專利名稱：治療乳腺癌的藥物及其專用反義寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療乳腺癌的藥物及其專用反義寡核苷酸。
技術背景POKEMON是一種新發現的致癌基因，它能夠導致其它致癌基因發作，最終促 使腫瘤形成。POKEMON可以使癌細胞獲得抗老化和死亡的能力，因此被稱為癌癥 的"總開關"。非常重要的一點是細胞內Pokemon的缺失不會對細胞的正常生長造成 影響，這就為設計低副作用的特異性抗癌藥物提供了可能。Izant和Weintraub于1984年首次提出反義技術，所謂反義技術就是根據核酸間 結合堿基互補原理，用人工合成或生物合成的特定互補的反義核酸或它們的化學修 飾物與細胞內的核酸相互作用以抑制或封閉其表達。惡性腫瘤的發生與細胞內某些 癌基因的激活或某些抑癌基因的失活或缺失有關。反義核酸能特異地阻斷癌基因激 活后的過度表達而不影響其他基因的正常功能，目前利用反義技術設計出與有害基 因、突變基因、非正常表達基因及其mRNA互補的反義核酸，以封閉這些基因或抑 制其表達。而反義核酸治療腫瘤的研究主要在腫瘤細胞株、荷瘤動物和腫瘤患者三 個水平上進行應用。目前ISIS3521、 ISIS5132、 ISIS2503、 G3139、 GEM231等已進 入臨床試驗階段。 發明內容本發明的目的是提供一種治療乳腺癌的藥物及其專用反以寡核苷酸。 本發明所提供的反義寡核苷酸是，抑制POKEMON基因表達的反義寡核苷酸， 其分子式為5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3，其中，x均指硫代磷酸酯鍵；y均指磷酸二酯鍵；A均指2'-脫氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脫氧胞苷；G均指2'-脫氧鳥苷。本發明所提供的治療癌癥的藥物是含有上述反義寡核苷酸的藥物。 所述藥物以上述反義寡核苷酸為有效成分。 所述藥物是治療癌癥，特別是治療乳腺癌的藥物。所述藥物可通過經脈或皮下給藥治療；所述藥物可通過局部給藥治療。 所述給藥治療可與放射療法結合或與化學療法結合治療疾病。所述給藥治療的用藥劑量范圍是50-100nmol/L。本發明的反義寡核苷酸可有效降解MCF — 7細胞內POKEMON基因的mRNA， 降低其在mRNA和蛋白水平的表達，并使細胞生長阻斷在G2/M周期，進而誘導腫 瘤細胞凋亡。本發明的以反義寡核苷酸為有效成分的藥物是一種有效的治療乳腺癌 的基因治療藥物。
圖1為反義核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4對POKEMON-GFP融合蛋白 的抑制效果圖2為在MCF-7細胞內反義核苷酸ANP4對Pokemon的mRNA的抑制效果 圖3為在MCF-7細胞內反義核苷酸ANP4對Pokemon和P53蛋白水平的抑制效果圖4A為反義核苷酸ANP0對MCF-7細胞生長的影響。 圖4B為反義核苷酸ANP4對MCF-7細胞生長的影響。 圖4C為反義核苷酸ANP0對HepG-2細胞生長的影響。 圖4D為反義核苷酸ANP4對HepG-2細胞生長的影響。
具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。 實施例l 、 POKEMON基因反義寡核苷酸的獲得 1、 POKEMON基因反義寡核苷酸的設計利用工作站(www.bioinfo.rpi.edu.cn/applications/mfold)對POKEMON基因 (NM_015898)的mRNA的二級結構進行了預測。針對POKEMON基因的閱讀框 架，結合其二級結構設計了含有18個核苷酸的反義寡核苷酸序列ANP1、 ANP2、 ANP3、ANP4,并以與人任何基因都不具有同源性的18個核苷酸序列ANP0作為對照。ANPO: 5，AxTxGxTxAyGyTyCyGyTyCyTyGyCyCxTxAxGx3，(式I );ANPh 5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx3，(式II);ANP2: 5， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx3，(式III);ANP3: 5， GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx3，(式IV);ANP4: 5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx3，(式V); 其中，式I至式V中，x均指硫代磷酸酯鍵；y均指3， 5磷酸二酯鍵；A均指2'-脫氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脫氧胞苷；G均指2'-脫氧鳥苷。