專利名稱：：創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝及其在水生動物的應用的制作方法創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝及其在水生動物的應用駄領域本發明涉及一種致病菌滅活疫苗的制備及其應用。
背景技術：
：創傷弧菌(W6Wovw/"辨cus)是一種低度嗜鹽性弧菌，屬于人魚共患病病原，能導致人與鰻鱺產生敗血癥和嚴重傷口感染。大致可分為生物i、生物n、生物iiih個型，其中生物i型主要危害了人的健康，可導致人感染后致死率高達60%以上；而生物ii型則為鰻鱺的主要細菌性傳染病病源之一，上個世紀70-80年代，曾讓日本、歐美等鰻鱺產業遭受巨大的經濟損失；近五年來，我國沿海地區養殖鰻鱺因創傷弧菌而引起發病也十分嚴重，臨床上呈現急性和遷延性兩種過程，養殖場鰻鱺創傷弧菌病可反復發作，造成嚴重經濟損失。傳統通常采用抗生素和消毒劑等化學藥物防治創傷弧菌病，易造成了環境污染、藥物殘留和抗藥性等問題，影響水產品出口，甚至消費者的健康。目前，國內外研究創傷弧菌主要惻重流行病學和致病機理等，而比較少關注水產疫苗的研制與開發。有關發酵工藝研究主要集中在大腸桿菌等工業微生物，弧菌發酵工藝方面至今未見報道；有關水產動物病尉SCOMs的研究報道也僅見本實驗室的嗜水氣單胞節SCOMs研究，而創傷弧節SCOM疫苗的制備工藝研究在國內尚未見報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種能優化創傷弧菌疫苗的發酵培養、提高發酵液中疫苗活菌生物含量、且疫苗的應用效果較好的創傷弧菌全菌免raij激復合物疫苗的制備工藝及其水生動物的應用。本發明的目的通過如下步驟的技術方案實現它包括如下步驟(l)將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養，(2)對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活，(3)對滅活的菌液進行無活菌檢驗(4)離心收集滅活的創傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎，(6)免翻微復合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復合物。本發明選用的創傷弧菌毒力較強(LD5o約為200cfti/g)、且培養^#和優化的培養基能使發酵液的活菌生物含量實現翻番，培養出的創傷弧菌生物量高達50mg/ml以上；為創傷弧菌疫苗的產業化發酵生產提供了強有力的技術支持。具體實肺式本發明的具體工藝步驟如下(1)將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養選擇公認TSB培養基和改良的TSB培養基；將經常規檢測合格的創傷弧菌毒株接種到含有TSB的細菌培養物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31°0度溫、100-200轉/射中的條件下振蕩培養14-18小時，將該培養液作為種子液；以0.5-10%預擴增的培養物接種于發酵罐內的新鮮高壓滅菌的改良TSB培養液中大規模培養36-60小時；所述的改良的TSB培養液的成分為葡萄糖0.18°/。-0.22%(W/V為水的體積重量百分比，以下同。)、胰蛋白胨1.2%-1.8%(W/V)、大豆胨0.2%-0.6%(W/V)、玉米漿0.2%-0.6%(￥/￥)、磷酸氫二鉀0.15%-0.25°/。(W/V)、氯化鈉1.0%"2.0%(WAO、磷酸鐵0.0005%-0.002%(W/V)和酵母膏0.05%-0.2%(W/V);發酵培養條件參數為接種量為0.5-10%、溫度25-31。C、轉速100-200轉/分鐘；空氣流量為35-15L/min;11值6.5-7.5;發酵20-28小時后按間隔3-10分鐘、自動工作15-20秒補濃縮料共5001111，所述的濃縮料的重量份數比為葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即為發酵菌液。(2)對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活將菌液收集于滅菌罐中，添加終濃度為0.1-0.5%(V/V體積百分比)的福爾馬林，室溫罐內翻滾震蕩3-5小時后，置于3-5。