專利名稱：伴放線放線桿菌rRNA及其毒力因子多重PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種口腔常見病原菌伴放線放線桿菌及其三種毒力因子多重PCR快速檢測 方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
伴放線放線桿菌(Aa)是一種革蘭氏陰性球桿菌，是牙周炎特別是青少年牙周炎的主要病 原菌，是局限性侵襲性牙周炎的重要致病菌，也可引起一些嚴重的全身感染，如亞急性細菌 性心內膜炎、心包炎、肺炎、腦膜炎、敗血癥、骨髓炎、膿毒性關節炎、尿路感染以及身體 各部位的膿腫，如腦、腹、面、其它器官和肢體的膿腫，但也經常存在于牙周健康的個體中， 其致病性與不同菌株的毒力有關。1999年美國牙周病學會公布的新的牙周病分類標準將Aa 列為侵襲性牙周炎的實驗室參考診斷指標。目前已知的血清型是a、 b、 c、 d、 e，在口腔中 最多見的是a、 b、 c型，占80%，血清型b與牙周炎有關，c型特別常見于牙周健康者中， 也可引起非口腔感染，而我國人群口腔中分離出的以c型為主，b型較少。由于Aa的致病 性，使得成功的分離鑒定Aa越來越重要了。
最近研究發現某些特殊基因型的菌株與牙周炎或牙齦健康有關，Aa可產生多種毒力因 子，如白細胞毒素LTX，細胞致死性膨脹毒素CDT、菌毛相關蛋白等，可引起組織細胞破 壞、機體免疫系統損傷而致病。不同的臨床分離株可產生不同的毒力因子，這與其毒力基因 的攜帶及表達水平存在差異有關，直接檢測Aa的毒力基因，了解不同Aa的感染與臨床指 標之間的關系，有助于闡明其致病機理。
菌毛是Aa的一個重要致病因子，與Aa的粘附、定植有關，由菌毛相關蛋白(FLP)基因 編碼，是Aa粘附牙周組織的主要成分，對Aa其它致病因子如白細胞毒素、脂多糖等有一定 的調節作用，有菌毛的菌株對羥基磷灰石的粘附能力是無菌毛菌株的3-4倍。動物模型研究 表明Aa菌毛與牙槽骨吸收也有一定關系，在牙周病的發生發展中起重要作用。FLP引物可擴 增菌毛蛋白中的主要亞單位FLP-1的基因片段，擴增產物有2種， 一種能產生363bp的PCR產 物為FLP1型， 一種能產生179bp的產物為FLP2型，血清型a多為FLPl型，而血清型b多為FLP2 型。
白細胞毒素是Aa的一個重要毒力因子，LKT只對靈長類動物(人和猴)的白細胞有毒性， 對其它種類的動物則不表現出白細胞毒性。LKT產生后先與中性多核白細胞和單核巨噬細 胞的細胞膜結合，細胞表面出現多個小孔，膜表面皺褶消失，膜損傷導致細胞死亡，溶酶體 外溢，釋放出酶性和非酶性介質造成局部組織破壞；中性多核白細胞和單核巨噬細胞被殺傷， 又使局部的免疫防御功能下降，有利于Aa及其它牙周微生物的入侵和生長繁殖。LKT引物可 擴增白細胞毒素A亞單位的啟動子基因，預期擴增產物片段為262bp，研究發現其患者年齡 較小，與LKT陰性的患者比較，兩者有極顯著差異，提示該毒素在青少年口腔Aa感染致病過 程中可能起至關重要的作用。
CDT是一種不耐熱的蛋白，是具有免疫抑制作用的細胞周期調節蛋白，能引起某些細胞 系進行性的膨脹和死亡，CDT可改變細胞形態，使真核細胞特征性膨脹，并引起細胞周期
阻滯，誘導淋巴細胞凋亡，CDT也使正常的活化淋巴細胞死亡率顯著增加，在細菌逃避牙 周袋內的細胞免疫反應中發揮重要作用。CDT引物可擴增細胞致死性膨脹毒素的基因片段， 擴增產物也有兩種，CDT1型能產生667bp的擴增產物，CDT2型則產生1893bp的擴增產物， 研究發現血清型a多為CDT2型，而作為血清型b的Y4株因有1226bp的片段缺失而為CDT1型。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種口腔致病菌伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相 關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的基因的多重PCR快速檢測方法，僅通過一次 PCR擴增就可同時檢測上述四種基因。
一種口腔致病菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于，采用多重PCR擴增口腔致病菌中 編碼伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的特異 基因，再通過電泳檢測特異基因。
所述多重PCR擴增口腔致病菌中編碼伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細 胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的特異基因，包括如下步驟