反義寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4可以于POKEMON基因的mRNA 形成DNA/RNA雜化雙鏈，其可以被RNaseH酶識別、降解。2 、固相合成POKEMON基因反義寡核苷酸根據上述反義寡核苷酸ANPO、 ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4分子式,以及對照 ANPO核苷酸序列，以a位帶硫代磷酸酯鍵的dNTP作為原料,用標準的DNA自動合 成儀合成反義寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和對照寡核苷酸ANPO。將上 述制備得到的反義寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和對照寡核苷酸ANPO分 別經HPLC純化，經紫外分光光度計定量，具體方法為用貝克曼庫爾特 (Beckmancoulter)公司的DU800紫外分光光度計精確測定寡核苷酸的濃度，光徑 10mm的比色杯中，單鏈寡核苷酸在260nm處的消光系數是20ng/ml/lOD.在光徑 10mm的lOOpl微量比色杯，加入98|il純凈水，在260nm和280nm兩個波長處的定 零，然后加入2pl寡核苷酸并混勻，在260nm和280nm兩個波長處測溶液的光吸收,純 的寡核苷酸的A260/A280的比值在1.8至2.0之間，此時在260nm所測的OD值就 是寡核苷酸的濃度0ig/^tl)。上述反義寡核苷酸購自上海生工生物工程技術服務有限 公司。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測寡核苷酸的純度，實驗采用的條件是緩沖溶液 為Tris(三羥甲基氨基甲垸)--硼酸一EDTA,及凝膠濃度30%的變性聚丙酰胺凝膠，通 過分子篩效應電泳分離合成的寡核苷酸及其合成失敗的序列，采用銀染色法顯色呈現 分離的圖譜,該電泳分離方法可以分離僅有一個核苷酸差異的寡核苷酸序列,加上靈 敏的銀染色法顯色技術,能夠有效地檢測到合成失敗的序列.結果顯色圖譜上僅有一 條顯色條帶，表明純化后的反義寡核苷酸純度均高于99%。實施例2、反義寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4對pEGFP-POKEMON 融合蛋白的抑制效果實驗.1、 POKEMON與pEGFP的融合質粒的構建從人宮頸癌HeLa細胞(購自美國典型培養物保藏中心，ATCC number: CCL-2) 中克隆得到POKEMON的閱讀框架片段，將其亞克隆到pEGFP-N2報告質粒中。具 體方法如下所述1)細胞培養人子宮癌(Hda)細胞(購自美國典型培養物保藏中心,ATCC)用含體積分數為 10%的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素及0.2 %NaHC03的DMEM培養 液，在37'C、體積分數為5%的(:02條件下常規培養。DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液非常適合于許多哺乳動物細 胞培養，是由無機鹽組分、氨基酸組分、維生素組分等組成，其具體配方為每L培 養基中含有200.00 mg CaCl2， 0.10 mg Fe(N03)3.9H20， 400.00 mgKCl， 97.67 mgMgS04， 6400.00 mgNaCl， 3700.00 mg NaHC03， 125.00 mg NaH2P04-H20， 4500mg 葡萄糖，15.00mg酚紅(Phenolred) ， llOmg丙酮酸鈉(SodiumPyruvate) ， 84.00 mg L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arginine-HCl) ， 63.00 mg L-胱氨酸二鹽酸鹽(L-Cystine 2HC1) ， 584.00 mgL-谷氨酰胺(L-Glutamine) ， 30.00 mg甘氨酸(Glycine) ， 42.00 mg L-半胱氨酸鹽酸鹽水合物(L-Histidine HC1-H20)， 105.00 L-異亮氨酸(L-Isoleucine) ， 105.00 mg L-亮氨酸(L-Leucine) ， 146.00 mg 賴氨酸鹽酸鹽(L-Lysine-HCl) ， 