C冰箱中過夜或經過48小時，可徹底滅活。為了確保徹底滅活需對滅菌后滅菌罐中的菌液(即滅活菌液)進行無菌檢驗，無菌檢驗的方法是充分搖勻滅菌后的滅活菌液，滅菌槍頭吸取0.2-1.0ml的滅活菌液，超凈工作臺上鋪平板，放置26-30"恒溫培養箱培養48小時，滅菌完全的培養物應當沒有菌落出現，試驗設空白平板對照。G)離心收集滅活的創傷弧菌在8000-12000轉/分鐘的轉速下，離心20-30分鐘，收集、濃縮細菌；發酵培養細菌的生物量(濕重)應為25-50gT、所述的離心收集的細菌用滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至生物量125-175g丄1。上述經過大量培養、滅活及離心濃縮、收集的滅活細菌即為菌苗的半成品。(4)對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎，菌體粗蛋白的制備(細菌裂解，蛋白釋放)采用市售的JY98-3D超聲波破碎儀，超聲波的超聲探頭(又稱為變幅桿)的直徑為20mm，超聲功率設為800瓦；將超聲波破碎儀用70%酒精進行潔凈消毒；將滅活的200-400ml的濃縮菌液放入專用超聲杯中，待濃縮菌液預凍或預溶至留有少量冰晶時進行低溫超聲破碎；破碎的作用程序為間隔時間10秒，工作時間5秒，如此循環反復作用總時間為6分鐘/輪。共作用3輪，全程時間為18分鐘，實際作用時間為6分鐘。指針顯示的輸出起始功率在720瓦左右，最后階段的功率可接近設置值800瓦。本發明中還可以采用其它細菌破碎儀，只要能達到對滅活后的細菌進行破碎的目的即可。第一次超聲波裂解后的用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)調整細菌蛋白濃度至(5)免疫刺激復合物(ISCOMs)組分的配制在超聲裂解的菌體粗蛋白中、每lOOm!菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2%(W/V)的皂苷(QuilA)(出處ACCURATECHEMICAL&SC正NTIFICCORPORATION)和每ml菌液中各添加100-150ug.ml"的卵磷脂和膽固醇(終濃度)。由于卵磷脂和膽固醇都是不易溶于水的有纟幾物，配制卵磷脂和膽固醇時先將兩種物質、溶解于氯仿中配成100-150mg.mT'儲存液，現配現用或-2(TC凍存備用。(6)超聲波處理制備免疫刺激復合物菌體粗蛋白按上述配苗比例添加皂苷、卵磷脂和膽固醇構成免疫刺激復合物的基質后，待預凍或預溶至留有少量冰晶時，置于超聲波破碎儀內進行低，聲破碎、控制超聲破碎倉內溫度不高于35"C。程序設置為間隔時間10秒，超聲作用5秒，全程時間為18分鐘。溫度不高于6(TC。在潔凈條件下，將超聲處理的免疫刺激復合物收集于500ml滅菌疫苗專用塑料瓶內混勻后，測定免^lt激復合物蛋白濃度，用滅菌PBS調整免疫刺激復合物的蛋白濃度至8-12mg.mr1。二7爐聲處理后得到制品即為創傷弧菌免1」激復合物疫苗；將制得的免1」'激復合物疫苗在-20°(:凍存備用。(7)分裝將創傷弧菌ISCOM疫苗分裝于100ml經150-17(TC干熱處理1.5-2.5小時的疫苗專用玻璃瓶，加蓋、貼標簽，-201:凍存。(8)成品檢驗將分裝后的成品進行性狀檢驗和純粹檢驗；凍存前制品為棕黃色均勻濃稠液體，有輕微硫臭味；凍結狀態為棕黃色冰塊；所述的性狀檢驗為制品用0.01MPBS1:100稀釋，差速離心去除細胞碎片，再，離心濃縮ISCOMs，飽和磷鉤酸負染后置透射電鏡下觀察，可觀察到直纟5為35nm40nm籠格狀結構；所述的純粹檢驗為抽檢2/10已分裝的疫苗，無菌條件下用移液器吸取混勻的ISCOMs0.1-0.5ml，均勻涂平板，26-30。C恒溫箱培養48小時觀察應無細菌生長。為了保證所獲得的培養物中無污染物的存在，在上述步驟(1)之后步驟(2)之前進行培養物的污染菌落檢測；具體方法如下每一批預擴增和擴大培養時均設同批次培養基空白對照，將培養基空白對照污染者廢棄。從每一批次生產的細菌中隨機抽樣(2/10)劃板培養，鑒定菌落形態、色澤，觀察有無雜菌生長；進行血清凝集試驗評估細菌的抗原性，不合格產品高壓滅活后廢棄。為了確保在步驟(2)至陟驟(4)的過程中沒有發生污染情況，在步驟(4)之后和步驟(5)之前最好進行污染菌落檢驗以及抗原性檢驗，污染菌落檢驗方法與上述的無菌檢驗方法相同，抗原性檢測方法為濃縮后的菌苗以滅菌生理鹽水(或PBS)作10-20倍稀釋后，菌體凝集試驗評估其抗原性。