專利名稱：：小型豬細胞色素p450的基因的制作方法
技術領域：
：本發明屬于基因工程領域，特別涉及小型豬細胞色素P450的基因。技術背景細胞色素P450(cytochromeP450,CYP)是一組結構和功能相關的含鐵血紅素同工酶，參與許多外源化合物的轉化過程，對生物體內的新陳代謝起著非常重要的作用。CYP是重要的藥物代謝I相酶，現有超過9(T/。的藥物都需要CYP的參與才能進行代謝。CYP主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族，其中CYP3A亞家族是CYP家族的主要成員，約占肝內CYP含量的30%,腸壁CYP含量的70%,是人類肝臟含量最高和代謝藥物最廣泛的P450酶。CYP在每一物種中均有多種亞型，且不同物種相應CYP的代謝特性具有不同差異。在藥物研究中，為了能將動物實驗的結果推廣到人，針對不同性質的藥物，需要根據動物相應CYP的藥物代謝特性選擇不同的實驗動物，但豬相應CYP3A的藥物代謝特性尚缺乏研究。近年來，隨著動物保護運動的興起和"3R，，原則的逐漸推廣，非人靈長類及犬等高等動物的實驗用途受到限制，豬由于其食性、解剖生理特點及藥物代謝特點等與人的相似性，以其進行藥物研究的應用逐漸增多。小型豬具有遺傳特性穩定、體型小，詞養成本低，易于標準化質量控制，實驗操作方便等優點，是目前醫學生物學研究中的常規實驗用豬，其作為新藥安全性、有效性評價的實驗動物具有良好的應用前景。因此，豬相應CYP3A的藥物代謝特性具有重要的研究價值。獲得異源表達的CYP是研究CYP藥物代謝特性及體外藥物篩選的基礎，目前人、大鼠、小鼠、犬、牛等多種動物的CYP基因已經被克隆，各種CYP也已經在大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等宿主中表達，但迄今為止，關于豬相應CYP3A的基因克隆及異源表達方面的報道極少。此外，在獸醫臨床上，獸藥使用非常廣泛，這些藥物往往具有一定的毒性和蓄積性，帶來潛在的食品安全問題，明確其在動物體內的消除特性將極大地提高對其最大殘留量及休藥期限制的準確性。而大多數獸藥在動物體內的消除依賴于CYP，CYP的活性及其同工酶組成在很大程度上決定這些藥物在動物體內的殘留水平及在不同組織中的殘留狀況。由于CYP活性受到誘導、抑制等影響而導致藥物之間相互作用引起的副作用在獸藥中也同樣存在。在新獸藥的開發研究階段，通過定量構效關系(QSAR)等預測化合物和豬CYP的相互作用并進行實驗驗證，了解何種CYP參與藥物代謝及藥物對CYP的影響，可預測其和其它藥物間的相互作用。因此，克隆豬與人CYP3A亞家族相對應的基因，并進行異源表達，再進一步研究CYP3A亞家族在豬體內的藥物代謝特性，對于藥物代謝研究、體外藥物篩選、獸藥殘留研究、獸藥之間的相互作用研究以及新獸藥研發等具有重要意義。
發明內容有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種小型豬細胞色素P450,具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發明的目的之二在于提供編碼所述小型豬細胞色素P450的基因。進一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列；進一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第1-1965位核苦酸序列。本發明的有益效果在于本發明首次克隆出一種小型豬細胞色素P450(在本發明中命名為CYP3A88)的cDNA全長序列，識別出其開放閱讀框，并推導出其編碼蛋白質(即CYP3A88)的氨基酸序列。CYP3A88為CYP3A亞家族的新成員，該酶可通過參與外源藥物的I相代謝中的氧化反應，決定藥物在小型豬體內的代謝動力學特性、毒副作用及藥物相互作用特性。本發明獲得的CYP3A88的基因，可以用于CYP3A88mRNA的表達水平研究，以評估小型豬是否適宜于作為人CYP3A介導的藥理學研究動物模型，同時，通過測定CYP3A88mRNA的表達水平，還可以進行藥物對小型豬CYP3A88基因表達的誘導或抑制作用研究；采用本發明獲得的CYP3A88的基因，利用基因重組技術可異源表達CYP3A88，并制得CYP3A88的特異性抗體，用于藥物在小型豬體內的代謝特性、毒理作用和藥物相互作用研究，可為新藥的有效性和安全性評價提供充分的基礎數據；因此，本發明具有突出的實質性特點和顯著的進步。