一種重組人血清白蛋白的純化方法及其應用的制作方法

專利名稱：：一種重組人血清白蛋白的純化方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明闡述了一種畢氏酵母表達的重組人血清白蛋白(rHSA)的純化方法及在細胞培養法生產人用病毒疫苗中的應用。
背景技術：
：牛血清白蛋白或人血清白蛋白是細胞培養法生產病毒疫苗中不可缺少的穩定劑，但牛血清白蛋白由于來源于動物并且有潛在的瘋牛病等污染而逐漸被人血液來源的人血白蛋白所替代。然而同樣，血源人血白蛋白不可避免地含有潛在的病原體感染的危險，同時血源人血白蛋白來源于人血槳而限制了其產量和批間穩定性，質量不穩定。W098/068221998年2月19日公開了重組人血清白蛋白(rHSA)用于動物細胞培養，其中重組人血清白蛋白是用于促進細胞的增長。W099/125681999年3月18日公開了重組人血清白蛋白與糖、無機鹽等組合物用于水痘、帶狀皰疹及麻疹、風疹、腮腺炎活病毒的穩定劑。rHSA的制備方法為本領域技術人員所熟知，EP0612761、EP0570916和EP0699687中均揭示了一個用基因操作技術重組人血清白蛋白的方法。然而，這些方法均因步驟多、周期長、成本高而變得復雜，因而難于滿足工業放大的經濟要求。申請人自有專利申請CN1496993A和CN1854155A公開了制備疫苗生產用rHSA的方法。與其他方法相比，該方法所純化的重組HSA特征的顯色物質及多糖等雜質水平大幅度降低，但內毒素水平難以控制，需要進行進一步優化處理，控制內毒素、提高收率以得到可工業化的純化工藝。
發明內容本發明提供了一種高效的適合工業化的rHSA的純化方法以及rHSA在制備病毒疫苗培養基，特別是狂犬病疫苗培養基和狂犬病疫苗制劑中的用途。本發明是通過下述技術方案實現的首先通過申請人自有專利申請技術(CN1854301和CN1854306)構建的基因工程酵母菌及生產方法獲得重組人血清白蛋白發酵液，利用0.5um孔徑的陶瓷膜進行過濾，加熱后的上清液經過高鹽陽離子交換層析，收獲的溶液進行硼酸鹽處理，經過中空纖維處理的溶液按照CN1854155A中的工藝進行疏水交換層析和弱陰離子交換層析。最后，弱陰離子層析的洗脫組分用已知方法，如超濾濃縮方法、冷凍干燥方法等制成各種成品。硼酸鹽沉淀的去除方式在專利CN1854155A中描述為離心去除，但實際操作中離心后料液澄清度低，在生產上動力消耗較大，與專利CN1854155A不同的是，通過引入中空纖維處理操作，使得發酵上清液在加熱時不用加入活性炭，并且對硼酸鹽處理的溶液不用離心操作，從而使操作更加簡便。引入中空纖維的優點合適孔徑的中空纖維可以大幅度降低內毒素含量、濾后料液澄清度好，并且省去活性炭及離心沉淀對蛋白的吸附，收率提高2-10%。其中中空纖維孔徑為截留分子量100K-0.5um，優選為500K-0.2um。內毒素水平得到穩定控制，以鱟試劑檢測低于0.5EU/mL(產品濃度為100mg/mL)。除非特別說明，本申請中rHSA的濃度(％)的含義為g/100mL，即每100mL溶液中rHSA的含量(g)，如rHSA10X的含義為每lOOmL溶液中rHSA的含量為10g。具體地，本發明涉及1)—種可工業化的純化rHSA的方法，包括將含rHSA的發酵液經過陶瓷膜處理，上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是所述經高鹽陽離子交換層析的溶液在經硼酸鹽處理后，利用中空纖維柱進行過濾。2)根據項1)所述的方法，其中中空纖維的孔徑為截留分子量100K-0.5um，優選為500K-0.2咖。3)根據項1)所述的方法，其中弱陰離子交換層析使用的緩沖液包括醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉及辛酸鈉等，優選為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和辛酸鈉，濃度為10mM-200mM，優選50-100mM。4)項1)所述方法制備的rHSA，其具備下述特征蛋白純度為99%_100%單體和二聚體，優選基本上100%單體和二聚體；宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優選為10ppm總蛋白；多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優選為低于lug/mgrHSA;內毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優選為0.5EU/mL(10%rHSA)。5)項4)所述的rHSA在病毒疫苗生產細胞VERO、MDCK或MRC-5細胞培養基中的用途。6)根據項5)所述的用途，其中rHSA的濃度為O.1%_10%，優選為0.1%_0.5%。7)根據項5)_6)所述的用途，其中病毒的培養方法是轉瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。