在步驟(5)之后步驟(6)之前，還可以對經過破碎工序的菌液進行蛋白檢測，該檢測方法屬于已有公知的方法，檢測方法為以新鮮配置的牛血清白蛋白(BSA)作曲線，Bradford法測定一次破碎后的蛋白濃度。在步驟(7)之后，還可以經過透射電鏡下的觀測與鑒定的步驟，該步驟的具體過程如下典型ISCOMs的結構為直徑35nm-40nm的顆粒狀，中間為疏水區，有6個對稱的點狀物比較均勻地分布在其周圍，構成免疫刺激復合物(ISCOM)結構的典型基質。創傷弧菌全菌ISCOMs制品因成分復雜未做進一步的超速離心處理，飽和磷鴇酸負染后置透射電鏡下觀察，不易觀察到典型的ISCOMs結構。樣品經100倍，8000-12000轉/分鐘離心30辦中，去除細胞碎片，34000-36000轉/分鐘離心,處理后，可在電鏡下觀察到直徑為35nm40nm的籠格狀結構。將經過本發明方法制得的創傷弧菌ISCOM疫苗經過安全性檢測和效力檢驗的結果如下。所述的安全性檢驗分為如下步驟(a)實驗魚及其飼養條件選擇健康活躍、無病癥、無體外寄生蟲感染的鰻鱺，置50X30X40cm3玻璃水族箱注水至箱深的1/2處，每個水族箱放養鰻鱺10-25尾，置于室內，控溫空調控制室溫24。C土rC。7jC源為暴氣自來水，每日換水1/3。普通小型充氣機連續充氣直到試驗結束；鰻鱺在試驗前暫養7天以上，檢驗無寄生蟲感染，試驗期間停止投食。(b)對鰻魚的安全性試驗浸浴以滅菌自來水將創傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為200iig.mT1，浸浴歐洲鰻鱺10-25尾，24小時后換水；同樣體積滅菌自來水浸浴同批鰻鱺10-25尾為對照；實驗組與對照組均設重復平行組，連續觀察7-14天，鰻鱺無病理反應，可判定批次疫苗是安全可靠的。注射滅菌PBS(0.01mol)將創傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為2000ug.mT1，一次性注射器以0.1ml/尾的劑量注射鰻鱺10-25尾，對照食曼li10-25尾注射等劑量滅菌PBS;實驗組與對照組均設重復平行組，連續觀察7-14天，鰻鱺無病理反應，可判定批次疫苗是安全可靠的。灌胃滅菌PBS(0.01mol)將創傷弧菌ISCOM疫苗稀釋為4000Pg.mT1，一次性注射器(配硅膠管)以0.21111/尾的劑量灌胃鰻鱺10-25尾，對照鰻鱺10-25尾灌胃等劑量滅菌PBS;實驗組與對照組均設重復平行組，連續觀察7-14天，鰻鱺無病理反應，可判定批次疫苗是安全可靠的。所述的效力檢驗步驟如下(a)試驗魚標準及飼養餅規格5-50g/尾(便于采血)。試驗魚免疫前血清抗體檢驗隨機選擇3尾以上鰻鱺采集血清，血清凝集或ELISA法評估免疫前的血清抗體效價。本底抗體滴度;疑集價大于22(顯著凝集)、ELISA抗體效價大于1:200不宜作為試驗用魚。試驗魚的健康標準及飼養條件同安全性檢驗(a)。(b)注射免疫、及攻毒以滅菌生理鹽7jC將創傷弧菌ISCOM疫苗調整為350-450ug.mT1濃度的懸液。鰻鱺經魚安定麻醉后，每尾腹腔注射上述免疫懸液0.1ml，每組10-25尾，對照組鰻鱺腹腔注射等劑量的滅菌生理鹽水；實驗組與對照組均設重復平行組。攻毒于免疫后的第25-40天，用新鮮制備的創傷弧菌菌株的菌液(2X104-5X105cfb)腹腔注射攻毒，7-14天內觀察并統計死亡情況。實驗室疫苗注射免疫后攻毒試驗i微結果(見表l)，免疫組的免疫保護力為100%和對照組的存活率為0%。表l對照和免SgJc洲S，FJ03-X2菌株攻擊的成活率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(c)口服免疫、采血及攻毒倉iJ傷弧節SCOM疫苗，在鰻場對鰻鱺進行口服免疫試驗。按每噸魚體重每天拌料50ml疫苗，連續口服7天，間隔一周后再服7天；以不添加疫苗的常規飼料投喂魚ft麗為對照組。攻毒于第2次免疫后的第25-60，行攻毒試驗，試驗分2組，免疫組與對照組，每組10-25尾；免疫組與對照組均設重復平行組。用新#羊制備的創傷弧菌菌株的菌液(2X104-5X105cfU)腹腔注射攻毒，7-14天內觀察并統計死亡情況。