專利名稱：角膜常見致病真菌菌種檢測的液相芯片系統及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于^f生t^測真菌領域，具^及一種角膜常ja^病真^t檢測的液 相芯片系艦離測方法。
背景技術：
真菌性角膜炎是一種世界范圍內常見的致盲性眼病，多見于以^A口為主的皿 中國家，如中國、印度、加納等。其發病者多為青tt^人群，給社會和家^t成了、驢 的經濟、樹申負擔。近年來隨著廣譜抗生素、^m^麟、免,制劑和拋中鵬物的廣 鵬用，致病性真菌感染的機率大;Ui加，相關統計麵顯示真菌性角膜炎在我國感染
性角,中所占比例高恐4.8% 61.9% (LbdnXie，改al. Ophthalmology, 2006， 113:1943—1948.翟華，.中華醫學雜志^007,87 (33) :2372-2374.)。所以，真菌性角膜 炎的早期診斷對防盲、治盲意義重大，只有早期及時確診，才倉腿免不合理用藥，并根 據感染的菌種不同而選擇^M的手術BtRS手術^:。
臨床上常用的真菌診斷方飽括角膜刮片鏡檢、真菌培養、共焦顯微鏡檢查、組織 病理檢查等，雖然種類不少，但除了真菌i錄外，各種診斷方法tl^能將真菌鑒定至種 的水平，無助于臨床上根據 真節中屬選掛目應的敏 物，或根據不同種屬在角膜 中水平和垂直的不同生長方^^擇^t的手術方式。而唯一能鑒定真節中屬的真菌培養 對去賺時過詢通常需5 7天)，不f調于臨床早期診斷;基于聚合 鵬(polymerase chain reacti叫PCR)的一^T生物學診斷方法因其操作，，假附性率高，使其臨床 細存在一定的難度；而作為固相芯片的基因芯片技術則由于重復瞎，技術障礙尚難 以剠艮。因此，早斯腿診斷真菌性角膜炎并鑒定種屬是非常必要的。
現代液相芯片技術(Multi-Analyte Suspension Array, MASA)是一種新型的基因芯片 技術。該技術的核心是把熒光編碼的孚L^微球分別與特異性的檢泖MI十偶聯，然后在懸 液中加入微量標4^特異性檢測微^S行結合，結合的結果經激光判讀后由 以 形式記錄下來。該技術具有高特異性、高靈敏、反iSM、所需樣本量少的特點。目 前基于液相芯片技術的基因分型、組織分MS病毒和細菌感染I^^等方面已經有相應
的檢驗方法，迄今沒有檢測角ra:病性真臓中的液相核酸芯片系^S^t測方法，因
此無法實現早期'鵬診斷真菌性角膜炎并鑒定種屬。
發明內容
本發明的目的^it共一種角膜常ja^病真臓中檢測液相芯片系統，以早期'i^i檢 觀桷膜常鵬病真臓中，剠艮已有技術的不足。
本發明的另一個目的是'I^i而有效的實現同時檢測多種真^m種。本發明所采用的S^路線是本發明專門，出5種致真菌性角膜炎的80%左右的
致病真幽幽種:茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、串3^^刀菌(Fusariummoniliforme)、 ^ S鐮刀菌(Fusarium o ^sporum)、煙曲霉菌(Aspergillus fiimigatus)禾n黃曲霉菌 (Aspergillus flavus)。運用生物信息學知i辯財目關的生tKt息學軟件，對在核^j^列庫 中會辦檢索到的上3Si要角ra:病真菌的汲NA基因序列進行同源性分析，找出保守區 和可變區(rrs區)，設計出針對，節中的5條,異性^f十和2條M^^I十。M 櫞tiW;與不同熒光編碼的微球進行偶聯制成5灘異性微球偶辦，即液相芯片。最
后，偶聯有不同探針的不同熒光編碼的微球偶辦育辦特異性的i鄉湘應真0^種基因 組DNA的鵬引物(生物素fei己)的PCR擴增,，PCR擴增產物再與麟親和素-
藻紅蛋白報告好結合，微球偶^^PCRj^ti-報告好混^^M:液相芯片檢測儀
(LuminexlOO)，以紅色激光#^±^微球上的紅色分類熒光，依據微球的fe^不同確 定真菌辦幅鄉，以鄉ife激光纖藻紅蛋白，測定微球上結合的報告熒光好的M， 用于間翻定微球上結合的PCR,的賴；因此，Mi!紅z郷色激光的同0t^測，可 以確定真難種的種類和體。 本發明的具#^術方案如下