30.00 mgL-蛋氨酸(L-Methionine) ， 95.00 mgL-蘇氨酸(L-Threonine) ， 16.00 mgL-色氨酸(L-Tryptophan) ， 104.00 mg L-Tyrosine 2Na 2H20， 94.00 mg L國纈氨酸(L-Valine) ， 4.00mg D-泛酸鈣(D-Ca pantothenate)， 4.00mg氯化膽堿(Choline Chloride) ， 4.00mg葉酸(Folic Acid) ， 7.20mg肌醇(i-Inositol)，4.00mg煙酰胺(Niacinamide)，4.00mg維生素B6(鹽酸卩比多辛，Pyridoxine HC1)， 0.40mg維生素B2(核黃素，0.40)， 4.00mg鹽酸硫胺(Thiamine HC1) ， pH 值7.2-7.4。2) 細胞總RNA的提取取出步驟l)培養得到的人子宮癌(Hela)細胞，吸去培養液(懸浮細胞需要離 心)，用適量PBS洗滌，加入lmlTRizol液，混勻，室溫放置5min，吸出培養瓶內 的液體轉移到1.5ml無Rase酶EP管內，每管加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，混勻， 室溫放置2-3min。在12， 000g (2-8°C)離心15min。吸取水相于另一只1.5ml的EP 管內，加入等體積的異丙醇，室溫放置lmin。在12， 000g (2-8°C)離心10min，此 時有RNA沉淀產生，棄去上清，加200-500ul70。/。乙醇洗滌后，在7500g(4"C)離 心5 min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液體。沉淀自然干燥5-10分鐘，DEPC處理水20-30ul 加入，用槍打勻，55-60。C水浴10分鐘讓總RNA完全溶解，測OD值得到人子宮癌 (Hela)細胞總RNA。3) RT-PCR克隆Pokemon以步驟2)得到的人子宮癌(Hela)細胞總RNA進行反轉錄，反應體系20ul， 包括Oligo(dt)l ul，人子宮癌(Hela)細胞總RNA 1 ug, DEPC水，置于7(TC5min， 然后置于冰上5min,加入DEPC水,5x緩沖液4 ul， 25mM MgCL24 ul，加入10mM dNTPl ul, RNA酶抑制劑20U和反轉錄酶1 ul,25。C5min,42T:60min，于70°C 15min終 止反應，得到cDNA。結束后以cDNA作為模版進行PCR。Pokemon基因上游引物5'陽CTTAAGCTTGCCACCATGGCCGGCGGCGTGG-3'， 下游引物5'-CATGATATCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTTAC-3'。 PCR反應體系物各10umol/L,5X緩沖溶液10ul， 2mM dNTP 5 ul,甜菜堿和 DMSO各5 ul， 1 ul cDNA， 2.5U/LPrimer star聚合酶1 ul，總體系50 ul。 PCR循環 條件98。C變性10s， 70。C復性10s， 72。C延伸lmin， 40個循環。把所得PCR產物在70v，進行瓊脂糖電泳，30rnin后，膠置于紫外燈下照射， 小心把DNA片段切下轉入到1.5mlEP管內，稱重EP管，近似確定體積。假設膠的 密度為lg/ml，于是凝膠的體積可通過如下方法的得到如凝膠薄片質量為0.2g，則 體積為0.21111，然后加入等體積的NJ緩沖液，把混合物置于55-65'C水浴中lOmin.， 至膠完全溶解混合均勻。將膠溶解后轉移到膠回收柱內，8000g離心lmin，用SPW 緩沖液重復洗滌2次，最后加入DNA洗脫液將PCR產物洗下，10， OOOg離心lmin。 DNA產量計算把抽提樣品稀釋20倍，在260nm和280nm下測OD值。DNA濃度 =八26。><5(^稀釋倍數。4) POKEMON與pEGFP的融合質粒的構建將步驟3)得到的PCR產物用五coi V和/^'w/in雙酶切與州'"^III和Smfl I雙酶 切后的pEGFP-N2連接得到POKEMON與pEGFP的融合質粒；具體方法如下所示① 將步驟3)得到的PCR產物的酶切PCR產物的酶切為45 ul體系，回收DNA 0.5ug， 4.5 ul 10xbuffer K,0.15 ul HindIII (1.5U/ p1),0.15 ul EcoRV(15U/ n1)，15.2 ul H20， 37"C酶切3小時。