專利名稱：一種細菌的莢膜染色方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌的莢膜染色方法，采用獨特染色方法進行細菌莢膜染色，針對微生物實驗和醫學檢測中細菌莢膜形態觀察的樣本制作。
背景技術：
莢膜是包圍在細菌細胞外的一層粘液狀或膠質狀物質，部分的由細胞質內合成，主要成分是多糖，這些多糖的分子組成和構型多樣，令其結構極為復雜，成為血清學分型的基礎。例如肺炎雙球菌，根據其莢膜多糖的抗原性，至少可將其分成85個血清型。有少許菌種是多肽類，如炭疽芽胞桿菌、鼠疫桿菌等。莢膜的主要作用是 ①抗吞噬作用莢膜因其親水性及其空間占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬細胞的吞噬作用。
②粘附作用莢膜多糖可使細菌彼此間粘鏈，也可粘附于組織細胞或無生命物體表面，是引起感染的重要因素。
③抗有害物質的損傷作用處于細菌細胞最外層，莢膜猶如盔甲可有效保護菌體免受或少受多種殺菌、抑菌物質的損傷，如溶菌酶、補體等。
④抗干燥作用莢膜多糖為高度水合分子，含水量在90％以上，可幫助細菌抵抗干燥對生存的威脅。
⑤是重要的能源貯藏庫，在缺少能源時，將莢膜分解為碳源和能源而被利用。
莢膜在實驗和醫學中有重要的作用，主要用于因莢膜抗原不同分血清型，鑒別細菌，制備疫苗。也是大學微生物實驗必需完成的一個實驗。所以莢膜的染色形態觀察非常重要。
由于莢膜與染料的親和力弱，不容易著色；而且可溶于水，易在用水沖洗時被除去。所以通常用襯托染色法(負染色法)染色，即將菌體和背景著色而把不易染色的且透明的莢膜襯托出來。由于莢膜富含水分，很薄，制片時應自然干燥，通常不用加熱固定法，避免加熱蒸發，影響觀察。有時可用甲醇固定目前常用的檢測方法有如下四種 1.負染色法(諸葛鍵，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，中國輕工業出版社，1994，72) (1)滴一滴印度墨水或黑素液與干凈的載玻一側； (2)接種環取菌液一環，與染色液混合均勻； (3)取另一塊干凈的載玻片將混合物自載玻片一側平掛至另一側，又平掛回來，使形成一薄層，在空氣中干燥； (4)加蕃紅液蓋于載玻片上30秒，然后用水洗去； (5)用吸水紙吸干載玻片底部十分，干燥。
(6)鏡檢 2.濕墨水法 (1)制菌液加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻； (2)加蓋玻片放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液； (3)鏡檢結果背景灰色，菌體較暗，莢膜呈現明亮的透明圈。
3.干墨水法 (1)制菌液加1滴6％葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質芽胞桿菌與其充分混合，再加1環墨水，充分混勻； (2)制片左手執玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜； (3)干燥空氣中自然干燥； (4)固定用甲醇浸沒涂片，固定1min，立即傾去甲醇； (5)干燥在酒精燈上方，用文火干燥； (6)染色用甲基紫染1-2min； (7)水洗用自來水輕洗，自然干燥； (8)鏡檢。結果背景灰色，菌體紫色，莢膜呈透明圈。
4.Tyler法 (1)涂片按常規法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大； (2)干燥在空氣中自然干燥； (3)染色用Tyler染色液染5～7min； (4)脫色用20％CuSO4水溶液洗去結晶紫，脫色要適度(沖洗2遍)。用吸水紙吸干，并立即加1～2滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結晶的形成； (5)鏡檢觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。結果背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。
采用傳統的負染色(襯托染色法)以及其他一些方法存在一些缺點。首先對實驗員的操作技能要求很高，容易導致實驗失敗。黑墨水法背景很黑，要讓單個菌體透明展示，需要刮成微米級厚度，制片時的有效區域很小，新手難以勝任。其二是采用黑墨水法等傳統負染色法制作的標本往往只能看到少數幾個菌體，且需要在顯微鏡下大范圍尋找。另外，細菌莢膜易降解消失，由于實驗菌最佳培養時間的偏離和個體菌齡的差異，即使實驗菌有莢膜，通常也不會每個菌體同時展示完整莢膜。因此，傳統的負染色法難以確定實驗菌是否有莢膜，尤其對于未知菌種。
發明內容
本發明的目的是針對傳統方法的缺陷，找到一種簡單、高效，成像清晰美觀的細菌的莢膜染色方法。