1) 采用熱裂解法提取DNA模板，具體步驟如下
挑取口腔中待測菌置于200^1裂解緩沖液中，IO(TC水浴10min，取3nl清液，即得模板 DNA，留存備用；
2) 多重PCR擴增伴放線放線桿菌16SrRNA、菌毛相關蛋白、白細胞毒素和細胞致死性 膨脹毒素的特異基因，具體步驟如下
反應體系總體積為25pl
H2014.25pl，
緩沖液(10xPCR)2.5pl，
MgCl2 (25mM)2pl，
dNTP (0.2pM)l^il,
引物混合液(10pM)2pl，
DNA聚合酶(0.5U)0.25^1,
模板DNA
引物
伴放線放線桿菌16SrRNA基因引物為
Pasl 5' -AAACCCATCTCTGAGTTCTTCTTC-3';
Pas2 5' -ATGCCAACTTGACGTTAAAT-3';
PCR產物長度為551bp; 菌毛相關蛋白基因的引物為
FLP1 5，-AGCCACTTTCATCTGCGCTGG-3，；
FLP2 5 ，-ATTGC ATCTAGTCTCTTTCG-3';
FLP1型產生363bp的擴增產物，FLP2型產生179bp的擴增產物; 白細胞毒素基因的引物為
LKT1 5'-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3，； LKT2 5'-TTTAGAAATGGTAGAATAAT國3，；
PCR產物的長度為262bp; 細胞致死性膨脹毒素基因的引物為
CDT1 5 ， -GTC AACGAAGCTCCC AAGAACGCT-3';
CDT2 5'-TGTACCTCTCCTTAGATCCATCCT-3，；
CDT1型產生667bp的擴增產物，CDT2型產生1893bp的擴增產物；
PCR反應循環參數為
94。C3min; 94。C30sec、 55。C30sec、 72。C40sec， 30個循環；最后72。C延伸7min; 吸取14.25^1無菌去離子水加至微離心管中，再依次加入10xPCR緩沖液2.5^, 25mM MgCl2 2pl， 0.2pM dNTPlpl， IO"M引物混合液2^il, 0.5U DNA聚合酶0.25^1,模板DNA3pl，
將微離心管置于離心機，10000轉/分離心混勻1分鐘，再將微離心管放入PCR儀中，按照 設定的參數進行PCR擴增反應；制得特異基因溶液。 3)電泳檢測鑒定
對上述特異基因溶液進行電泳檢測，電泳圖中含有長度為551bp、 363bp、 179bp、262bp、 667bp或1893bp相應特征位置條帶的一種或多種，分別對應于樣本含有伴放線放線桿菌16S rRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的基因的一種或多種。
所述步驟1)中的裂解緩沖液為1.Ommol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1. 0% Triton(聚乙 二醇辛基苯基醚)X-100, 10mmol/L Tris (三羥甲基氨基甲垸)_HC1， pH8. 0。
所述步驟3)電泳檢測鑒定的具體操作方法如下
以TAE緩沖液配制1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，待冷卻至50 6(TC時， 加入溴化乙錠，使溴化乙錠終濃度為lpg/ml，充分混勻，倒入膠膜中，放好梳子，待膠凝固 后，移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入TAE緩沖液，使液面高出凝膠表面1 2mm;再 將PCR擴增后的特異基因溶液與TAE緩沖液以1: IO體積比混合，用微量移液器將該混合 液(樣品)依次加入加樣孔內，蓋上電泳槽并通電，80V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移 動，電泳25 35min后，切斷電源，取出凝膠，在紫外光下觀察。電泳圖中含有長度為551bp、 363bp、 179bp、 262 bp、 667bp或1893bp相應特征位置條帶的一種或多種，分別對應于樣 本含有伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的基 因的一種或多種，根據是否含有相應特征位置條帶的出現判斷樣本中是否有放線放線桿菌的 感染及其感染菌株的毒力因子，從而判斷細菌的基因型。
