專利名稱：從牛初乳中分離乳腺上皮細胞的體外培養方法
技術領域：
本項發明涉及從牛初乳中分離乳腺上皮細胞的體外培養技術。
背景技術：
乳腺細胞的培養，對于研究奶牛泌乳的生理、營養和內分泌調控，揭示影 響奶產量和質量的遺傳因素及其分子機制，探討通過基因選擇、內分泌和營養 調控來提高奶產量具有重要的理論意義和應用前景。另外，利用體外培養的乳 腺細胞系，通過轉基因手段將高附加值的藥用蛋白基因導入乳腺細胞，獲得轉 基因乳腺細胞系，再通過轉基因體細胞克隆技術，獲得以奶牛乳腺作為生物反 應器的專基因奶牛，是今后重組藥用蛋白生產的一個具有廣闊應用前景的領域。
目前，由于乳腺上皮細胞增殖分化過程受多種細胞因子和激素等復雜的時 空調控，牛乳腺上皮細胞的培養、尤其是能夠長時間穩定傳代的原代乳腺細胞 的分離培養仍然是具有很大難度和挑戰性的一項技術，罕見成功的報道。
牛乳腺上皮細胞原代培養方法常規的有乳腺組織塊種植法和乳腺組織膠原 酶消化法，從牛初乳中分離培養乳腺細胞尚未見成功的報道。組織塊種植法操 作簡便，細胞不易丟失，適用于小組織量培養。但是從種植的組織塊長出細胞 需要的時間較長，成纖維等結締組織細胞最先長出，含上皮細胞豐富的細胞單 層隨后出現。膠原酶消化法，可獲得更具組織代表性的細胞群，但工作量相對 大，費用高(膠原酶價格高)。直接用這種消化物的濾過液培養，長出的往往是 上皮和成纖維混雜的細胞單層，在酶消化過程中還存在丟失和損傷細胞的危險 性。有文獻報道，用膠原酶消化水牛、奶牛乳腺組織進行細胞培養，均未獲得正常生長的乳腺細胞。故有人選擇機械破碎法，這種方法操作較簡便，比酶消 化法快，但可對細胞產生機械損傷。此外，上述三種方法還由于組織取材不太 容易，有一定局限性。為了解決這些問題，我們實驗室采用從牛初乳中分離培 養乳腺上皮細胞，獲得了較好的效果。該方法樣品材料來源廣泛，取材方便， 操作簡單，避免了酶消化破碎法對細胞造成的傷害。從乳汁中分離得到的乳腺 細胞純度高，雜細胞少，體外培養細胞生長旺盛，形態規整，可用于各種體外 研究。
發明內容
方法
1、 制備培養液 RPMI-1640 、用前添加FBS 20%、胰島素lug/ml、醋酸 鈉5mM、轉鐵蛋白10 ug/ml 、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml;
2、 包被培養瓶用膠原蛋白包被培養瓶。取少量的膠原蛋白加入培養瓶， 用自制的彎頭玻璃管，將其推開，使之均勻的鋪滿底壁，以傾斜瓶時不流動為 益，將培養瓶蓋擰松，放置于超凈工作臺內5—6小時，用于接種細胞。
3、 細胞來源細胞來自泌乳一周內的荷斯坦奶牛乳汁中。用新潔爾滅水清 洗乳房，再用75%酒精擦抹消毒乳頭，用干燥、滅菌的容器采集50—100ml乳汁， 以1000-1500rpm離心20min，仔細去除上清，用含青霉素100U/ml、鏈霉素 100ug/ml的D-hanks液清洗沉淀的細胞團塊3—4次直到上清液不渾濁為止。
4、 細胞原代培養及傳代將離心所得細胞混懸在含20% FBS、 lug/ml胰島 素、5mM醋酸鈉、10ug/ml轉鐵蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養液中，接種于培養瓶內，置C02培養箱，在37。C、 5%(:02飽和濕 度下培養，3天后每天觀察1次，從第5天開始每3天更換 一次培養液，當細胞匯合度達到80—90%時，用Trypsin/EDTA消化，收集細胞，用培養液稀釋制成 細胞懸液態觀察初培接入培養瓶中繼代培養。
5、 細胞形養細胞為圓形，經2—3天，細胞開始伸偽足生長。此時細胞呈 短梭形、三角形或不規則多角形，第5—6天可見克隆形成。細胞逐漸向周圍擴 展鋪開，成片生長。此時可觀察到兩種形態的上皮細胞，一種為多角形，細胞間 聯系緊密，呈大理石狀； 一種為短梭形，細胞互相銜接，呈鵝卵石狀。隨著細 胞進一步匯合，培養瓶中形成以上皮細胞為主的不規則生長區域。第9—10天 細胞基本連接成片，達底面積的80%—90%，有些上皮細胞區域的邊緣出現細胞 堆積現象。繼代培養后，乳腺上皮細胞出現水泡樣或圓形中空的腺腔樣結構。