8)根據項5)_6)任一所述的用途，其中病毒疫苗為人用狂犬病疫苗。9)項4)所述的rHSA在制備人用狂犬病疫苗制劑中的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優選0.5%-5%。10)根據項9)所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水針或凍干劑。本發明獲得的疫苗生產用rHSA具有以下特征l)蛋白濃度為99%_100%單體和二聚體，優選基本上100%單體和二聚體。2)宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優選為10卯m總蛋白。3)多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優選為低于lug/mgrHSA。4)內毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優選為0.5EU/mL(10%rHSA)。本發明方法制備的rHSA可用于VERO、MDCK和MRC-5細胞進行病毒疫苗的生產，特別是狂犬病疫苗的生產。具體地，在DMEM培養基中添加O.1%_10%，優選為0.l%-0.5%的重組人白蛋白做為病毒收液過程的維持培養基進行病毒收液。病毒培養方法可以是轉瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。同時，該方法制備的rHSA還可以用作病毒疫苗終產品的穩定劑，可以是凍干劑，也可以是水劑。具體實施例方式下述實施例僅為本領域技術人員更好地理解本發明，不應解釋為對本發明的限制。實施例1重組人血清白蛋白(rHSA)的純化在純化過程中所用的各種緩沖液見下表4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>a)發酵液的澄清和加熱處理利用孔徑0.5um的陶瓷膜對發酵液進行澄清處理，取發酵上清液80L，加入5mM辛酸鈉、5mMEDTA，在70。C下加熱20分鐘，冷卻。b)高鹽陽離子層析分離和濃縮將上述經過處理的樣品以150cm/h流速上樣高鹽陽離子CST-IIFF柱(XK50/60,Vt二300ml，GE公司制造，預先用溶液A平衡)，用溶液B洗脫，得CST-I1BD組分。用截留分子量300K的濃縮膜包(MILLIPORE公司生產)進行濃縮至100mg/ml左右。c)硼酸鹽處理和中空纖維處理向濃縮組分中加入四硼酸鈉和氯化鈣，使最終濃度為50-100mM，過夜。用截留分子量500K的中空纖維超濾柱(GE公司)分離。d)加熱處理向中空纖維處理后溶液中加入辛酸鈉和半胱氨酸，至最終濃度各5mM和10mM，在6(TC加熱60分鐘，迅速冷卻。e)疏水層析分離和濃縮加熱后樣品經0.45和0.22um的膜過濾，進入PhenylSFF柱(XK50/60，Vt=500ml，GE公司，用溶液C平衡)。收集流穿部分。f)弱陰離子層析分離將上述流穿組分進入AminobutylSFF柱(XK50/60,Vt=500ml，GE公司制造，用溶液C平衡)，用溶液D進行洗脫，得Amino-BD組分。g)濃縮換液用截留分子量30K的超濾膜濃縮，然后用含辛酸鈉的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液換液，得到最終含rHSA10%的終產品517g。h)產品的鑒定本發明各步rHSA濃度、產率、糖含量以及純度見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，用Bradford方法測定蛋白濃度，計算總蛋白量，從而計算各步收率；糖含量用苯酚-硫酸法測定；純度利用SDS-PAGE電泳法結合HPLC法進行分析；內毒素水平利用鱟試劑法檢測。實施例2rHSA在狂犬病疫苗轉瓶培養工藝中的應用a)細胞制備將Vero細胞(來源于美國ATCCCRL-1586)進行復蘇、轉瓶擴增培養，傳代到3.5L雙層轉瓶。培養條件37t:，(A5%(v/v)。b)病毒接種當Vero細胞培養成單層時，以MOI為0.0250.125接種CTN株毒種(中國藥品生物制品檢定所)。接種后，換用添加疫苗生產用rHSA0.35X的DMEM培養基維持液。培養溫度34°C。c)病毒收液換用維持液之后每三天收換液一次，收液后繼續換新鮮維持液，連續收液三次。分別采用單克隆抗體制備雙抗體夾心ELISA法和小鼠滴定實驗測定三次收液的G蛋白含量與病毒滴度，測定數據見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化病毒收獲液澄清過濾后進行超濾濃縮使用截留分子量750K的中空纖維柱，對病毒收獲液進行超濾濃縮。超濾過程中，病毒顆粒得到高度濃縮，而培養液中的小分子物質如白蛋白、酚紅等大部分在透過液中被除去。e-丙內酯(l:4000)4。C滅活24小時，37。C水解2小時；柱層析純化使用S印harose4FastFlow層析柱，按柱體積10%上樣，收集第1峰。經層析純化后，病毒液中的低分子量蛋白質分子(主要是培養液中的白蛋白)被去除，病毒峰中蛋白質含量大大降低。