TAE緩沖液為含EDTA(pH8. O)和Tris-鹽酸的緩沖液，為本領域常用試劑。 本發明所提及的操作方法、培養基和實驗試劑如無特別說明，均為本領域常規操作、培 養基和市售試劑。
本發明涉及的伴放線放線桿菌及其三種毒力因子的多重PCR快速檢測方法在應用中， 反應條件一致，方法敏感、特異性強，僅通過一次PCR反應，就能對伴放線放線桿菌16S rRNA 及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素同時進行檢測鑒定，準確判斷細菌的基 因型，大大提高了檢測的速度和效率，大大節約了判斷時間。
圖1為通過本發明所記載的方法進行檢測的電泳結果圖。
其中圖1中，M)標記；l)伴放線放線桿菌16SrRNA基因+菌毛相關蛋白基因+細 胞致死性膨脹毒素基因；2)伴放線放線桿菌16SrRNA基因+菌毛相關蛋白基因+白細
胞毒素基因；3)伴放線放線桿菌16SrRNA基因+菌毛相關蛋白基因+白細胞毒素基因； 4)伴放線放線桿菌16S rRNA基因+菌毛相關蛋白基因；5)伴放線放線桿菌16S rRNA 基因+菌毛相關蛋白基因；6)伴放線放線桿菌16SrRNA基因+菌毛相關蛋白基因+細 胞致死性膨脹毒素基因。
具體實施例方式
實施例
下面結合圖1和實施例對本發明作進一步的描述，但本發明保護范圍不僅限于此。
(1) 牙周袋及齦溝標本的采集采用無菌紙尖法從患者牙周袋內最深處或牙周健康者 牙齦溝內分別采集標本，具體采集方法如下常規清水漱口后，生理鹽水沖洗去除食物殘渣， 吹干，棉球隔濕，局部用2.5%碘酊棉球消毒，將1片無菌紙尖插入牙周袋內或齦溝內，當
有阻力時停止插入，停留30s后取出，置于厭氧轉送培養基中，4'C保存，3h內轉種培養基。
(2) 細菌培養將厭氧轉送培養基中的無菌紙尖標本取出，接種于TSBV選擇性培養 基上，在10%H2、 10%CO2禾卩80%N2的厭氧環境中培養3-5天，凡能在TSBV選擇性培 養基上生長，葡萄糖、甘露糖發酵試驗陽性，乳糖發酵試驗陰性，氧化酶試驗陰性，觸酶試 驗陽性的革蘭氏陰性球桿菌則鑒定為Aa。
(3) 模板DNA的制備挑取菌落置于200nl裂解緩沖液(1.0mmol/L EDTA， 1.0% Triton X陽100，10mmol/L Tris-HCl,pH8.0)中，10(TC7K浴lOmin，取3 u 1上清液直接作為PCR的模 板。
(4) 多重PCR反應25^1反應體積，14.25pl H20， 2.5pl 10xPCR buffer, 2pl 25mM MgCl2， lpl0.2uMdNTP， 2pl 10uM引物混合液，0.25pl 0.5U Taq酶，3pl模板DNA。
進行PCR擴增時，伴放線放線桿菌的16S rRNA基因的上下引物分別為Pasl 5' -AAACCCATCTCTGAGTTCTTCTTC-3'和Pas2 5' -ATGCCAACTTGACGTTAAAT-3'， PCR產物長度為551bp;菌毛相關蛋白的上下游引物分別為FLP1 5'-AGCCAC TTTCATCTGCGCTGG-3 ，和FLP2: 5，-ATTGCATCTAGTCTCTTTCG-3，， 擴增產物有2種， 一種能產生363bp的PCR產物為FLP1型， 一種能產生179bp的產物為FLP2型；白細胞毒 素基因的上下游引物分別為LKT1 5'-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3，和LKT2 5'-TTTAGAAATGGTAGAATAAT-3', PCR產物的長度為262bp;細胞致死性膨脹毒素基因 的上下游引物分別為CDT1 5'-GTCAACGAAGCTCCCAAGAACGCT-3，和CDT2 5'-TGTACCTCTCCTTAGATCCATCCT-3，， PCR擴增產物也有兩種，CDT1型能產生667bp 的擴增產物，CDT2型則產生1893bp的擴增產物。
PCR反應循環參數為94。C5min; 94。C30sec、 55。C30sec、 72。C40sec， 30個循環；最 后72。C延伸7min。
用含lpg/ml溴化乙錠1.2%瓊脂糖凝膠電泳，根據權利要求書1所述伴放線放線桿菌及 其三種毒力因子，其特征在于所述的圖譜分析，根據是否含有相應特征位置條帶的出現判斷 樣本中是否有放線放線桿菌及其毒力因子菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素
的存在，從而判斷細菌的基因型。
(5) 電泳檢測鑒定 對上述特異基因溶液進行電泳檢測，
以TAE緩沖液配制1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，待冷卻至50 60'C時，
