專利名稱：用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒，進一步涉及一種使用該種試劑盒快速檢測創傷弧菌的方法。
背景技術：
創傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種廣泛分布于海洋與鹽湖中的嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌。該菌是引起食源性疾病的主要病原之一，人通過進食生牡蠣等海產品經胃腸道黏膜或破損的皮膚接觸海水而感染該菌，可引起原發性敗血癥、下肢創傷感染，出現皰性皮膚損害、皮膚淤斑壞死、蜂窩組織炎等，同時伴高熱、低血壓、休克，最終發展為感染性休克、多器官衰竭甚至死亡，致死率可高達70％，是食品安全和水產品進出口重要的微生物檢疫對象。創傷弧菌也是魚、蝦、貝類等的重要病原菌，可引起魚類皮膚潰爛病和敗血癥、養殖對蝦的紅腿病和爛鰓病以及貝類膿皰病等，給水產養殖業帶來嚴重的經濟損失，也是水產養殖病害檢驗檢疫的重要對象。
以往檢測創傷弧菌主要有三種辦法1.生化鑒定法，該法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.酶聯免疫吸附法(ELISA法)，該法具有敏感性高、檢測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現的假陽性問題在一定程度上還限制著該方法的廣泛應用；3.聚合酶鏈式反應法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未見用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒及方法報道。
發明的內容本發明的目的是提供一種快速、特異性強、靈敏度高且成本低的用環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法檢測創傷弧菌的試劑盒，并提供一種使用該試劑盒快速檢測創傷弧菌的方法，從而為水產養殖和食品安全提供科學的依據和指導作用。
本發明的主要原理為(1)特殊設計一組可識別靶DNA六個不同序列的兩個內引物(上游內引物和下游內引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產生一個原始的莖環DNA；(3)內引物以原始的莖環DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產生一個原始的莖環DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環DNA；(4)在等溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到109拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增結果。
本發明涉及的一種用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環介導等溫擴增(LAMP)反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸鎂(MgSO4)、0.8-1.2uM上游內引物(vul-FIP)、0.8-1.2uM下游內引物(vul-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(vul-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(vul-B3)和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀(KCl)、100mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM硫酸鎂(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上游內引物(vul-FIP)為tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游內引物(vul-BIP)為acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物(vul-F3)為tggttcggttaacggctg；下游外引物(vul-B3)為gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位(8U/uL)；(3)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I。
上面所述環介導等溫擴增(LAMP)反應液A每管23uL的最佳組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游內引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
使用上述環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒檢測創傷弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；
C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA；(2)創傷弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在每個反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創傷弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為創傷弧菌。
本發明的優點本發明建立了創傷弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，本試劑盒根據創傷弧菌的基因保守區的六個序列設計了兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，以保證檢測不同來源創傷弧菌株的可靠性。本發明采用環介導等溫擴增(LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速。可用于創傷弧菌的檢測，特別適合于基層醫療機構以及養殖現場應用。
具體實施例方式
下列實例進一步說明本發明，但不應該當作對本發明的限制。
按下列配方制作創傷弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒(1)LAMP反應液A2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游內引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B濃度為8U/uL。
(3)顯色劑C10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序進行檢測
(1)細菌DNA的提取A.取1.0mL過夜培養的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；B.加入1.0mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機12000轉/分離心5分鐘，棄上清液；C.加入100uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10分鐘；D.用臺式離心機12000轉/分離心10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。
(2)創傷弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置5分鐘，立即置于冰上1分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上65℃放置1小時；D.將金屬浴調到80℃中止反應，3分鐘后取出。
(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創傷弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為創傷弧菌。
本法快速、特異性強、靈敏度高且成本低。
權利要求
1.一種用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環介導等溫擴增反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸鎂、0.8-1.2uM上游內引物、0.8-1.2uM下游內引物、0.2-0.3uM上游外引物、0.2-0.3uM下游外引物和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；上游內引物為tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游內引物為acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物為tggttcggttaacggctg；下游外引物為gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位；(3)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I。
2.根據權利要求1中所述用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒，其特征是環介導等溫擴增反應液A每管23uL的組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mMdNTP、1.0uL 20uM上游內引物、1.0uL 20uM下游內引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL20uM下游外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O。
3.一種使用權利要求1或2中所述的用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒檢測創傷弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。(2)創傷弧菌的環介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在每個反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創傷弧菌，如顏色變為綠色，則說明樣品為創傷弧菌。
全文摘要
涉及一種用環介導等溫擴增方法檢測創傷弧菌的試劑盒及方法，試劑盒包括環介導等溫擴增反應液A、Bst DNA聚合酶B、顯色劑C；其中反應液A含有反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內引物tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcac-ggcagttg、下游內引物acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcc-caat、上游外引物tggttcggttaacggctg、下游外引物gccatcaacatagcggctaa和1－1.5M甜菜堿；檢測方法包括細菌DNA的提取、環介導等溫擴增、顯色檢測等。其優點是快速、特異性強、靈敏度高且成本低。
文檔編號C12P19/00GK101020927SQ20071002710
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月9日 優先權日2007年3月9日
發明者任春華, 胡超群, 王青柏, 羅鵬 申請人:中國科學院南海海洋研究所