專利名稱：F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及腮腺炎減毒活疫苗，更具體地說，本發明涉及將腮腺炎患兒 咽漱液標本中分離出腮腺炎病毒，適應于人二倍體細胞(KMB17株)并進行蝕 斑克隆及減毒傳代，得到的腮腺炎減毒毒種。同時，本發明還涉及該毒種的 用途。
背景技術：
腮腺炎病毒(mumpsvirus,MuV)是引起流行性腮腺炎.的病原體。腮腺 炎病毒屬于副黏病毒科，基因組為不分節段的單負鏈核糖核酸(RNA)，含有 大約15500個核苷酸，在兩端序列之間按3' -NP-P-M-F-SH-HN-L-5'.的順序 排列著編碼7種病毒蛋白的基因。其中，SH基因的變異程度是最大的，因此 一般選用SH基因作為分型依據。依據SH抗原上核苷酸的差異，腮腺炎病 毒可分為A-L共12個基因型。我國作為一個大量使用腮腺炎減毒活疫苗的地區，其疫苗毒株除來自 國外的成品苗外，主要使用囯際通用Jeryl-Lynn株培育得到的S79株。因而 病毒基因型均屬于國外流行的A基因型。隨著近年來國內在腮腺炎流行毒株 方面的分子流行病學分析的深入，曰益增加的資料均表明，目前在我囯流行 的腮腺炎病毒株主要為F基因型。國內外的研究資料均表明，雖然不同基因 型的腮腺炎減毒活疫苗可針對其它基因型別的腮腺炎病毒產生交叉性抗原 護作用，但這種基因型之間的抗原交叉性是有限的，有時即可表現為不能抵 抗其它基因型別病毒的感染，從而再次感染腮腺炎病毒。同時，在許多針對 該疫苗使用后副反應的分析資料及該病毒的流行病學資料亦提示，某些毒株 和基因型具有神經毒性，例如，已報道的資料表明C、 D、 G、 H、 I、 J基因型具有明確的神經毒性，但F基因型至今尚無報道涉及其神經毒性。因此，從 這兩個意義上看，針對我國目前腮腺炎流行發病率仍然屬于丙類傳染病前列的實際情況，分離及研究開發具有主要流行傾向并具有較好免疫原性的F基因型減毒疫苗毒株，具有重要的現實意義。其次，目前常規使用的S79株及Jeryl - Lynn株減毒活疫苗均為雞胚細胞 上制備，在使用過程中，有引起由于異源性細胞基質所帶來過敏反應等副作 用的可能。同樣，無論從理論上還是應用上看，使用人源性細胞基質(人二 倍體細胞)進行適應性傳代培養生長而制備的腮腺炎減毒毒種，可以避免釆 用雞胚細胞作為細胞基質可能帶來的危害，將具有更實際的應用價值。發明內容本發明的目的是針對目前使用的腮腺炎減毒活疫苗基因型(A基因型) 與流行株基因型(F基因型)不相匹配的不足之處，提供一種F基因型腮腺 炎減毒毒種。本發明的目的通過以下技術方案予以實現。在對國內多年腮腺炎流行毒株分析的工作基礎之上，收集了發生在云南 省紅河州石屏縣牛街鎮他臘希望小學學生群體中的腮腺炎流行的患兒咽漱 液，利用常規的病毒分離培養方法，采用Vero細胞從腮腺炎患兒咽漱液標 本中分離腮腺炎病毒，經常規RT-PCR方法全基因測序后，明確其為當前 流行基因型一一F基因型。之后將該分離毒種按常規方法適應于人二倍體細 胞(KMB17株)并進行蝕斑克隆及減毒傳代，得到F基因型腮腺炎減毒毒 種一一SP-A株。并按國家及WHO相關規程要求對其進行了全面的檢定， 明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的安全性，并且具有優于普通腮腺 炎減毒毒種的免疫效力。適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發。本發明還提供了上述F基因型腮腺炎減毒毒種一一SP-A株的基因序 列，該序列具有序列表所述的核苷酸序列。
圖1是分離毒株基因序列的系統分析。圖2是所述的第4代以后的病毒已適應于KMBn細胞，接種5 - 6天后 出現典型病變效果的圖。其中，A為分離毒株在KMB—17細胞上的病變情 況，B為KMB—17細胞對照。圖3是不同代次，不同免疫劑量病毒免疫后的中和抗體反應情況。
具體實施方式