② pEGFP-N2質粒酶切和產物純化回收取12plpEGFP-N2質粒，6 jxllOxbuffer M， 6nlHindHI， 5(ilNaAc (3mMPH5.2) ， 150ul乙醇于-20。C10min， 10， OOOg離 心5min,棄上清，沉淀加入55plTE溶解。結束后再加入55 pl TE溶解液，8^1 10xbuffer T， 8 pl BSA， 6 pi Sma I ， 1 pl磷酸酶(CIAP) , 37。C酶切3小時酶切。 酶切結束后，加入等體積NJ緩沖液，8000g， lmin，再加入SPW液8000g，lmin重復 一次，最后加入DNA洗脫液，10， OOOg，lmin.最后得酶切純化產物。③ 酶切純化PCR產物和質粒pEGFP-N2的連接連接體系為40ul， 2 pi pEGFP-N2 (HindIII， Smal ) ， 34plPCR純化產物(HindIII， EcoRV)，置于56。C水浴4min,冰上5min.再加入2 pl T4連接緩沖液，1 |il 50mM ATP, 0.5 pl T4連接酶，16。C連 結過夜。④ 感受態細胞的制備及連接產物的轉化取過夜JM109菌液800 ul， 3000g離心 5min,棄上清，加入5(Hd新鮮LB培養基，用槍吹打均勻，然后加入2^1質粒液Upg/Hl)和2pl的CaCl2，冰上放置30min， 42。C水浴熱休克60-120s，結束后， 放置于冰上2-3min，加入lmlLB液，然后再搖床上搖45min,結束后，在3000g離 心5min，除去部分上清液，剩余大約100 pl左右液體，加入12^1 AMP，滴加平板上進行涂布，正向平板放置30min,然后倒置平板7-8小時。⑤挑克隆并小提陽性克隆細胞在20個LB平板底部標上1， 2， 3， 4....20。取 20只中型離心管，每管加入1.5ML含有(60jng/mL)卡那霉素的LB培養基，用已 經滅菌的牙簽分別挑取上述連接產物轉化后長出的不同菌落在標有數字的平板上劃 線(必須一一對應)，劃線后的牙簽放置于中型的離心管內(也必須是管號和平樣 板上的數字一一對應)，劃線后的培養皿37。C過夜或放置10小時，中型離心管搖床 上過夜(37°C)或者把搖床上培養過夜的液體轉移到新的小離心管內，在3000g離 心6min，棄上清液體，沉淀提取質粒，用5awHI酶切鑒定，篩選連接正確的質粒。 將5amH I酶切鑒定正確的質粒進行測序結果表明，我們己經克隆得到POKEMON 閱讀框架序列，并正確地裝進pEGFP-N2質粒中,將測序表明正確的含有POKEMON片 段的重組質粒命名為pEGFP-N2-POKEMON。pEGFP-N2-POKEMON質粒經轉染進入 細胞中，可表達Pokemon-GFP融合蛋白。2、反義寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4對POKEMON-GFP融合蛋白的 抑制效果以脂質體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作為轉染試劑,將反義寡核苷酸ANP1 、 ANP2、ANP3、ANP4和對照寡核苷酸ANPO(濃度均為40nmol/L)與融合質粒pEGFP--NrPOKEMON共轉染猴腎成纖維COS-7細胞(購自美國典型培養物保藏中心ATCC number: CRL-1651) ， 24h檢測熒光強度。具體方法如下所述1) pEGFP-N2-POKEMON質粒和反義核苷酸共轉染取指數生長期的COS-7細胞，于37'C,包含有10%胎牛血清，青霉素100mg/ml 和鏈霉素100mg/ml的DMEM培養基，在5% C02的培養箱中培養。細胞轉染前一 天，細胞用胰酶消化并用無抗生素的培養基懸浮，以每孔lxl()S個COS-7細胞的密 度鋪入24孔板內繼續培養24小時。培養24小時后，將實施例1制備的反義核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4 和ANP0分別以終濃度均為40nmol/L加入50^1無雙抗的優化培養基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司產品)中混勻靜止5min得到濃度均為 40nmol/L的ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和ANP0溶液,同時取2.5^1脂質體 Lipofectamine-2000加入另外一個含有48.5^1無雙抗的優化培養基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司產品)中混勻靜止5min，結束后將上述 配制的稀釋后的脂質體分別與反義苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液 等體積混合，分別同時補加0.4嗎的pEGFP-N2-POKEMON質粒，然后分別將混和 液按照10(^1 /孔的量加入到上述鋪入COS-7細胞的24孔板內。