圖1為小型豬CYP3A88cDNA片段RT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖2為小型豬CYP3A88cDNA5'RACE擴增產物的瓊脂4唐凝膠電泳鑒定圖；圖3為小型豬CYP3A88cDNA3'RACE擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖4為小型豬CYP3A88基因開放閱讀框PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖5為人、小型豬、犬、大鼠、小鼠CYP3A家族基因的鄰接法(NJ)系統聚類樹。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、小型豬CYP3A88基因的克隆1.小型豬CYP3A88cDNA部分序列的預測從CYP網站(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)下載主要哺乳動物(包括人、大鼠、小鼠、犬、牛)CYP3A亞家族的所有氨基酸序列，轉換成FASTA格式，構建CYP3A種子序列庫；從GenBank數據庫下載豬的所有表達序列標簽(expressedsequencetags,EST),構建豬UniGene序列庫；采用BLAST程序(版本2.2.15),以CYP3A種子序列庫中的所有氨基酸序列對豬UniGene序列庫進行TBLASTN同源性檢索，獲得2條相似性最高的豬CYP3A同源EST(GenBank登錄號分別為AJ958861和CB479861);將所得豬CYP3A同源EST用DNASTAR軟件(版本7.1.0)進行電子拼接，得到1條922bp的重疊克隆群(contig)序列，即預測的小型豬CYP3A88cDNA部分序列；2.總RNA的提取將巴馬香豬(4-6月齡，體重約10kg,由中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物學教研室提供)經戊巴比妥鈉麻醉后，活體取出肝臟中葉左側部分組織，用生理鹽水沖洗后切成小塊，迅速置液氮中凍存，備用；取50-100mg液氮凍存肝臟組織，采用TripureRNA提取試劑盒(ROCHE/>司)^是取總RNA,按照試劑盒說明書操作；提取的總RNA用質量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，并用核酸蛋白定量儀測定濃度,取28SrRNA條帶強烈且Aw，位于1.8-2.0之間的RNA樣品用于后續實驗；3.小型豬CYP3A88cDNA片段的克隆3.1引物的設計與合成根據步驟1預測的小型豬CYP3A88cDM部分序列，設計并合成l對引物Pl如SEQIDNo.3所示、P2如SEQIDNo.4所示；3.2小型豬CYP3A88cDNA片段的RT-PCR擴增采用反轉錄試劑盒(Promega公司)和PCR試劑盒(TaKaRa公司)兩步法進行小型豬CYP3A88cDNA片段的逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增逆轉錄制備cDNA，以步驟2提取的總RNA為模板，以01igo(盯)15為逆轉錄引物，反應過程為按質量比2:1加入總RNA和逆轉錄引物，使反應總體積為15(al，混勻，溫度70。C水浴5分鐘，立即冰浴5分鐘，瞬時離心，再加入5xAMV緩沖液5pl、濃度為1Ommol/L的dNTPs2.5pl、濃度為40U/pl的RNasin1^1、濃度為10U/(al的AMV逆轉錄酶l.5總體積為25混勻，瞬時離心，溫度42°C反應60分鐘，95°C變性10分鐘終止反應；PCR擴增雙鏈cDNA，以逆轉錄制備的cDNA為才莫板，以步驟3.1合成的引物Pl、P2為上下游引物，反應體系為10xPCR反應緩沖液2.5jil、濃度為10mmol/L的dNTPs2.5pl、濃度為10^mol/L的上、下游引物各2[xl、沖莫4反2|11、濃度為5U/pl的DNA聚合酶0.5|il、濃度為50mmol/L的MgCl2溶液2pl、雙蒸水補充至總體積為25pi;反應條件為溫度96。C預變性5分鐘，然后95°C變性30秒、58。C退火30秒、72。C延伸1分鐘，共12個循環，每循環1次退火溫度降低O.5°C;再95。C變性30秒，52'C退火30秒，72。C延伸1分鐘，共33個循環；最后72。