在下面的實施例中，將結合附圖對本發明作具體詳細的描述，但這并不 是對本發明保護范圍的限制。*除非另有說明，本發明中所釆用的百分數均為重量百分數。 實施例1一一咽漱液標本的采集在患者感染的7 ~ 14天之內，使用咽拭子收取腮腺炎患者口腔頰壁粘膜 的分泌物及咽漱液，懸于pH7.2無菌磷酸鹽溶液中。將該收集物經4'C保存 運輸，在24小時內保證其存活；若置于-20'C，可保持病毒在3個月內存活。 *本發明所描述的腮腺炎病毒的分離方法為常規傳統的腮腺炎病毒分 離方法，可適用于任意腮腺炎患者的病毒分離，為常用的經典病毒分離方法。 從任意一例腮腺炎患者中均可分離到腮腺炎病毒，所屬基因型可能不同，但 由于國內流行基因型為F型，因而分離到的腮腺炎病毒應以F基因型為主。所有分離到的任意腮腺炎病毒基因型都具有如下生物學特征a.在被感染者出現癥狀的7-14天之內，腮腺炎病毒均在患者的口腔大量存在。因此使用咽拭子收取口腔頰壁粘膜的分泌物(懸于無菌磷酸鹽溶液(pH7.2)中)及口腔漱液(其為磷酸鹽平衡液(PHL2))均可獲取。同時， 該收集物經4。C保存運輸，在24小時內保證存活；若置于-20'C，可保持病 毒在3個月內存活。b.各種基因型的腮腺炎病毒在從患者口腔分離后，按上述方法保存移至 實驗室，經過孔徑為0.2jLim的除菌濾器除菌后，均可用于細胞培養物上增 殖。所有基因型的腮腺炎病毒均具有在Vero細胞、人胚肺細胞等細胞上適 應生長的生物學特性，并可以在這些細胞上穩定傳代生長。 一般經3-5代 的傳代生長，即可達到105°CCID50/ml的產量。并通常在接種量達 1(TCCID50/ml/25cm2細胞生長物時，可在7-8天之內出現典型的細胞病變(表現為細胞變圓、折光性增強、腫脹、壞死等)。 實施例2一一采用Vero細胞分離培養腮腺炎病毒 將收集的腮腺炎患者咽漱液經過孔徑為0.2 Mm的除菌濾器除菌后，接 種于Vero細胞。具體操作如下采用0.25。/。胰酶-0.01。/。EDTA消化已形成單 層的P148代Vero細胞，待細胞經消化形成單個后，以DMEM-8%BCS重懸 細胞，稀釋至1()S。細胞/ml。按"10"細胞/瓶接種小方瓶，37。C培養3-4天 后，將腮腺炎患兒咽漱液接種于細胞單層，37。C吸附30分鐘，隨后加入含1。/。小牛血清的DMEM培養液，3:rc培養并觀察細胞病變(表現為細胞變圓、折光性增強、腫脹、壞死等)。至7 ~ 8天出現細胞病變后，收獲培養物后繼續同法接種Vera細胞傳代 至第5代。微量滴定表明，在1 5代病毒傳代過程中，病毒的滴度范圍在4.2-5.21ogCCID5。之間。呈上升趨勢。 實施例3一一病毒全基因測序確定基因型采用常規RT-PCR方法進行逆轉錄、CDNA質粒構建。具體方法如下 Vero細胞上培養的第2代病毒基因組的核酸按Qiagen標準試劑盒說明書進 行。病毒基因RNA逆轉錄使用華美公司RT-PCR試劑盒，按說明書操作。 并根據腮腺炎病毒基因序列設計合成19個交叉片段的引物，并分段以 RT-PCR方法獲得19個CDNA基因片段，克隆入PMD18-T載體中，并逐一測 序。得到所分離毒株的全基因序列(基因庫登錄號為DQ649478)(見圖-1 )。 之后使用VectorNT16.0軟件對所分離腮腺炎病毒的SH基因及旁側核苷酸 序列進行分析，并與囯內上海地區分離株(Wshl和Wsh2基因登錄號分別 為Z77160和Z81005 )、蘭州地區分離株(Wlzl、 Wlz2、 Wlz3基因登錄號分 別為Z77158， Z77161, Z77159 )和英國分離株(UK99-102 x 13、 UK99-190 基因登錄號分別為AY380065、 AY380068 )的序列作同源性分析。其結果明 確顯示，所分離毒株與上述這些分離株均屬于F基因型，如圖1所示，為國 內流行基因型。實施例4一一病毒在KMB，7細胞上的適應傳代將上述第5代的腮腺炎病毒收獲物接種于KMB,7細胞。采用0.25%胰酶 -O. 01%EDTA消化已形成單層的廳17細胞，并以DMEM-8%BCS重懸細胞，按 106。細胞/小方瓶接種，37'C靜止培養至形成致密細胞單層后，接種原Vero 細胞收獲的病毒液lml (約為103-104CCID50/ml), 37。C繼續培養。首代僅在8-10天后出現少量不明顯的細胞變圓情況，待至第4代以后，病毒已適應 于KMBn細胞，接種5-6天后即可出現典型病變(見圖-2)。其感染性滴度 為5. 0 1ogCCID5o/ml左右。 實施例5一一病毒的克隆純化在KMB^細胞上已適應傳代到第5代的腮腺炎病毒收獲液，稀釋至10—3、 10—4、 10—5三個稀釋度，接種于已形成單層的KMBn細胞(六孔板)，37。C吸附 30分鐘，加入DMEM-1。/。