田間疫苗口服免疫后攻毒試驗免疫組的免疫保護力為100%，對照組的存活率為23.1%;試驗結果見敦表2對照和i&S日本mFJ03-X2菌^J女擊的j^S率t激<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1、一種創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于，它包括如下步驟(1)將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養，(2)對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活，(3)對滅活的菌液進行無活菌檢驗(4)離心收集滅活的創傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎，(6)免疫刺激復合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復合物。2、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免MU激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養的方法為選擇TSB培養基和改良的TSB培養基;將經常規檢測合格的創傷弧菌毒株接種到含有TSB的細菌培養物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31。C恒溫、100-200轉/分鐘的條件下振蕩培養14-18小時，將該培養液作為種子液；以0.5-10%預擴增的培養物接種于發酵罐內的新鮮高壓滅菌的改良TSB培養液中大規模培養36-60小時；所述的改良的TSB培養液隨體積重量百分比W/V的成分為葡萄糖0.18°/。-0.22%、胰蛋白胨1.2%-1.8%、大豆胨0.2%-0.6%、玉米槳0.2%-0.6%、磷酸氫二鉀0.15%-0.25%、氯化鈉1.0%-2.0%、磷酸鐵0.0005%~0.002%和酵母膏0.05%-0.2%;發酵±咅養條件參數為接種量為培養基1^只的0.5-10%、溫度25-3rC、轉速100-200轉/分鐘；空氣流量為35-151/min;培養基的pH值6.5-7,5;發酵20-28小時后按間隔3-10分鐘、自動工作15-20秒補濃縮料共500ml，所述的^t縮料的重量份數比為葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即為發酵菌液。3、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活的方法為將菌液收集于滅菌罐中，添加終濃度V/V體積百分比為0.1-0.5%的福爾馬林，室溫罐內翻滾震蕩3-5小時后，置于3-5。C冰箱中過夜或經過48小時，可徹底滅活；所述的無菌檢驗如下充分搖勻細菌，滅菌槍頭吸取0.2-1.Oml的滅活菌液，超凈工作臺上鋪平板，放置26-30。C恒溫i咅養箱培養48小時，滅菌完全的培養物應當沒有菌落出現，試驗設空白平板對照。4、根據權利要求1所述的倉ij傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的帝ij備工藝，其特征在于所述的離心收集滅活的創傷弧菌的方法為在8000-12000轉/分鐘的轉速下，離心20-30分鐘，收集、濃縮細菌；發酵培養細菌的生物量的濕重應為25-50g.1—、所述的離心收集的細菌用滅菌生理鹽水重懸，每升菌苗的離心后定容至生物量125國175g,r1。5、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎的方法為采用市售的JY98-3D超聲波破碎儀，超聲波的超聲探頭的直徑為20mm，超聲功率設為800瓦；將超聲波破碎儀用70%酒精進行潔凈消毒;將滅活的200400ml的濃縮菌液放入專用超聲杯中，待濃縮菌液預凍或預溶至留有少量冰晶時進行低溫超聲破碎、控制超聲破碎倉內溫度不高于35'C;破碎的作用禾M^為間隔時間10s，工作時間5s，如此循環反復作用總時間為6^H中/輪；共作用3輪，全程時間為18分鐘，實際作用時間為6分鐘；指針顯示的輸出起始功率在720瓦左右，最后階段的功率可接近設置值800瓦。第一次超聲波裂解后的用滅菌磷酸鹽緩沖液調整細菌蛋白濃度至8-12mg,mT1。