以ANP0與pEGFP-NrPOKEMON質粒共轉染細胞做對照組，檢測上述實驗組和對照組培養24h 后的熒光強度。上述步驟l)的處理的實驗結果如圖l所示，結果表明，在C0S-7細胞內，共轉 染pEGFP-N2-POKEMON和ANP0、 ANP1、 ANP2、 ANP3或ANP4反義核苷酸。通過 熒光顯微鏡觀察，發現四種的反義核苷酸對Pokemon的抑制存在顯著差異。從圖l中 可看到ANP2 (圖1中C)和ANP4 (圖1中E)熒光強度弱于ANP1 (圖1中B)和ANP3 (圖1中D)的熒光強度，這說明ANP2和ANP4抑制效率比ANP1和ANP3的抑制效率 高。使用Image-proplusv5.02對熒光強度進行分析計算，ANP2和ANP4對pEGFP-N2-POKEMON表達的POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率分別是74n/。和78n/。，同樣說 明，ANP2和ANP4對POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率比ANP1和ANP3的抑制效 率高，并且ANP4抑制效率最高，將抑制效率最高的ANP4被確定為內源效應的研究 序列。其中，圖l中A為對照(ANP0)與pEGFP-NrPOKEMON質粒共轉染結果，B為 ANP1與pEGFP-N2-POKEMON質粒共轉染結果，C為ANP2與pEGFP-N2-POKEMON 質粒共轉染結果，D為ANP3與pEGFP-N2-POKEMON質粒共轉染結果，E為ANP4與 pEGFP-NrPOKEMON質粒共轉染結果。實施例3、反義寡核苷酸對POKEMON基因表達mRNA的影響以Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作為轉染試劑，將反義寡核苷酸ANP4 (濃度 為100nmol/L)轉染到MCF-7細胞(購自美國典型培養物保藏中心,ATCC number: HTB-22)中，具體方法如下所述取指數生長期的MCF-7，分別用包含有質量百分含量為10%胎牛血清，青霉素 100mg/ml和鏈霉素100mg/ml的DMEM培養基，于37"C， 5% <:02的培養箱中培養。細 胞轉染前一天，細胞用胰酶消化并用無抗生素的DMEM培養基懸浮，以每孔lx105 個/細胞密度鋪入24孔板內繼續培養24小時。培養24小時后，將5jLil濃度為2pmol/L的反義核苷酸ANPl、 ANP2、 ANP3、 ANP4 或ANP0分別加入45^L無雙抗的優化培養基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO/BRL公司產品)中混勻靜止5min得到反義核苷酸ANPl、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液，同時取2.5ixlLipofectamine-2000加入另外一個含有48.5pl無雙抗 的優化培養基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司產品)中混 勻靜止5min得到脂質體溶液，結束后把脂質體溶液分別與反義苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液等體積混合，然后分別將混和液按照100pl/孔的量加入到 上述鋪入MCF-7細胞的24孔板內，繼續培養24h或48h，以上述轉染ANP0反義核苷酸的細胞做對照組。轉染48小時后，分別用RT-PCR檢測轉染細胞中的POKEMON基因mRNA含量， 具體方法如下所述(1)取出轉染后的MCF-7細胞，吸去培養液，用適量PBS洗滌，加入lmlTRizol 液，混勻，室溫放置5min，吸出培養瓶內的液體轉移到1.5ml無Rase酶EP管內。每管 加入0.21111氯仿，劇烈震蕩15s，混勻，室溫放置2-3min。在12， OOOg (2畫8。C)離心 15min。吸取水相于另一只1.5ml的EP管內，加入等體積的異丙醇，室溫放置lmin。 在12， OOOg (2-8°C )離心10min，此時有RNA沉淀產生。棄去上清，加200-500ul 70% 乙醇洗滌后，在7500g(4")離心5min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液體。