BCS， 48小時后去除培養液，加入含0.8%瓊脂-DMEM,待瓊脂固化后，反置培養于37匸。3天后于鏡下觀察蝕斑形成情況， 并標記相應區域后，用巴氏管吸取蝕斑塊，置于1. 5ml離心管中，加入0. 5ml DMEM培養液，吹打使瓊脂塊破碎后，隨即接種于KMBn細胞單層細胞(24孔 板)，37°C培養7-8天。待細胞完全病變后，收獲病毒，同法再行一次純化 過程，收獲病毒繼續接種于KMBn生長傳代。實施例6一一減毒毒種的制備將上述克隆純化后的病毒繼續在扁17細胞上連續傳代至30代。從而得 到適應于KMB17細胞生長的F基因型腮腺炎減毒毒種，命名為SP-A株。 隨后對相關代次的病毒收獲物按常規方法進行減毒性狀、免疫原性、安全性 的全面分析，并與現行使用的A基因型腮腺炎減毒活疫苗進行比較。實施例7一一病毒減毒性狀觀察選取減毒適應傳代至15、 20、 30代病毒進行致腮腺炎發病能力的觀察分析。各代次病毒按4.51ogCCID50/100ul/側劑量直接注射恒河猴腮腺，每 代次實驗組用猴2只。同時，使用該病毒在Vero細胞上擴增至第二代的病 毒做為野毒株對照。注射病毒后，逐曰觀察動物體溫，臨床體征等情況，并 于第11天時，活體取動物腮腺組織進行病理檢查。結果可見，Vero細胞上的第二代病毒組在進行了腮腺致病性實驗之后， 實驗動物出現了體溫升高， 一般狀況較差，腮腺腫大等腮腺炎病毒感染相關 的臨床癥狀體征，并且腮腺病理檢查也表現為淋巴細胞大量浸潤，體現了腮 腺炎病毒感染的指征。15、 20、 30代三個代次實驗組在進行了腮腺致病性實 驗之后，實驗動物體溫、 一般狀況均無異常，也無腮腺腫大癥狀，腮腺病理 檢查表現為每組各有一只實驗猴一側腮腺腺泡間見少量淋巴細胞浸潤，余無 異常，這應為注射刺激后的局部反應；綜合以上實驗資料可見，SP-A株傳 代至第15代次，病毒已無致腮腺炎發病能力。實施例8——不同代次減毒株免疫原性分析選取第20、25、 30代的病毒收獲物，每代次設置3.5、4.5、 5.51ogCCID50/ml 三個劑量，每個劑量皮下注射3只恒河猴(體重3kg土0.5kg,年齡2-3歲， 公母各半)，同時使用麻-腮聯合疫苗(購自北京所，其腮腺炎疫苗滴度按 規程為> 4.2 1ogCCID50 )做為陽性對照，注射同樣恒河猴2只，陰性對照3 只注射DMEM0.5ml。免疫后2、 4、 8、 12周取血分離血清進行中和抗體測 定以確定體液免疫效應，如圖3所示。結果表明，第20代及第25代組的中 和效價優于第30代組及麻-腮疫苗組，即具有比現行的A基因型雞胚細胞 生產的腮腺炎減毒活疫苗更好的免疫效果。篩選腮腺炎抗體陰性的恒河猴進行免疫原性分析，于免疫后2、 4、 8周取血分離血清進行中和抗體效價的檢測。圖中數值均為GMT土SD。如圖3 所示各組動物的中和抗體效價均隨著免疫后時間的延長而呈增高趨勢；在 3個代次的實驗組及麻-腮疫苗組中，第20代及第25代組的中和效價優于 第30代組及麻-腮疫苗組；而在每個代次組的3個劑量組中，均表現為隨 著劑量的增高，中和抗體效價亦呈增高趨勢。 實施例9——病毒安全性分析釆用猴體神經毒力方法，選取第20及25代病毒收獲物，微量法測定病 毒滴度后，按5.21ogCCID50/0.5ml/側劑量腦內注射恒河猴，每只猴分注射 左右側注射，每代次病毒使用IO只恒河猴，陰性對照組2只恒河猴，按生 物制品規程要求進行搡作。注射后逐日觀察實驗猴神經反射體征。取腦各部 位組織、進行病理檢查。檢查內容主要針對炎細胞分布情況和神經元有否損 傷。結果可見，全部實驗猴均無麻痹、嗜睡、昏迷、驚厥、上下肢震顫等神 經系統癥狀。腦部各組織病理檢查也無神經細胞損傷。因而，SP-A毒株不 具有損傷神經細胞的毒力效應，為安全有效的腮腺炎減毒毒株。實施例10一一病毒基因序列比較將KMBn細胞上的25代、Vero細胞上的第2代分離病毒的SH基因及其 旁側序列進行比較，結果見表l 。雖然至今為止，尚無相關文獻報道可由明 確的基因序列變化決定腮腺炎病毒的減毒代次。但從序列比較結果而言，還是可見有5個位點發生了基因序列的改變。因而本實驗與以上三個實驗(病 毒減毒性狀觀察、不同代次減毒株免疫原性分析、病毒安全性分析)共同作 為驗證腮腺炎減毒毒種的指征。表l.