C延伸5分鐘；PCR產物采用質量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結果如圖1所示，其中1泳道為DL200GPCR分子量標準(Takara/>司)，2泳道為PCR產物，從圖可知，在約600bp的位置出現一條特異性DNA條帶，與小型豬CYP3A88目的cDM片段(608bp)大小相符；鑒定正確的PCR產物采用凝膠回收試劑盒(Promega公司)進行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約600bp的目的片段進行切膠回收，獲得純化的小型豬CYP3A88c腿片段；3.3小型豬CYP3A88cDNA片^殳的克隆及序列測定將步驟3,2所得純化的小型豬CYP3A88cDNA片段與pMD18-T載體(TaKaRa公司)進行TA連接，連接方法為濃度為50ng/Vl的DNA片段4jal、濃度為50rig/pi的載體1^1、連接緩沖液5ji1，置溫度為16。C孵育8小時，構建重組克隆載體pMD18-T/CYP3A88;將所得重組克隆載體轉化入CaCl2法制備的DH5cc大腸桿菌感受態細胞，轉化方法為將上述重組克隆載體IOnl加入到感受態細胞100pi中，水浴30分鐘，42。C水浴熱^木克90秒，立即冰浴2分鐘，再加入液體LB培養基，于溫度為37。C，150r/min振搖l小時，制得轉化細胞；將所得轉化細胞涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，于溫度37。C倒置過夜，從平板上隨機挑取數個白斑，接種于液體LB培養基中，于溫度37。C、150r/min振搖過夜，采用質粒提取試劑盒(Promega公司)小量提取質粒，按照步驟3.2所述方法進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性克隆質粒；取所得陽性克隆質粒，委托上海基康生物技術有限公司測定插入片段的序列，獲得608bp的DM序列，與小型豬CYP3A88cDNA部分序列的預測值一致；4.小型豬CYP3A88cDNA全長的克隆采用cDNA末端快速擴增4支術(rapidamplificationofcDNAends,RACE),以SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)對小型豬CYP3A88cDNA片段的5'和3'末端進行快速擴增，以獲得小型豬CYP3A88cDNA全長。4.1引物的設計與合成根據步驟3.3測得的小型豬CYP3A88cDNA部分序列，分別i殳計5'和3'末端基因特異性引物(genespecificprimer，GSP)和嵌套基因特異性引物(nestedgenespecificprimer,NGSP):5'GSP如SEQIDNo.5所示，5'NGSP如SEQIDNo.6所示，3'GSP如SEQIDNo.7所示，3'NGSP如SEQIDNo.8所示；4.2小型豬CYP3A88cDNA片段的RACE擴增4.2.1cDNA第一鏈的制備以步驟2提取的總RNA為模板，按照試劑盒說明書逆轉錄制備5'和3'cDNA第一鏈；4.2.25'RACE擴增第一輪RACEPCR:以步驟4.2.1制得的5'cDNA第一鏈為模板，以通用引物(universalprimer,UPM)和步驟4.1合成的5'GSP為上下游引物，反應體系為5xPCR反應緩沖液5nl、濃度為10隨ol/L的dNTPs0.5pl、上、下游引物各0.5(!l、模板0.5(il、濃度為2.5U/(il的PrimeSTARDNA聚合斷TaKaRa公司)0.25nl、雙蒸水補充至總體積為25反應條件為溫度94。C預變性5分鐘；然后94。C變性30秒，68。C退火30秒，72。C延伸1.5分鐘，共31個循環，每循環1次退火溫度降低0.5°C,31個循環后降至53°C;再94。C變性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸1.5分鐘，共10個循環；最后72""C延伸10分鐘；反應起始時加入5'GSP,擴增10個循環后再加入UPM;第二輪RACE巢式PCR:以步驟4.1合成的5'NGSP、嵌套通用引物(nesteduniversalprimer,NUP)為上下游引物，反應條件與第一輪5'RACE相同，反應起始時加入5'NGSP,擴增10個循環后再加入NUP;5'RACE擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖2所示，其中1泳道為DL2000PCR分子量標準(Takara公司)，2泳道為PCR產物，從圖可知，在約1500bp的位置出現一條特異性DNA條帶；將鑒定正確的5'RACE擴增產物進行切膠回收純化；4.2.33'RACE擴增第一輪RACEPCR:以步驟4.2.1制得的3'cDNA第一鏈為模板，以UPM和步驟4.1合成的3'GSP為上下游引物，反應條件與第一輪5'RACE基本相同，不同之處在于每個循環中72。