從層析柱收集峰抽取測定蛋白含量樣品后，立即加入人血白蛋白(湖南衡陽南岳制藥廠)作為保護劑，其終濃度為1%，同時加入硫柳汞做防腐劑，硫柳汞終濃度《0.08mg/ml。根據蛋白質含量及抗原含量進行配制，分裝，成為液體制劑。制劑成品經檢驗，各項指標均符合中華人民共和國2005版藥典要求，主要是NIH法測定疫苗效力為4.6IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測到酵母細胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實施例3rHSA在狂犬病疫苗NBS反應器培養工藝中的應用a)細胞制備將Vero細胞進行復蘇、轉瓶擴增培養，以4X105cellS/ml的密度接種于NBS5L生物反應器中，反應器酯片籃中裝置160g聚酯片，工作容積2.5L，培養條件37°C，溶氧45%，攪拌速度70rpm，pH值7.4。b)病毒接種Vero細胞培養45天時，換用添加疫苗生產用rHSA0.35%的DMEM培養基，以MOI為0.0250.125接種CTN株毒種。培養溫度34。C，溶氧45%，攪拌速度70rpm，pH值7.4。c)病毒收液連續灌注收液20天，收液量24L，混合病毒收液病毒滴度均達到6.51gLD50。d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實施例2中純化操作進行。制劑成品經檢驗，各項指標均符合中華人民共和國2005版藥典要求。主要是NIH法測定疫苗效力為4.6IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測到酵母細胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實施例4rHSA在狂犬病疫苗微載體反應器培養工藝中的應用a)細胞制備將Vero細胞進行復蘇、轉瓶擴增培養，以5X105cellS/ml的密度接種于工作體積5L的微載體反應器，微載體用量125克。反應罐在溫度371:，溶氧45%，pH值7.4條件下培養細胞5日，細胞濃度達到1.2X107cells/ml時接種病毒。b)病毒接種以MOI為0.0250.125接禾中CTN株毒種。用含rHSA0.35%的DMEM培養基，培養溫度34°C，溶氧45%，pH值7.4，培養72小時。c)病毒收液病毒培養72小時后開始灌注收液。病毒感染后于第5、9、13天，以及混合收獲液取樣。進行鏡檢、病毒滴定和糖蛋白的檢測。糖蛋白含量小于lIU/ml或細胞匯合率低于20%，停止收液。共收液14天，收獲病毒液體積58L。第5、9、13天和混合收液檢測數據如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實施例2中純化操作進行。制劑成品經檢驗，各項指標均符合中華人民共和國2005版藥典要求。主要是NIH法測定疫苗效力為4.7IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測到酵母細胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實施例5rHSA在人二倍體細胞轉瓶培養生產狂犬病疫苗工藝中的應用a)細胞制備人二倍體細胞系MRC-5，來自美國ATCCCCL_171。細胞系經復蘇、轉瓶擴增培養，傳代到雙層轉瓶。培養條件371:，0)25%。b)病毒接種接種后35天，當MRC-5細胞生長到培養成單層時，接種CTN株毒種，接種MOI為0.0250.125。接毒后，換用添加rHSA0.35%的DMEM培養基維持液。培養溫度34°C。c)病毒收液接毒后3天，開始收液，收液后繼續換新鮮維持液，連續收液三次。分別采用單克隆抗體制備雙抗體夾心ELISA法和小鼠滴定實驗測定三次收液的G蛋白含量與病毒滴度，測定數據見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>d)狂犬病疫苗病毒收獲液的純化純化操作按照實施例2中純化操作進行。制劑成品經檢驗，各項指標均符合中華人民共和國2005版藥典要求。主要是NIH法測定疫苗效力為4.5IU/劑量，特別是，利用Elisa試劑盒法檢測到酵母細胞宿主蛋白殘留小于5ng/劑量。實施例6rHSA在VERO、MDCK和MRC-5細胞無血清培養基中應用根據VER0、MDCK(ATCCCCL-34)、MRC-5細胞培養營養代謝情況，在DMEM(Hyclone公司生產)培養基中分別添加氨基酸、植物蛋白水解物、重組人血清白蛋白、酯類等添加劑，制成VER0、MDCK、MRC-5細胞用無血清培養基。主要改進如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>酯類膽固醇5mg/l乙醇胺60ul/lLipidmixture(sigma，L5416)3ml/l采用上述配方配制成兩種無血清培養基SFMI:添力口lg/1rHSASFMII:添加lg/1人血白蛋白。