于冰浴中在功率400-600W的超聲波作用下進行超聲破碎，破碎時間為20-30分鐘，得到單寧酶的粗酶液；C酶促轉化反應將步驟A得到的鞣花單寧濃縮液，加水稀釋至原來體積的1-2倍，用NaOH水溶液調節pH至5.0-5.5，將步驟B得到的粗酶液加入其中，粗酶液與稀釋后的鞣花單寧溶液的體積比為1∶2-3，在25-30℃下酶促轉化反應40-48小時，反應液經過濾，得到鞣花酸粗產品；D溶劑結晶純化將步驟C得到的鞣花酸粗產品加入甲醇，在70～80℃溫度下萃取3～9小時后，將萃取液濃縮至飽和，降至室溫結晶，反應液過濾后，濾餅經水洗、干燥，得到淡黃色鞣花酸產品。
2.根據權利要求1的方法，其特征是發酵種子培養基的組成和含量 是NaN03 1.5-2.5 g/l， K2HP04 0.5畫1.5g/1， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， KC1 0.4-0.8g/l， FeS04 0.008-0.015 g/1 ，蔗糖25-35 g/1 ，其余為水。
3. 根據權利要求1的方法，其特征是產酶培養基的組成和含量為鞣花單寧10-16g/l， KH2P04 0.5-1.5 g/l， K2HP04 0.5-1.5g/l， NaN031.5-2.5 g/l， KCI 0.4-0.8 g/l， MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l， FeS04 0.008-0.015 g/l，乳糖5畫15g/1， 吐溫-80 1.5-3ml/l,用NaOH水溶液調節pH值為4-4.5。
4. 根據權利要求l的方法，其特征是步驟D的溶劑結晶純化中，萃 取分二至三次完成，每次1 3小時。
全文摘要
本發明涉及一種以石榴皮為原料酶法制備鞣花酸的方法。屬食品、醫藥、化工領域。本發明以我國大量被人們廢棄的石榴皮為原料提取鞣花單寧，利用酶的催化效率高，選擇性強，作用條件溫和等特點，通過發酵，獲得含降解鞣花單寧的單寧酶，與鞣花單寧發生酶促反應，生成鞣花酸，經過溶劑結晶純化，獲得價格昂貴的醫用高純度的鞣花酸。本發明可降低原料成本，廢物利用，并提高鞣花酸產量和純度，適合大規模的生產。
文檔編號C12P17/18GK101481714SQ20081005600
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月11日 優先權日2008年1月11日
發明者倩 張, 艷 程, 袁其朋 申請人:北京化工大學