C延伸40秒，反應起始時同時加入UPM和5'GSP;第二輪RACE巢式PCR:以步驟4.1合成的3'NGSP、NUP為上下游引物，反應條件與第一輪3'RACE相同；3'RACE擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結杲如圖3所示，其中l泳道為MarkerVPCR分子量標準(TianGen公司)，2泳道為PCR產物，從圖可知，在約600bp的位置出現一條特異性DNA條帶；將鑒定正確的3'RACE擴增產物進4亍切"交回收純^:;4.3RACE擴增片段的克隆、序列測定及小型豬CYP3A88cDNA全長序列拼接按照步驟3.3所述方法，分別將步驟4.2所得純化的5'和3'RACE擴增產物與pMD19-T載體連接，定向構建重組克隆載體pMD19-T/5'RACE、pMD19-T/3'RACE,將所得重組克隆載體轉化入DH5a大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，用PCR方法鑒定陽性克隆質粒并進行序列測定；測序結果顯示，去除載體序列后，5'RACE擴增獲得1541bp片段，3'RACE擴增獲得606bp片段，5'和3'RACE擴增片段的序列用Pregap4軟件進行拼接，重疊區域為184bp，得到全長為1965bp的拼接contig，說明已經獲得完整的小型豬CYP3A88cDNA全長序列，如SEQIDNo.1所示；5.小型豬CYP3A88基因開放閱讀框(ORF)的克隆根據小型豬CYP3A88cDNA全長序列，設計并合成如下引物P3如SEQIDNo.9所示、P4如SEQIDNo.IO所示；按照步驟3.2所述方法，以步驟2提取的總RNA為模板，以Oligo(dT)15為逆轉錄引物，以引物P3、P4為上下游引物，RT-PCR擴增小型豬CYP3A88基因ORF;PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖4所示，其中1泳道為WideRangeDNAMarker(500-12000bp,TaKaRa公司),2泳道為PCR產物,在約1600bp的位置出現一條特異性DNA條帶，與引物設計的預測擴增大小(1613bp)相符，說明目的基因4并接正確；PCR產物經切膠回收純化；按照步驟3.3所述方法，將所得純化的PCR產物與pMD19-T載體連接，轉化入DH5a大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，用PCR方法鑒定陽性克隆質粒并進行序列測定，獲得1613bp的cDNA序列，分析結果表明該序列包含長1509bp的小型豬CYP3A88基因0RF(SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列)，其編碼有503個氨基酸的蛋白質(序列如SEQIDNo.2所示)，即CYP3A88。二、小型豬CYP3A88基因的序列分析和同源性比較將小型豬CYP3A88基因在美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上進行BLAST同源序列比對，結果表明，小型豬CYP3A88基因為新發現的豬CYP3A亞家族基因，GenBank登錄的豬CYP39v2(登錄號為EF625354),CYP3A46(登錄號為AB052266.1)均為該基因的片段。小型豬CYP3A88基因(SEQIDNo.1中第1-1965位核苷酸)全長1965bp,其0RF為1509bp(第56-1564位核苷酸)，編碼有503個氨基酸的蛋白質(如SEQIDNo.2所示)；5'非編碼區長55bp(第1-55位核苷酸)；3，非編碼區長396bp(第1565-1965位核苷酸)，其中polyA長度為29bp(第1937-1965位核苷酸)。經SignalP3.0信號肽分析,小型豬CYP3A88的第1-29位氨基酸序列為信號肽序列。將CYP3A88氨基酸序列與小型豬其它3個CYP3A家族成員(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)進4亍對比，其相似性分別為92。/。，89%，80%。上述4個豬CYP3A家族成員與人CYP3A家族成員(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43)序列比對結果見表l,從表l中可看出，小型豬CYP3A88與人CYP3A4相似性最高，為77%。