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一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法

文檔序號:605328閱讀:1588來源:國知局
專利名稱:一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法
技術領域
本發明涉及一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法。
背景技術
目前已報道能耐受亞硒酸鈉的微生物主要有大腸桿菌、羅爾斯通氏菌CH34、深紅紅螺菌、莢膜紅細菌、熒光假單胞菌、固氮紅細菌、酵母菌等。但耐受硒的濃度不高,如羅爾斯通氏菌CH43可耐受亞硒酸鈉的濃度為6mmol / L,大腸桿菌耐受亞硒酸鈉的濃度最高為20mmol / L。王東亮等(2007)報告一株對亞硒酸鈉具有高耐受 性,且能將亞硒酸鈉還原為紅色單質硒的光合細菌S3,經鑒定為固氮紅細菌,其耐硒能力達125mM,高于此濃度就無法生長了。酵母具有較高富集和轉化硒的能力,通常為300 μ g/g左右,通過梯度耐硒馴化、DES化學誘變和紫外誘變,對硒的耐受量可提高到1026. 96μ g/g。李子超等(2011)在進行沼澤紅假單胞菌對亞硒酸鹽還原脫毒的研究時,亞硒酸鹽添加量為25mg/L。Grerbisu. et. al (1995)報告細菌在亞硒酸鈉濃度為O. 6_5mM之間時,芽胞桿菌能將亞硒酸鈉還原為單質硒。李瑞萍等(2005)報告芽胞桿菌H B S 4對亞硒酸鈉有較高的生物耐受性,在亞硒酸鈉濃度高達IlmM仍能生長,但隨著硒濃度的增高,對細菌的抑制作用增強。某些微生物對硒有耐受性,原因是將無機硒轉化成為無毒或低毒的膠體狀態的紅色單質硒。1985年,Nuttal就曾提出膠體狀態紅色單質硒在特定環境下具有生物活性的假說。近年來實驗證實,生物還原得到的紅色單質硒或紅色元素硒是一種以蛋白質為核,紅色單質硒為膜的硒一蛋白復合物,直徑小于200nm,毒性小,對熱穩定,被認為是硒生物解毒的方式。微生物在硒的代謝中通過一系列氧化還原反應,實現硒的不同價態的轉換,起到對硒的解毒作用,并減少對細菌本身的毒害。這種紅色單質硒在免疫調節、抗氧化、延緩衰老和抑制腫瘤等方面都有很好的生物活性,體外清除羥基自由基效率為無機硒的5倍,有機硒的2. 5倍,且毒性只有亞硒酸鈉的1/7,在硒的生物活性利用方面具有較高的研究和應用價值。鄭青山等(2002 )研究發現,紅色單質硒能明顯抑制煙草特異性亞硝胺類化合物誘發人支氣管上皮細胞產生的活性氧自由基,并能直接或間接清除人胚肺上皮細胞癌變過程中產生的02和H202,揭示紅色單質硒對煙草特異性亞硝胺類化合物所致細胞的氧化損傷有保護作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種安全有效的利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法。本發明一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法,其特征在于包含以下步驟a.選育目標菌株將2克一5克取自硒礦區的硒礦渣、土壤等樣品,加入到500毫升肉湯培養基中置于35°C進行增菌培養6小時,用接種環挑取肉湯菌液接種到營養瓊脂培養基上,置35°C培養24—48小時,分離單個菌落并分別進行革蘭氏染色,在1000倍油鏡顯微鏡下選取革蘭氏陽性桿菌,具有橢圓形芽胞,芽胞位于菌體中央,不膨大或稍膨大的芽胞桿菌屬細菌為目標菌株;b.制備含硒培養基 在營養瓊脂培養基中添加I. 0%葡萄糖,以增加碳的供應量,按每毫升培養基含硒800 Ug劑量添加亞硒酸鈉制成固體培養基;c.接種與培養將步驟a選定的目標菌株用接種環分別接種到含硒800 ug/ ml、含糖1%的營養瓊脂培養基上,置35°C溫箱中培養,48小時產生紅色單質硒的菌株定為工作菌株;d.制備紅色單質硒將步驟c培養基上紅色菌株接種到100毫升肉湯培養基中,置35°C培養6小時,進行再增菌;e.生產紅色單質硒將增菌液接種到含硒量800ug/ml、含葡萄糖I. 0%的營養瓊脂培養基上,置35 V培養24— 72小時,至菌落變大,紅色單質硒堆積、整個培養基變紅時便可收獲;f.產品收獲將培養基上紅色菌苔刮下置65°C烘箱中干燥既可得產品。本發明從高硒區硒礦床帶樣本中分離到的菌株對亞硒酸鈉普遍具有較高的耐受性,其中2株超耐硒芽胞桿菌,對硒的耐受和還原能力分別超過46500ug/ml和33000ug/ml,實屬罕見,說明生長在高硒區、特別是生長在硒礦床帶上微生物,為適應高硒生存環境,對硒具有天然的超強耐受性和還原能力。