沉淀自然干燥 5-10分鐘，DEPC處理水20-30ul加入，用移液槍打勻，55-6(TC水浴10分鐘讓總RNA 完全溶解，測OD值計算總RNA濃度。(2)半定量RT-PCR:反應體系20pl，包括Oligo(dT)l 上述提取的轉染后的 MCF-7細胞總RNA 1 |ig,補加DEPC水至5pl，置于7(TC5min.置于冰上5min,然后，加 入DEPC水4.5p1, 5x轉錄緩沖液4pl， 25mMMgCl24 pl，加入10mM dNTPl RNA酶 抑制劑(40U4U) 0.5jxl和反轉錄酶l |xl， 25。C5min,42。C60min,于70。C15min終止反應，得 至lJcDNA。以上述得到的cDNA作為模版，以半定量Pokemon基因上游引物 5'-TGCAAGGTCCGCTTCACCAG-3'，下游引物5'-GGCTGTGAAGTTACCGTCG GTG-3'，內參GAPDH的上游引物5'-CAACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'，下游 引物5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGG-3為弓|物進行PCR擴增。PCR擴增體系為Pokemon和GAPDH的上、10 nmol/L下游引物各為2pl， 5XPrimer star緩沖溶液5ul， 2mMdNTP2n1,， 1 |ilcDNA， 2.5U/LPrimer star聚合酶0.5 ul，水7.5pl， 總體積20ul。半定量Pokemon的PCR循環條件98。C變性10s， 60。C復性10s， 72。C延伸40s， 24 個循環，GAPDH的PCR循環條件98。C變性10s, 60。C復性10s， 72。C延伸30s， 22個 循環。PCR產物跑l。/。的瓊脂糖膠，經溴化吡咬(Ethidium Bromide)染色。拍照后， 圖片可用Quantity One軟件分析。結果如圖2所示，結果表明轉染反義寡核苷酸ANP4的細胞中POKEMON基因 mRNA含量為未轉染細胞中的40X。結果表明反義寡核苷酸ANP4對POKEMON基因 mRNA具有明顯的降解作用。其中，圖2中A中的0代表ANP0， 1代表ANP1， 2代表 ANP2， 3代表ANP3， 4代表ANP4;圖2中B中+代表正常MCF-7細胞， 一代表ANPO。實施例4、反義寡核苷酸對POKEMON蛋白表達水平的影響 按照實施例3的方法以脂質體Lipofectamine2000 (Invitrogen)作為轉染試劑，將 反義寡核苷酸ANP4 (濃度為100nmol/L)轉染到MCF-7細胞(購自美國典型培養物 保藏中心，ATCC保藏編號HTB-22)中，轉染48小時后用Westem-blot檢測 POKEMO蛋白表達水平，具體方法為如下所述取6孔板內反義核苷酸ANP4轉染48h的MCF-7細胞，用胰酶室溫消化3-5min， 用PBS洗滌于2000rpm,離心5min,棄上清，視沉淀的量加入合適體積(約30-50 ^) TNE (10mmol/L， 150mMNaCl， 0.5%NP-40, lmM)裂解液置于冰上裂解30min。 裂解液在10(TC水浴煮10min，上等量蛋白跑10%聚丙烯酰胺電泳，100v， 3h。電泳 結束后，通過半干轉膜儀，在10v， 25min，將蛋白轉移到膜上。轉膜結束后，加入 麗春紅S染色，確定轉膜的效果。用自來水洗去麗春紅，將轉膜分為兩組，每組三個 凝膠孔，分別加入抗Pokemon抗體(多抗，購自Sigma公司，1: 4000稀釋)或者抗P53 抗體(單抗，購自Santa Cruz公司，h 500稀釋)。分別用一抗室溫孵育lh或4。C過夜， 一抗孵育結束后，用TBST洗滌3次，每次5min,然后，孵育過Pokemon抗體的膜放入 加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(1: 2000稀釋)的TBST中，孵育過P53抗體的 膜放入加山羊抗小鼠二抗(1: 2500稀釋)的TBST中，分別室溫孵育2h,孵育結束后 同樣用用TBST洗滌3次，每次5min。然后用Super Signal WestPico Chemiluminesent底 物試劑盒的試劑顯影，并在暗室中用x光片感光5min。結果如圖3所示，結果表明，轉染反義寡核苷酸ANP4的細胞中POKEMON蛋 白表達水平較未轉染細胞中具有明顯降低，表明反義寡核苷酸ANP4對POKEMON基 因蛋白表達具有明顯的抑制作用。