表l、小型豬CYP3A與人CYP3A的氨基酸序列相似性比較(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用Phylip3.66軟件將小型豬和其它4種哺乳動物(人、犬、大鼠、小鼠)的CYP3A家族基因作系統聚類分析，結果如圖5所示，圖中H代表人、D代表犬、R代表大鼠、M代表小鼠，從圖5可知，各物種的CYP3A基本各自為一分支，提示細胞色素P450具有較明顯的種屬差異性，在選擇藥物代謝模型的實驗動物時應重視種屬差異；小型豬CYP3A88首先與豬CYP3A其他成員聚為一類；然后豬與犬聚為一類，再和人聚為一類，而大鼠和小鼠聚在另一分支，說明豬、犬和人的細胞色素P450基因具有較近的遺傳關系，從而推測在CYP3A亞家族參與的藥物代謝中，豬與犬比大鼠和小鼠作為模型動物更為合適，由于小型豬的諸多應用優勢，其作為CYP3A亞家族的藥物代謝模型具有良好的應用前景。三、小型豬CYP3A88基因的用途小型豬CYP3A88基因編碼相應的P450單酶CYP3A88,該酶通過參與外源藥物的I相代謝中的氧化反應，決定藥物的藥代動力學特性、毒副作用及藥物的相互作用特性。小型豬CYP3A88基因具有如下多種用途1、小型豬CYP3A88基因可用于CYP3A88mRNA的表達水平研究，這對于評估小型豬是否適宜于作為人CYP3A介導的藥理學研究動物模型具有重要意義；同時，通過測定CYP3A88mRNA的表達水平，可進4亍藥物對小型豬CYP3A88基因表達的誘導或抑制作用研究。2、以小型豬CYP3A88基因構建重組表達載體，轉化入宿主細胞，誘導宿主細胞表達可獲得小型豬CYP3A88，用于小型豬體內的藥物代謝特性研究、毒理作用研究、藥物相互作用研究等，一方面評價小型豬作為人類藥物代謝模型的適用性；另一方面為評估獸藥殘留、獸藥之間的相互作用、新獸藥研發等提供基礎依據。3、根據小型豬CYP3A88基因序列，可通過基因沉默、抗原抗體反應等抑制該基因表達或CYP3A88代謝酶活性，用于研究豬CYP基因的代謝特性。4、通過基因重組技術以小型豬CYP3A88基因制得小型豬CYP3A88后，可進一步制備小型豬CYP3A88的特異性抗體，用于CYP3A88基因的表達定量檢測，為研究藥物對小型豬CYP3A88基因的誘導或抑制作用提供必要的檢測技術。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>小型豬細胞色素P450的基因<160〉10<210〉1<211〉1965<212〉DM<213>豬(Susscrofa)<220><221>CDS<222〉(56)…(1564)<400〉1gggcacaaccagctaaaaggaaaatccgaggagagaatcacggaggacagtggccatg58Met1gacctgateccaggcttttecacagaaacctgggUetcctggetacc106AspLeulieProGlyPheSerThrGluThrTrpValLeuLeuAlaThr51015agectggtgetcetctatetatatgggactUtteacatggccttttt154SerLeuValLeuLeuTyrLeuTyrGlyThrTyrSerHisGlyLeuPhe202530aagaagctggggattcctgggccaagacctctgccttattUggaaat202LysLysLeuGlylieProGlyProArgProLeuProTyrPheGlyAsn354045atectgggctaccgtaagggtgttgaccatUtgacaaaaagtgtttt250lieLeuGlyTyrArgLysGlyValAspHisPheAsplysLysCysPhe50556065caacagtatgggaaaatgtgggggUttttgatggteggcagcccgtg298GinGinTyrGlyLysMetTrpGlyPhePheAspGlyArgGinProVal707580ttggetateaccgatccagacatgateaaaacggtcetcgtgaaagaa346lxuAlalieThrAspProAspMetlieLysThrValLeuValLysGlu859095tgttattctgtcUcacaaaceggeggtcttttggtccacgtggtget394CysTyrSerValPheThrAsnArgArgSerPheGlyProArgGlyAla100105110atgagaagtgetgtctctctggetgaggatgaagagtggaaaagaate442MetArgSerAlaValSerLeuAlaGluAspGluGluTrpLysArglie115120125cgaacgttgctgtctccgaccttcaccagtggaaagetcaaggagatg490ArgThrLeuLeuSerProThrPheThrSerGlyLysLeuLysGluMet130135140145ttccccateattagecattatggagacttgttggtgageaacctgagg538PheProlielieSerHisTyrGlyAspLeuLeuValSerAsnLeuArg150155160aaggaagcagagaaaggcaaacctgtgaccatgaaagacatetttggg586LysGluAlaGluLysGlyLysProValThrMetLysAspliePheGly165170175gcctacageatggacgtgateactageacagcatttggagtgaacgtc634AlaTyrSerMetAspVallieThrSerThrAlaPheGlyValAsnVal180185190gattecetcaacaacccacaagacccctttgtggaaaacageaggaag682AspSerLeuAsnAsnProGinAspProPheValGluAsnSerArgLys195200205etcttaaaatttagtttcUcagtccattcUtetcteaataatattc730LeuLeuLysPheSerPhePheSerProPhePheLeuSerlieliePhe210215220225tttccattcUgaccccgateUggaagtattaaacateactctgttt778PheProPheLeuThrProlieLeuGluValLeuAsnlieThrLeuPhe230235240cccaaaagtgttgtgaattttttcacgagatecataaaaaggatgaaa826ProLysSerValValAsnPhePheThrArgSerlieLysArgMetLys245250255gaaagtcgcetcaaagatacacaaaagcaccgagtggaccUcUcag874GluSerArgLeuLysAspThrGinLysHisArgValAspLeuLeuGin260265270ctgatgattaacteccagaattecaaagaaatggacgcccataaaggt922LeuMetlieAsnSerGinAsnSerLysGluMetAspAlaHisLysGly275280285ctgtecaatgaagaacttgtggcccaaggtgttatttttatttttget970LeuSerAsnGluGluLeuValAlaGinGlyValliePheliePheAla290295300305gggtatgagaccactageagttctetctecetccttgtgtatgaattg1018GlyTyrGluThrThrSerSerSerLeuSerLeuLeuValTyrGluLeu310315320gccactcaccctgacgtccagcagaagctgcaggaggagattgatgcg1066AlaThrHisProAspValGinGinLysLeuGinGluGlulieAspAla325330335accttccccaataaggcgcctcctacctaxgatggtctggcgcaaatg1114ThrPheProAsnLysAlaProProThrTyrAspGlyLeuAlaGinMet340345350gagtatcUgacatggtggtgaacgaatctetcagaatattcccagtt1162GluTyrLeuAspMetValValAsnGluSerLeuArgliePheProVal355360365actcctagagttgagagggtctgtaagaaggatgtggaaatecatggc1210ThiProArgValGluArgValCysLysLysAspValGlulieHisGly370375380385gtgttcValPhegttValcccProaaaLys390gggGlyactThrgtgValatgMetatgMet395gtgValccaProatelietttPhegcgAla400cttLeu1258cac3gaHisArggccAlaccgPro405gagGluetcLeutggTrpcc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