本發明所涉及的角膜常jra病真^t種檢測液相芯片系統由微球、種特異性^f十和 M^探辦賊，辦征是，戶脫商品化微球是3、 5、 7、 20、 35、 47、 79號的羧S^微 球；戶;m計并合成的種特異性徽MSWf序列如下
茄病鐮刀菌檢測探針 5'-GCACACGCCGTCCCTCAAATAC-3， 串繊刀菌檢測糖十 5，-TCGTrACTGGTAATCGTCGCGG-3, 鄉鐮刀菌檢測徽 5，"CTCAAGCCCTCGGGnTGGTGT-3, 煙曲霉菌檢測^l十 5'"CGCCAGCCGACACCCAACnTA-3, 黃曲霉菌檢測微 5'-TGCCGAACGCAAATCAATCT-3， 陽14M^探針 5'畫GCATATCAATAAGCGGAGGA國3， 陰'ft^機十 S'-TrTCAGATGATrCTCGGTrACTTGTGTC:
其中，戶脫茄病鐮刀菌檢測微與47號微球形成微球偶離，串:^l刀菌檢測探
針與7號1^形成微球偶辦，^ &鐮刀菌檢測^l十與20號微球形成微球偶辦，煙曲 霉菌檢測機十與3號微球形成微球偶,，黃曲霉菌檢測^l十與79號微球形成微球偶聯 體，附fM^f十與35號微球形成微球偶辦，陰'IMS徽與5號微球形成微球偶聯 體。
ilM微球偶辦的制備方法是分別選取3、 5、 7、 20、 35、 47、 79號的^^七微 球，洗滌；活化羧割七微球，并對應3、 5、 7、 20、 35、 47、 79號的羧M:微球1^ 別加入5'端12CMSf斷布的煙曲霉菌檢測擴十、陰^M^I十、串 刀菌檢測^1十、 ^^鐮刀菌檢泖MI十、陽'M^徽、茄病鐮刀菌檢測Wf和黃曲霉菌檢測Mf，形成各檢測 和相應熒光編碼微球的混^#/并混勻；^^M光孵育30辦中；再以
0.02。/oTWEEN20和0.1。/oSDS溶液洗滌，并溶于pH8.0的TE緩沖液，即獲#§#測探 針與相應熒光編碼微球的微球偶辦，^^別于4匸^#下 ;保存；{飾時，依據需 要檢測的菌種選翻應的微球偶^ffl合，即構淑目應的液相芯片系統。
采用液相芯片系^f角膜常j^a病真菌標準菌滅臨床分^t^a行檢測的方法
首先提取待測的真^M縫因組DNA，并以5'生物素新己的真菌通用弓胸進行PCR擴
增形成生物素化PCR產物；賴^M:微球與檢測繊十,球偶糊口生物素化rcR
J^tT混合，在95。C變臨于雜交溫度50'C孵育1小時，使^I十與相應生物素化的PCR 產tlf寺異l4^交；雜姊加入濃度為24^mL的75pL麟親和素-藻紅蛋白，混勻， 于雜交鵬5(TC孵育；將J:^孵育后的混^/上樣到LuminexlOO檢測儀，鵬^X fflit激M統即可確定真Mf中的種類和M。
本發明對于角膜常鵬病真菌的菌種的翻具有鵬所需樣本量少、高特異性、 高靈驗、高重復性的特點。單次檢測陽性率翻95.2%;劇賺測濃度低至0.94昭1>01 產物；四7爐復檢測的變異系數在1.8% 13.7%之間，f袷臨床檢測試劑的重復性標準。 另外，本發明的方法具WW的靈活性，可以在同一反應體系中對1-5種真^^種進行
檢測而卿于混合真菌感染的診斷。因此，i^t樹角膜常jra:病真^t種的'腿鑒定
和早期診斷具有觀的應用價值，權為真菌性角膜炎乃至全身性真菌感染的早期鵬
診斷和薪中針對性治療做出貢獻。
圖1、本發明的5種節中平行檢測與單一菌種檢測的熒光3驢比較示意圖。所粒 的液相芯片檢測系統可以準確的將5種目的真菌標準菌株鑒定至種的水平，形侖是只檢 領撣一m還是在同一個反應體系中平行檢測5種目的菌種，IPT獲得穩定的陽性MFI。
圖2本發明的不同濃度PCR產物的液相芯片檢測結果。結果可見，188 ng 0,94ng PCR產 可樹則出附性結果，MFI隨待測PCR ;^tr濃度的陶氐而斷氐，兩者呈正相 關(rs=0.74， P<0.05)。
圖3本發明的不同濃度PCR產物的瓊月離繊電泳檢測結果。圖中1: DNA marker, 2: 188ng， 3: 94ng， 4: 37.5ng， 5: 18.8ng， 6: 9.4ng， 7: 1.88ng， 8: 0.94ng， 9: 0.188ng。結果可見，188ng 37.5ngPCRm可見片段大小為550bp左右的電泳條 帶，清晰度依次斷氐，18.8ng以下未見可HH人的電泳絲。