細菌莢膜染色方法包括如下步驟 1)在載玻片上滴一小滴無菌水； 2)細菌培養24～48小時，用接種環挑取菌，水濕潤狀態下，在玻片上自中心向外做螺旋狀緩慢載涂布，以保持莢膜完整； 3)自然風干或用電風吹冷風吹干； 4)滴加純甲醇2～3滴，固定1～2分鐘，傾斜倒掉甲醇； 5)滴加石碳酸復紅染色1～3分鐘，蓋上蓋玻片； 6)用吸水紙吸除蓋玻片周圍液體，并將載玻片傾斜，用吸水紙吸除蓋玻片下的部分染色液。
本發明通過對制片方法、染色方法、操作步驟的改進，有效地保持了細菌莢膜的完整性，能清晰地展示樣本中所有菌體的莢膜生長狀態，顯著降低了莢膜染色的操作難度，提高了對細菌莢膜識別的可靠性。從實施例中可以看出，背景染成明亮的淡紅色，細菌莢膜輪廓以及菌體均十分清晰。所以本發明是一種簡單、高效的細菌莢膜染色方法。
圖1是本發明在無菌水滴中由內到外緩慢的螺旋狀涂開的示意圖； 圖2(a)是本發明的鉀細菌莢膜染色在油鏡下的觀察圖； 圖2(b)是本發明的鉀細菌莢膜染色在油鏡下的觀察圖； 圖2(c)是本發明的鉀細菌莢膜染色在油鏡下觀察圖。
具體實施例方式 細菌莢膜染色方法包括如下步驟 1)在載玻片上滴一小滴無菌水(應盡可能少些)； 2)細菌培養24～48小時，已長出白色透明狀的膠體，用接種環挑取菌，挑取時可以旋轉接種環幾圈，以便挑取足量的帶莢膜的膠體，水濕潤狀態下，在玻片上自中心向外做螺旋狀緩慢載涂布，以保持莢膜完整，如圖1所示； 3)自然風干或用電風吹冷風吹干； 4)滴加純甲醇2～3滴，固定1～2分鐘，傾斜倒掉甲醇； 5)滴加石碳酸復紅(濃度為常規濃度的1/2～2/3)染色1～3分鐘，蓋上蓋玻片； 6)小心地用吸水紙吸除蓋玻片周圍液體，并將載玻片傾斜，用吸水紙吸除蓋玻片下的部分染色液，，以增加蓋玻片附著力和鏡檢時樣本透光度； 7)油鏡鏡檢。
實施例1 1)在載玻片上滴一小滴無菌水； 2)制片用接種環取少許培養了24小時的細菌，并在水濕潤狀態下自中心向外作螺旋狀緩慢涂布，以保持莢膜完整； 3)自然風干； 4)滴加純甲醇一滴，固定1分鐘，傾斜倒掉甲醇； 5)滴加數滴石碳酸復紅染色1分鐘； 6)加蓋玻片； 7)小心地用吸水紙將蓋玻片周圍多余液體吸掉，并將玻片傾斜后吸去部分蓋玻片下的染色液，以增加蓋玻片附著力和鏡檢時樣本透光度； 8)油鏡鏡檢。
觀察結果如附圖2(a)所示，背景紅色，莢膜無色。
實施例2 1)在載玻片上滴一小滴無菌水； 2)制片用接種環取少許培養了48小時的菌，并在水濕潤狀態下自中心向外作螺旋狀緩慢涂布，以保持莢膜完整； 3)自然風干； 4)用純甲醇固定2分鐘，傾斜倒掉甲醇； 5)滴加數滴石碳酸復紅染色3分鐘； 6)加蓋玻片； 7)小心地用吸水紙將蓋玻片周圍多余液體吸掉，并將玻片傾斜后吸去部分蓋玻片下的染色液，以增加蓋玻片附著力和鏡檢時樣本透光度； 8)油鏡鏡檢。觀察結果如附圖2(b)所示，背景紅色，莢膜無色。
實施例3 1)在載玻片上滴一小滴無菌水； 2)制片用接種環取少許培養了36小時的菌，并在水濕潤狀態下自中心向外作螺旋狀緩慢涂布，以保持莢膜完整； 3)自然風干； 4)滴加純甲醇2滴，固定1分鐘，傾斜倒掉甲醇； 5)滴加數滴石碳酸復紅染色2分鐘 6)加蓋玻片； 7)小心地用吸水紙將蓋玻片周圍多余液體吸掉，并將玻片傾斜后吸去部分蓋玻片下的染色液，以增加蓋玻片附著力和鏡檢時樣本透光度； 8)油鏡鏡檢。觀察結果如附圖2(c)所示，背景紅色，莢膜無色。
權利要求
1.一種細菌莢膜染色方法，其特征在于包括如下步驟
1)在載玻片上滴一小滴無菌水；
2)細菌培養24～48小時，用接種環挑取菌，水濕潤狀態下，在玻片上自中心向外做螺旋狀緩慢載涂布，以保持莢膜完整；
3)自然風干或用電風吹冷風吹干；
4)滴加純甲醇2～3滴，固定1～2分鐘，傾斜倒掉甲醇；
5)滴加石碳酸復紅染色1～3分鐘，蓋上蓋玻片；
6)用吸水紙吸除蓋玻片周圍液體，并將載玻片傾斜，用吸水紙吸除蓋玻片下的部分染色液。
全文摘要
本發明涉及一種細菌莢膜染色方法。包括如下步驟1)在載玻片上滴一小滴無菌水；2)細菌培養24～48小時，用接種環挑取菌，水濕潤狀態下，在玻片上自中心向外做螺旋狀緩慢載涂布，以保持莢膜完整；3)自然風干或用電風吹冷風吹干；4)滴加純甲醇2～3滴，固定1～2分鐘，傾斜倒掉甲醇；5)滴加石碳酸復紅染色1～3分鐘，蓋上蓋玻片；6)用吸水紙吸除蓋玻片周圍液體，并將載玻片傾斜，用吸水紙吸除蓋玻片下的部分染色液。本發明通過對制片方法、染色方法、操作步驟的改進，有效地保持了細菌莢膜的完整性，能清晰地展示樣本中所有菌體的莢膜生長狀態，顯著降低了莢膜染色的操作難度，提高了對細菌莢膜識別的可靠性。
文檔編號C12Q1/04GK101255458SQ20081006030
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月3日 優先權日2008年4月3日
發明者周志軍, 許陳云, 周小英 申請人:浙江大學