由于ANP4對POKEMONP表達具有明顯的抑制作 用，解除了POKEMONP對P53表達的抑制作用,導致POKEMON下游基因P53表達增 高,P53在蛋白水平升高。其中，圖3中A為在MCF-7細胞內反義核苷酸ANP4對 Pokemon蛋白水平的抑制效果；圖3中B為在MCF-7細胞內反義核苷酸ANP4對P53蛋 白水平的增高效果。圖3中A和B中"一"均為ANP0; ANP4均代表反義核苷酸ANP4。實施例4、流式細胞儀檢測反義寡核苷酸ANP4對人乳腺癌細胞MCF-7和肝癌 HepG-2細胞(購自美國典型培養物保藏中心,ATCC number: HB 8065)的作用以Lipofectamine 2000 (Invi加gen)作為轉染試劑，將反義寡核苷酸ANP4 (濃 度為100nmol/l)或ANP0(濃度為100nmo1/1)分別轉染到MCF-7細胞或肝癌HepG-2 細胞中，轉染48小時后，用流式細胞PI單染的方法檢測MCF-7細胞周期的變化， 具體方法如下所述取24孔板內反義核苷酸ANP4轉染48h的MCF-7細胞或肝癌HepG-2細胞(實驗組)和ANPO轉染48h的MCF-7細胞或肝癌HepG-2細胞(對照組)，于PBS中 洗2次，然后500 ul加入70%乙醇并混勻，于4度下固定2h。檢測時標本lOOOr/min 離心5min,棄上清液，400 ul PBS重懸5min。以300目篩網過濾細胞懸液以除去成團 的細胞群，再于1000r/min下離心5分鐘，棄上清液。加入PI染液200 ul/管，4度 下避光30分鐘。把液體轉移到流式管內并加400ulPBS。利用流式細胞儀測定細胞 內DNA分布情況，單光束，激發波長為488nm。結果如圖4所示，在100nmol/L ANP4分別轉染MCF-7和HepG-2細胞,通過流 式細胞儀檢測由圖可發現(圖4B和圖4D) ， MCF-7和HepG-2細胞的G2/M期DNA 百分比分別增加2.6%和10%，同時G。/G!期DNA含量也分別增加1.92%和4.21%。 我們結果顯示藥物作用Pokemon基因后，導致細胞發生細胞周期阻滯，特別是在 G2/M期。而目前廣泛認為，細胞在從G2/M期阻滯退出的過程中或之后,部分細胞發 生凋亡,部分未凋亡的細胞則直接進入"分裂期死亡(mitotic death)"，而對照組沒有達 到該效果，說明以ANP4為有效成分的藥物可以有效治療乳腺癌和肝癌，特別是對 乳腺癌具有非常好的療效。圖4為用流式細胞儀檢測ANP4對MCF-7和HepG-2(購 自美國典型培養物保藏中心，ATCC number: HB 8065)細胞生長的影響圖，用流式細 胞儀檢測細胞的熒光，橫軸代表熒光強度，縱軸代表細胞數量。其中，圖4A和圖 4B代表AMCF-7細胞，圖4C和圖4D組代表HepG-2細胞，圖4A和圖4C細胞用 10Onmol/L寡核苷酸ANPO處理，作為對照組，圖4B和圖4D細胞用10Onmol/L寡核 苷酸ANP4處理，作為實驗組。
權利要求
1、一種抑制POKEMON基因表達的反義寡核苷酸，其分子式為5’TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3’其中，x均指硫代磷酸酯核苷間鍵；y均指磷酸二酯核苷間鍵；A均指2’-脫氧腺苷；T均指胸苷；C均指2’-脫氧胞苷；G均指2’-脫氧鳥苷。
2、 含有權利要求1所述的反義寡核苷酸的藥物。
3、 根據權利要求2所述的藥物，其特征在于所述藥物為以權利要求l所述的反義寡核苷酸為有效成分的治療癌癥的藥物。
4、 根據權利要求3所述的藥物，其特征在于所述癌癥為乳腺癌。
5、 根據權利要求4所述的藥物，其特征在于所述藥物通過經脈或皮下給藥治療。
6、 根據權利要求5所述的藥物，其特征在于所述藥物通過局部給藥治療。
7、 根據權利要求6所述的藥物，其特征在于所述給藥治療與放射療法結合。
8、 根據權利要求6所述的藥物，其特征在于所述給藥治療與化學療法結合。
全文摘要
本發明公開了一種治療乳腺癥的藥物及其專用反以寡核苷酸。該其反以寡核苷酸的分子式為5′TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3′，其中，x均指硫代磷酸酯核苷間鍵；y均指磷酸二酯核苷間鍵；A均指2′-脫氧腺苷；T均指胸苷；C均指2′-脫氧胞苷；G均指2′-脫氧鳥苷。該治療乳腺癥的藥物是以所述反以寡核苷酸為有效成分的藥物。本發明的以上述反義寡核苷酸為有效成分的藥物可有效治療人乳腺癌。
文檔編號C12N15/11GK101275134SQ20081008905
公開日2008年10月1日 申請日期2008年4月15日 優先權日2007年4月20日
發明者楠 張, 蔣宇揚, 謝振華 申請人:清華大學深圳研究生院