本發明一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法系采用在高硒環境下能正常生存的超耐硒微生物,具有將無機態的元素硒還原為紅色單質硒的特性,制備低毒及納米級的有機硒,具有廣闊的應用前景。本發明從高硒區硒礦床帶上采集檢材,在肉湯培養基中進行富集、分離和選擇性培養獲得單個菌株。然后進行耐硒能力測試,將能耐受高濃度硒并能將培養基中的硒還原為紅色單質硒的芽胞桿菌屬菌株篩選出來,用于制備紅色單質硒的工作菌株。本發明所分離的菌株最終鑒定為地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌,都是自然環境中廣泛分布的細菌,對環境和人及動物有益無害。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述,但發明的實施方式不限于此。從恩施漁塘壩硒礦床地帶采集硒礦渣,稱取3克,放入肉湯(市售成品)中,置35°〇增菌培養6小時。稱取3. 2克營養瓊脂培養基(市售成品)于250ml三角瓶中加蒸餾水100 ml,加熱溶解、加蓋海綿塞,常規高壓滅菌,分裝5個無菌培養皿,制成固體培養基。用接種環挑取增菌液以劃線法接種至營養瓊脂培養基上,置35 °C培養24小時,分離單個菌落。
進行革蘭氏染色,在1000倍顯微鏡下觀察,將革蘭氏染色陽性桿菌,有芽胞,芽胞位于菌體中央,菌體不膨大或稍膨大的菌株,確定為目標菌株。稱取 3. 2克營養瓊脂培養基于250ml三角瓶中,加蒸餾水100 ml,加熱溶解;再加入O. 18克亞硒酸鈉(含硒O. 08克,即每ml培養基含硒800微克)、加入I克葡萄糖,混勻,加塞,常規高壓滅菌,分裝5個無菌培養皿,制成含硒固體培養基。用接種環選取營養瓊脂培養基上的目標菌株,以無菌生理鹽水制成菌懸液,以劃線法分別接種至含硒營養瓊脂培養基上,置35 °C培養24— 72小時,培養基上長的紅色菌落定為工作菌株。將工作菌株用肉湯培養基(方法同前)進行再增菌,將增液以劃線法接種至含硒營養瓊脂培養基上(制法同前),置35 °C培養24— 72小時,細菌菌落呈鮮紅色并融合成片狀菌苔。從培養基上刮下紅色菌苔,置65°C烘箱中干燥得干品。本發明生產的生物紅色單質硒檢測結果如下恩施州質檢SH20120502003號報告硒含量 19667. 80ug/g。
權利要求
1.一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法,其特征在于包含以下步驟 a.選育目標菌株 將2克一5克取自硒礦區的硒礦渣、土壤等樣品,加入到500毫升肉湯培養基中置于35°C進行增菌培養6小時,用接種環挑取肉湯菌液接種到營養瓊脂培養基上,置35°C培養24-48小時,分離單個菌落并分別進行革蘭氏染色,在1000倍油鏡顯微鏡下選取革蘭氏陽性桿菌,具有橢圓形芽胞,芽胞位于菌體中央,不膨大或稍膨大的芽胞桿菌屬細菌為目標菌株; b.制備含硒培養基 在營養瓊脂培養基中添加I. 0%葡萄糖,以增加碳的供應量,按每毫升培養基含硒800Ug劑量添加亞硒酸鈉制成固體培養基; c.接種與培養 將步驟a選定的目標菌株用接種環分別接種到含硒800 ug/ ml、含糖1%的營養瓊脂培養基上,置35°C溫箱中培養,48小時產生紅色單質硒的菌株定為工作菌株; d.制備紅色單質硒 將步驟c培養基上紅色菌株接種到100毫升肉湯培養基中,置35°C培養6小時,進行再增菌; e.生產紅色單質硒 將增菌液接種到含硒量800ug/ml、含葡萄糖I. 0%的營養瓊脂培養基上,置35 °C培養24—72小時,至菌落變大,紅色單質硒堆積、整個培養基變紅時便可收獲; f.產品收獲 將培養基上紅色菌苔刮下置65°C烘箱中干燥既可得產品。
全文摘要
本發明涉及一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法,其特征在于包含以下步驟a.選育目標菌株;b.制備含硒培養基;c.接種與培養;d.制備紅色單質硒;e. 生產紅色單質硒;f.產品收獲。本發明一種利用超耐硒微生物制備紅色單質硒的方法系采用在高硒環境下能正常生存的超耐硒微生物,具有將無機態的元素硒還原為紅色單質硒的特性,制備低毒及納米級的有機硒,具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/07GK102703513SQ201210167650
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月26日 優先權日2012年5月26日
發明者彭祚全, 黃劍鋒 申請人:彭祚全
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