6、 乳腺上皮細胞的免疫組化鑒定運用乳腺細胞的特異性標記物抗體可以 對培養的細胞類型進行鑒定。乳腺上皮細胞中的骨架蛋白主要以角蛋白7、 8和 18為主，是其重要的標志蛋白。實驗中，我們選擇角蛋白一18抗體對所建立的 乳腺上皮細胞系進行免疫組化鑒定。經FITC標記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下 觀察，乳腺上皮細胞的細胞質呈綠色熒光信號，而細胞核中無熒光信號。說明 細胞中存在乳腺上皮細胞的標志性骨架蛋白pr-角蛋白18，進而確定該細胞系 的乳腺上皮特性。
7、 體外培養的牛乳腺上皮細胞中P酪蛋白的檢測
對體外原代培養的牛乳腺上皮細胞中P -酪蛋白的檢測用雙抗夾心ELISA方 法和RT-PCR兩種方法從蛋白水平和轉錄水平對原代培養的牛乳腺上皮細胞進行 檢測，均檢測到了3-酪蛋白。證明所培養的乳腺上皮細胞具有泌乳功能。
通過對所培養的細胞形態學觀察、免疫組化鑒定、P酪蛋白的檢測等方面 的研究和細胞來源，證明我們從牛初乳中分離、培養的細胞確為牛乳腺上皮細胞。
具體實施例方式
采集泌乳一周內的荷斯坦奶牛乳汁，經反復離心沉淀，收集細胞將其混懸
在含20。/。FBS 、 lug/ml胰島素、5mM醋酸鈉、10ug/ml轉鐵蛋白、100U/ml青霉 素、100ug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液中，接種于用膠原蛋白包被的培養瓶 內，置37°C 、5% C02培養箱中培養。當細胞長滿底壁達80-90%時，用Trypsin/EDTA 消化，收集細胞，繼續傳代培養。
權利要求
1、一種從牛初乳中分離和培養乳腺上皮細胞的培養液，包括各種培養成份含量是RPMI-164075-80％、胎牛血清20％、胰島素1ug/ml、醋酸鈉5mM、轉鐵蛋白10ug/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml。
2、 培養瓶包被方法用膠原蛋白包被培養瓶。取少量的膠原蛋白加 入培養瓶，用自制的彎頭玻璃管，將其推開，使之均勻的鋪滿底壁，以傾 斜瓶時不流動為益，將培養瓶蓋擰松，放置于超凈工作臺內5—6小時，用 于接種細胞。
3、 細胞來源細胞來自泌乳一周內的荷斯坦奶牛乳汁。
全文摘要
本發明公開了一種從牛初乳中分離乳腺上皮細胞的體外培養方法。針對目前乳腺上皮細胞體外培養方法中存在的組織取材不易、培養成功率低等問題，我們采用從泌乳2-7天的牛初乳中分離培養乳腺上皮細胞，進行原代培養。培養液為RPMI-1640，添加胎牛血清20％、胰島素1μg/ml、醋酸鈉5mM、轉鐵蛋白10μg/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml等，培養條件為37℃，5％CO<sub>2</sub>。細胞接種在膠原包被的培養瓶內，經過15-18天培養，細胞可鋪滿瓶子底壁，并可傳代。用角蛋白-18抗體對所培養細胞進行免疫組化鑒定，結果呈陽性，證明所培養細胞系確為乳腺上皮細胞。用ELLISA和RT-PCR方法從原代培養的牛乳腺上皮細胞中均檢測到了β-酪蛋白，表明所培養的乳腺上皮細胞具有泌乳功能，可用于多種體外研究。
文檔編號C12N5/06GK101591636SQ20081007288
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月26日 優先權日2008年5月26日
發明者李文蓉, 牛志剛, 譚立新 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心