^ss例i:本發明的真菌m寺異性糖十與M^探針的設計合成
將戰5種角膜常ia病真菌的標準菌概n臨床分離菌株復蘇培養后，以離心松法
提取基因組DNA，再利用真菌通用弓嫩對基因組DNA進行PCR擴增。PCR的^Z體 系為50pL,其中包括2xTaqPCR， MasterMix25nL， 一對濃度為lOpM的真菌通用引物各2pL，豐嫩DNA5ng，加滅菌去離子水補至50pL。擴增##: 94。C5min; 94。C30s， 53。C 30s， 72°C lmin， 35個循環；72°C 10min。細擴增弓嫩翻LeinbeigerDM和Hsiao CR 報道的真菌通用引物 (Pl-5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', P2-5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3')，反向引物P2的5'端以生物素t斜己。擴增后以
離心賦pcr產物純化試劑就5禾襯示準菌株的pcr ;^t/進很屯化并送交測序。
從NCBI的GenBanki^庫中獲取5種角膜常UC病真菌的全基因組序列，將所查 序列與，PCR產物測序所得序列進行生物信息學H^t，分析并找出保守區和可變區;
禾傭好生物學軟件ougo6.65，根據可變區(rrs區)序列設計種特異性^l十，
守區序歹股計陽'Mg探針，陰'頓控探針為與真菌序列無同源性的無辦列；Mii BLAST t瀏對戶;f^計的mt^fimo戶服計探針在合^i程中5'端以錢C12斷布，
這樣就形成了禾條異性探針、附IMSWf和陰tiMS^f十，以 :球偶離的制備。
^SS例2:本發明的微球偶i^的詳細制備方法
1) 把-2(TC保存的ii^千燥的EDC粉末置于室溫。
2) 用雙蒸水溶解MSf針布的^t亥苷^l十至濃度為0.1mM。
3) 用漩渦振蕩器重懸微球約20s，取lxl()6個(80^L)微球至微量離心管中，S8000xg 離心2min以沉淀微球。
4) 小心吸棄上清，向Jd^沉淀中加入50nL0.1M的MES (PH4.5),漩渦震蕩約20s重 懸微緣形成微離懸液。
5) 取lnL溶解好的0.1mM探針加入J^微球脫懸液中，震蕩混勻。
6) 準備飾羊的10m^mL的EDC水溶液，取3pL加入微球棍懸液中，震蕩混勻，室溫 避光孵育30min。
7) 再次準備飾羊的10mg/mL的EDC水溶液，取3pL力口入微球應懸液中，震蕩混勻， 室溫M;孵育30min。
8) 力口lmL0.02o/oTween20溶游U微球應懸液中，震蕩混勻，^8000xg離心2min以沉淀微球。
9) 小心吸棄上清,加lmL0.1%SDS溶液震蕩重懸微球，^8000xg離心2min以沉淀微球。
10) 小心吸棄上清，將沉淀溶于100MLTEPH8.0緩沖液，震蕩混勻約20s。
11) 用血細胞計,計數交概的微漆將交概的微球用雙蒸水做l: 100 ,，漩渦 振蕩混勻，取lOMUlJfiliffl胞計M，計數4個大，中的微 ，微^/mIM個 大M的微球lfct和x2.5xl00 C因子)。
12) 2-8。C避光保存交TO的微球。i柳時，依據需要檢測菌種選擇混合。
&例3本發明的檢測方法和結果
先將角膜常jra:病真菌的標準菌^^臨床分離菌株復蘇:t歸，提取基因組DNA，以 生物素iH己的真菌通用引牧戰行PCR擴增，PCR產物用于同偶聯有特異性^I十的微球200810140338. 1
說明書第5/7頁
偶連體進行雜交，具微測步驟如下-
1) 將交聯有各種檢測探針的相應熒光編碼微球分別以漩渦振蕩器或超聲混勻約
20s，鵬需熒光編碼的微球等比混合，混勻。
2) 用1.5xTMAC溶液W[^^至150微瑜pL的微球工作液(旨反應需33mL 微球工作液)，漩渦震蕩混勻約20s。
3) 針鵬孔加33nL微球工作液。
4) ^^樣本孔加入擴增好的生物素化的PCR產物和TE (Tris-EDTA， PH8.0)緩沖 輕總^f只17nL;齡背景孔加入與待測PCR，同^f只的空白對照液(以雙 蒸水代替DNA t鎌)和TE， PH8.0緩沖,總#^只17^L。用移液器輕輕吹打 混勻。