加入溴化乙錠，使溴化乙錠終濃度為^g/ml，充分混勻，倒入膠膜中，放好梳子，待膠凝固 后，移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入TAE緩沖液，使液面高出凝膠表面l 2mm;再 將PCR擴增后的特異基因溶液與TAE緩沖液以1: IO體積比混合，用微量移液器將該混合 液(樣品)依次加入加樣孔內，蓋上電泳槽并通電，80V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移 動，電泳25 35min后，切斷電源，取出凝膠，在紫外光下觀察。電泳圖中含有長度為551bp、 363bp、 179bp、 262 bp、 667bp或1893bp相應特征位置條帶的一種或多種，分別對應于樣 本含有伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的基 因的一種或多種，根據是否含有相應特征位置條帶的出現判斷樣本中是否有放線放線桿菌的 感染及其感染菌株的毒力因子，從而判斷細菌的基因型。
如圖1所示，在1道有363bp、 551bp和1893bp的條帶，因此含有能夠表達伴放線放線 桿菌16S rRNA、菌毛相關蛋白和細胞致死性膨脹毒素的基因；2道有262bp、 363bp和551bp 的條帶因此含有能夠表達伴放線放線桿菌16SrRNA、白細胞毒素和菌毛相關蛋白的基因；3 道有179bp、 262bp和551bp的條帶因此含有能夠表達伴放線放線桿菌16S rRNA、菌毛相關 蛋白和白細胞毒素的基因；4道有551bp和179bp的條帶因此含有能夠表達伴放線放線桿菌 16S rRNA和菌毛相關蛋白的基因；5道有363bp和551bp的條帶因此含有能夠表達菌毛相 關蛋白和伴放線放線桿菌16S rRNA的基因，6道有363bp、 551bp和667bp的條帶因此含有 能夠表達菌毛相關蛋白、伴放線放線桿菌16SrRNA和細胞致死性膨脹毒素的基因。
序列表
<110〉 肖水清
〈120〉伴放線放線桿菌rRNA及其毒力因子多重PCR檢測方法 〈160〉 8
〈170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 1
AAACCCATCT CTGAGTTCTT CTTC 24
〈210〉 2
〈211〉 20
<212> DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 2
ATGCCAACTT GACGTTAAAT 20
〈210〉 3 〈211〉 21 〈212〉 順 〈213>人工合成 〈400〉 3
AGCCACTTTC ATCTGCGCTG G 21
〈210〉 4 〈211> 20 〈212〉 腿 〈213〉人工合成 〈400〉 4
ATTGCATCTA GTCTCTTTCG 20
〈210〉 5 〈211〉 23 <212> 歸 <213>人工合成 〈400〉 5
CAAATGCTTG TGTCAATAAT ACT 23
〈210〉 6 〈211> 20 〈212〉 DNA 〈213>人工合成 <400> 6
TTTAGAAATG GTAGAATAAT 20
〈210〉 7 <211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 7
GTCAACGAAG CTCCCAAGAA CGCT
〈210〉 8 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 8
TGTACCTCTC CTTAGATCCA TCCT
權利要求
1、一種口腔致病菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于，采用多重PCR擴增口腔致病菌中編碼伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的特異基因，再通過電泳檢測特異基因。