腮腺炎病毒基因序列比較SH基因病毒代次61806297637064156483Vero2代TAGCGKMB17 25代AGATA實施例11一一三級種子代次的確定和種子庫的建立根據《中國藥典》三部通則"生物制品生產和檢定用菌毒種管理規程"要求，將在KMB^細胞上克隆純化后，并繼續傳代至第18代的腮腺炎病毒做 為F基因型腮腺炎減毒活疫苗原始毒種，名為SP-A株。第20代病毒做為 主種子庫，第24代病毒做為工作種子分別建庫。三級種子庫均按《腮腺炎 減毒活疫苗(SP-A株)制造及檢定規程》(草案)的要求進行全面檢定，凍 存于-7(TC冰箱。優勢比較結果如表2所示。表2.優勢比較:流行基因型細胞基質免疫原性安全性SP-A株是(F基因型)人二倍體細胞優安全現行使用株否(A基因型)雞胚細胞(異源性)良安全根據《中國藥典》的要求檢測明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的 安全性，并且其具有優于優于目前國內使用的腮腺炎減毒毒種的免疫效力， 適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發的新型毒種。序列表 SEQUENCE LISTING<110>中國醫學科學院醫學生物學研究所<120> F基因型腮腺炎減毒毒種SP-A株SH基因及旁側序列<130> 1<140> 20071227 <141> 2007-12-27<160> 1< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 455<212> DNA<213> Mumps virus<400> 1tcaacacaat atcaagtagt gtcgatgatc tcatcaggta ctaatcctaa cattgtgatt 60cttcctacat tgagaaaaga tttagaaaaa aaccaaatta agaatgaagc tcctggggtc 120gtaacgtctc gtgaccctgc cgttgcacta tgccggcaat ccaccctccc ttctacctaa 180 catttctatt gctaattctt cttcatctga tcataacttt gtatgtctgg attatgttaa 240ccattactca cgagactgcg gtgcaacatg cagcattgta ccagagatcc ctctttcgtt 300ggagtttcga tcactcactc tagaacgatc tccaacccgg acaagtccca atccatcatg 360 ggaggacaag ctgcattcaa atgatgctgc tcaatcatga gacataaaga aaaaagcagg 420 ccagaacaaa ctcaggatca caatacaaca cagaa 45權利要求
1.一種F基因型腮腺炎減毒毒種，其特征在于該毒種具有序列表所述的核苷酸序列。
2. 權利要求1所述的F基因型腮腺炎減毒毒種在制備腮腺炎減毒疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途。本發明收集腮腺炎流行地區的患兒咽漱液，利用常規的病毒分離培養方法，采用Vero細胞從腮腺炎患兒咽漱液標本中分離腮腺炎病毒，經常規RT-PCR方法全基因測序后，明確其為當前流行基因型——F基因型之后，將該分離毒種按常規方法適應于人二倍體細胞(KMB17株)并進行蝕斑克隆及減毒傳代，得到F基因型腮腺炎減毒毒種——SP-A株。并按國家及WHO相關規程要求對其進行了全面的檢定，明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的安全性，并且具有優于普通腮腺炎減毒毒種的免疫效力。適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發。
文檔編號C12N7/04GK101215552SQ20081005803
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月16日 優先權日2008年1月16日
發明者劉龍丁, 史長軍, 崔平芳, 李琦涵, 燕 梁, 王麗春, 董承紅, 謝忠平, 馬紹輝 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所