實驗方案1:上述兩種培養基用于VERO細胞傳代培養，用含10%(v/v)血清的匿EM培養基作對照。實驗結果連續傳代50代，在上述三種培養基中細胞狀態無明顯差異，細胞活性均〉99%，細胞群體倍增時間為SFMI23小時、SFMI123.5小時，對照培養液為22小時，結果表明rHSA可替代血源白蛋白用于VERO細胞無血清培養基，二者性能無明顯差異。實驗方案2:采用上述SFMI、SFMII培養基進行MDCK細胞維持平行對照試驗，以含5%(v/v)血清的DMEM培養液作對照。[O1OS]a)MDCK細胞接種6個2L轉瓶。b)細胞長滿單層后，換上述三種培養基，各2瓶，維持培養。[OWS]c)隔天換液。實驗結果共維持42天，維持結束時細胞貼壁率SFMI為72.7%、SFMII為70.5%、對照為78.6%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MDCK無血清維持培養，二者與含5%血清培養基無明顯差別。實驗方案3:采用上述SFMI、SFMII培養基進行MRC-5細胞維持平行對照進行試驗。1)MRC-5細胞接種4個2L轉瓶。2)細胞長滿單層后，換上述兩種培養基，各2瓶，維持培養。3)隔天換液。實驗結果共維持30天，維持結束時細胞貼壁率SFMI為83.5%、SFMII為85.0%。表明rHSA可替代人血清白蛋白用于MRC-5細胞無血清維持培養。實施例7用重組人血清白蛋白做狂犬病疫苗的穩定劑水針劑層析純化后的狂犬病毒顆粒收液抽取測定蛋白濃度樣品后，立即加入終濃度為1%的rHSA作為保護劑，同時加入硫柳滎做防腐劑，終濃度<0.08mg/ml。根據蛋白質含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(終濃度1%)作為穩定劑，分裝，成為液體制劑。測定效價為4.8IU/ml。對樣品進行熱穩定性試驗37'C放置4周后，測定效價，結果為3.8IU/ml。凍干劑層析純化后病毒顆粒收液根據蛋白質含量及抗原含量配制半成品，加入rHSA(終濃度2%)、麥芽糖等穩定劑，分裝，凍干，成為凍干制劑。測定效價為4.6IU/支。對樣品進行熱穩定性試驗37。C放置4周后，測定效價，結果為3.7IU/支。10權利要求一種可工業化的純化rHSA的方法，包括將含rHSA的發酵液經過陶瓷膜處理，上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是所述經高鹽陽離子交換層析的溶液在經硼酸鹽處理后，利用中空纖維柱進行過濾。2.根據權利要求1所述的方法，其中中空纖維的孔徑為截留分子量100K-0.5um，優選為500K-0.2um。3.根據權利要求1所述的方法，其中弱陰離子交換層析使用的緩沖液包括醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉及辛酸鈉等，優選為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和辛酸鈉，濃度為10mM-200mM，優選50-100mM。4.權利要求1所述方法制備的rHSA，其具備下述特征蛋白純度為99%_100%單體和二聚體，優選基本上100%單體和二聚體；宿主蛋白殘留低于100ppm總蛋白，優選為10ppm總蛋白；多糖殘留低于10ug/mgrHSA，優選為低于lug/mgrHSA;內毒素含量低于0.85EU/mL(10%rHSA)，優選為0.5EU/mL(10%rHSA)。5.權利要求4所述的rHSA在病毒疫苗生產細胞VERO、MDCK或MRC-5細胞培養基中的用途。6.根據權利要求5所述的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優選為0.1%_0.5%。7.根據權利要求5-6任一所述的用途，其中病毒的培養方法是轉瓶工藝，微載體懸浮工藝或多聚酯片吸附的灌注工藝。8.根據權利要求5-6任一所述的用途，其中病毒疫苗為人用狂犬病疫苗。9.權利要求4所述的rHSA在制備人用狂犬病疫苗制劑中的用途，其中rHSA的濃度為0.1%_10%，優選0.5%-5%。10.根據權利要求9所述的用途，其中所述的狂犬病疫苗是水針或凍干劑。全文摘要本發明涉及一種重組人血清白蛋白(rHSA)的純化方法，包括將含rHSA的發酵液經過陶瓷膜處理，上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特征是，所述經高鹽陽離子交換層析的溶液在經硼酸鹽處理后，利用中空纖維進行過濾。本發明獲得的rHSA可用于細胞培養法生產人用病毒疫苗，特別是狂犬病疫苗。文檔編號C12N7/00GK101768206SQ200810080278公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者任樂民,劉文獻,李梅彥,杜力,王志明,賀建功,賈茜,趙偉,高健,魏敬雙,黃順軍申請人:華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司