6、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的免疫刺激復合物組分的配制方法如下在超聲裂解的菌體粗蛋白中、每100ml菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2%W/V的皂苷和每ml菌液中各添加終濃度100-150ug.ml"的卵磷脂和膽固醇。7、根據權利要求6所述的倉怖弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于酉己帝柳磷脂和膽固醇時先將兩種物質溶解于氯仿中配成100-150mg.ml"儲存液，現配現用或-20'C凍存備用。8、根據權利要求7所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于所述的超聲波處理制備免疫刺激復合物的方法為菌體粗蛋白按上述配苗比例添加皂苷、卵磷脂和膽固醇構成免疫刺激復合物的基質后，待濃縮菌液預凍或預溶至留有少量冰晶時進行低溫超聲破碎、控制超聲破碎倉內溫度不高于35。C;程序設置為間隔時間10秒，超聲作用5秒，全程時間為18分鐘；溫度不高于6(TC;在潔凈條件下，將超聲處理的免疫刺激復合物收集于500ml滅菌疫苗專用塑料瓶內混勻后，測定免疫剌激復合物蛋白濃度，用滅菌PBS調整免疫刺激復合物的蛋白濃度至S-lSmg.!!!!'1;二次超聲處理后得到制品即為創傷弧菌免疫刺激復合物疫苗；將制得的免疫刺激復合物疫苗在-2(TC凍存備用。9、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免疫刺激物疫苗的制備工藝，其特征在于，它還包括如下步驟分裝和成品檢驗步驟；所述的分裝步驟為將創傷弧菌ISCOM疫苗分裝于100ml經150-17(TC干熱處理1.5-2.5小時的疫苗專用玻璃瓶，加蓋、貼標簽，-20匸凍存；所述的成品檢驗步驟為將分裝后的成品進行性狀檢驗和純粹檢驗；凍存前制品為棕黃色均勻濃稠液體，有輕微硫臭味；凍結狀態為棕黃色冰塊；所述的性狀檢驗為制品用0.01MPBS1:100稀釋，差速離心去除細胞碎片，再超速離心濃縮ISCOMs，飽和磷鉤酸負染后置透射電鏡下觀察，可觀察到典型的直徑為35nm-40nm籠格狀結構；所述的純粹檢驗為抽檢2/10已分裝的疫苗，無菌條件下用移液器吸取混勻的ISCOMs0.1-0.5ml，均勻涂平板，26-3(TC恒溫箱培養48小時觀察應無細菌生長。10、根據權利要求1所述的創傷弧菌全菌免^lj激復合物疫苗的制備工藝，其特征在于，在上述步驟(1)之后步驟(2)之前進行培養物的污染菌落檢測；具體方法如下每一批預擴增和擴大培養時均設同批次培養基空白對照，將培養基空白對照污染者廢棄；從每一批次生產的細菌中隨機抽樣2/10劃板培養，鑒定菌落形態、色澤，觀察有無雜菌生長；進行血清凝集試驗評估細菌的抗原性，不合格產品高壓滅活后廢棄。11、根據權禾腰求I一IO中的任意一項權利要求所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗在水生動物的應用，其特征在于將制得的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗應用于水生動物的創傷弧菌的免疫預防。12、根據權利要求11所述的創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗在水生動物的應用，其特征在于采用注射給藥的方式或采用口服給藥的方式進行免疫預防。全文摘要本發明涉及一種創傷弧菌全菌免疫刺激復合物疫苗的制備工藝及其在水生動物的應用，它包括如下步驟(1)將創傷弧菌進行預擴增與擴大培養，(2)對培養后的發酵菌液中的創傷弧菌進行滅活，(3)對滅活的菌液進行無活菌檢驗(4)離心收集滅活的創傷弧菌，(5)然后對收集的滅活創傷弧菌進行超聲波破碎，(6)免疫刺激復合物組分的配制，(7)超聲波處理制備免疫刺激復合物。本發明選用的創傷弧菌毒力較強(LD<sub>50</sub>約為200cfu/g)、且培養條件和優化的培養基能使發酵液的活菌生物含量實現翻番，培養出的創傷弧菌生物量高達50mg/ml以上；為創傷弧菌疫苗的產業化發酵生產提供了強有力的技術支持。文檔編號C12N1/20GK101361971SQ20081007191公開日2009年2月11日申請日期2008年10月10日優先權日2008年10月10日發明者劉曉東,林天龍,林能鋒,許斌福申請人:福建省農業科學院生物技術研究所