2、 如權利要求1所述的多重PCR快速檢測方法，其特征在于，所述多重PCR擴增口腔 致病菌中編碼伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒 素的特異基因，包括如下步驟1)來用熱裂解法提取DNA模板，具體步驟如下-挑取口腔中待測菌置于200μl裂解緩沖液中，100℃水浴10min,取3pl清液，即得模板 DNA,留存備用；1)多重PCR擴增伴放線放線桿菌16SrRNA、菌毛相關蛋白、白細胞毒素和細胞致死性 膨脹毒素的特異基因，具體步驟如下反應體系總體積為25μlH2014.25nl,緩沖液(10xPCR)2單MgCl2 (25mM)2pl，dNTP (0.2岸)lpl，引物混合液(lOpM)2nl，DNA聚合酶(0.5U)0.25nl,模板DNA3^1;引物伴放線放線桿菌16SrRNA基因引物為Pasl 5' -AAACCCATCTCTGAGTTCTTCTTC-3';Pas2 5' -ATGCCAACTTGACGTTAAAT-3';PCR產物長度為551bp; 菌毛相關蛋白基因的引物為FLP1 5'-AGCCACTTTCATCTGCGCTGG-3，；FLP2 5 ，-ATTGCATCTAGTCTCTTTCG-3 ，；FLP1型產生363bp的擴增產物，FLP2型產生179bp的擴增產物； 白細胞毒素基因的引物為UCT1 5 ，-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3 ，；LKT2 5，-TTTAGAAATGGTAGAATAAT-3，；PCR產物的長度為262bp; 細胞致死性膨脹毒素基因的引物為CDT1 5'-GTCAACGAAGCTCCCAAGAACGCT-3，；CDT2 5 ，-TGTACCTCTCCTTAGATCCATCCT-3';CDT1型產生667bp的擴增產物，CDT2型產生1893bp的擴增產物；PCR反應循環參數為94℃3min; 94℃30sec、 55℃30sec、 72℃40sec， 30個循環;最后72℃延伸7min;吸取14.25pl無菌去離子水加至微離心管中，再依次加入10xPCR緩沖液2.5pl， 25mM MgCl2 2(il， 0.2pM dNTPlnl， lOpM引物混合液2pl， 0.5U DNA聚合酶0.25W，模板DNA3pl， 將微離心管置于離心機，10000轉/分離心混勻l分鐘，再將微離心管放入PCR儀中，按照 設定的參數進行PCR擴增反應；制得特異基因溶液；3)電泳檢測鑒定對上述特異基因溶液進行電泳檢測，電泳圖中含有長度為551bp、 363bp、 179bp、 262 bp、 667bp或1893bp相應特征位置條帶的一種或多種，分別對應于樣本含有伴放線放線桿菌16S rRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的基因的一種或多種。
3、 如權利要求2所述的多重PCR快速檢測方法，其特征在于，所述步驟l)中的裂解緩 沖液為1.Ommol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1. 0% Triton(聚乙二醇辛基苯基醚) X-IOO， 1Ommol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HC1， pH8. 0。
4、 如權利要求2所述的多重PCR快速檢測方法，其特征在于，所述步驟3)電泳檢測鑒定的具體操作方法如下以TAE緩沖液配制1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，待冷卻至50 60℃時， 加入溴化乙錠，使溴化乙錠終濃度為lpg/ml，充分混勻，倒入膠膜中，放好梳子，待膠凝固 后，移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入TAE緩沖液，使液面高出凝膠表面1 2mm;再 將PCR擴增后的特異基因溶液與TAE緩沖液以1: 10體積比混合，用微量移液器將該混合 液(樣品)依次加入加樣孔內，蓋上電泳槽并通電，80V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移 動，電泳25 35min后，切斷電源，取出凝膠，在紫外光下觀察。
全文摘要
本發明涉及一種口腔常見病原菌伴放線放線桿菌及其三種毒力因子多重PCR快速檢測方法，屬于分子生物學技術領域。它采用多重PCR擴增口腔致病菌中編碼伴放線放線桿菌16SrRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素的特異基因，再通過電泳檢測特異基因。本發明方法敏感、特異性強，僅通過一次PCR反應，就能對伴放線放線桿菌16S rRNA及菌毛相關蛋白、白細胞毒素、細胞致死性膨脹毒素同時進行檢測鑒定，準確判斷細菌的基因型，提高了檢測的速度和效率，大大節約了判斷時間。
文檔編號C12Q1/04GK101343668SQ20081013955
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月22日 優先權日2008年8月22日
發明者毅 劉, 王建寧, 肖水清 申請人:肖水清