5) 封閉反應板以防止蒸發，并在95。C孵育5min，使PCR產物的雙鏈DNA變性。
6) 于雜交驗(50°C)孵育反應板l小時后將板在5000xg離心3min。離心期間準 備雜羊的下逝艮告好混合膝4t^5親和素-藻紅蛋白以lxTMAC溶液,至 24Mg/mL (齡反應孔需75nL)。
7) 離心后，小心吸棄上清，將雜交Wg于雜交驗，^h反應孔加AJd^ 75pL 報告好混合液，輕輕吹打混勻，并于雜交離(50°C)孵育反應板5射中形成 雜交液。
8) 取50pL雜交^^交，下按照系，作手冊用LuminexlOO分析imii^纟, ilit激絲統即可檢測確定真臓中的種類和Mo
真菌標準菌鵬繊分離株的檢測結果如下
特異性檢測結果本發明可以準確鑒定出5種角膜常JEK病真菌的節中，未^^非 特異'(4^交，檢測陽性率超'』95.2%，如圖l。
靈驗檢測結果本發明對真菌PCR產物的檢測低限為0.94ng，中位熒光3驢值隨 待測PCR產物濃度的斷氐而斷氐，兩者SIE相關(rs=0.74， P<0.05)，如圖2。
重復性檢測結果:本發明有良好的重復性，4 7爐復檢測的頓系數(CV)在1.8% 13.7%之間，^^國，臨床檢測試劑的重復性要求。
多菌種混合檢測結果本發明可以在同一反應體系中繊的將5種角膜常IS病真 菌鑒定至種的水平，其熒光強度值與各菌種單獨檢測的熒光強度值無統計學差異 (HX82， PX).05)。
因此，本發明可以在同一反應體系內'I^I將l至5種角膜常JiilJC病真菌鑒定至種的
水平，而且具有敏感、'腿、特異性高、重復斷、所需樣本量少的特點。<formula>formula see original document page 8</formula>cgccagccgacacccaacttta
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>黃曲霉菌(Aspergillus flavus) <400>5
tgccgaacgcaaatcaatct
<210>6
<211>20
<212>DNA
〈13〉AI序列
<220>
<223>陽1 徽，用于鑒定芯片系統的穩定性 <400>6
gcatatcaataagcggagga
<210〉7
<211>28
〈12>DNA
，〉AX序列
<220〉
<223>陰| ^十，用于排^#景和污染 <400>7
tttcagatgattctc^ttacttgtgtc
權利要求
1、一種角膜常見致病真菌菌種檢測的液相芯片系統，該液相芯片系統由微球、種特異性探針和質控探針組成，其特征是，所述的微球是3、5、7、20、35、47、79號的羧基化微球；其種特異性探針及質控探針序列如下茄病鐮刀菌檢測探針 5’-GCACACGCCGTCCCTCAAATAC-3’串珠鐮刀菌檢測探針 5’-TCGTTACTGGTAATCGTCGCGG-3’尖孢鐮刀菌檢測探針 5’-CTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGT-3’煙曲霉菌檢測探針 5’-CGCCAGCCGACACCCAACTTTA-3’黃曲霉菌檢測探針 5’-TGCCGAACGCAAATCAATCT-3’陽性質控探針 5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’陰性質控探針 5’-TTTCAGATGATTCTCGGTTACTTGTGTC-3’其中，所述茄病鐮刀菌檢測探針與47號微球形成偶聯體，串珠鐮刀菌檢測探針與7號微球形成偶聯體，尖孢鐮刀菌檢測探針與20號微球形成偶聯體，煙曲霉菌檢測探針與3號微球形成偶聯體，黃曲霉菌檢測探針與79號微球形成偶聯體，陽性質控探針與35號微球形成偶聯體，陰性質控探針與5號微球形成偶聯體。
2、 如權利要求l所述的液相芯片系統，其特征在于上述微球偶聯體的 制備方法是分別選取3、 5、 7、 20、 35、 47、 79號的羧基化微球，洗滌， 活化羧基化微球，并對應3、 5、 7、 20、 35、 47、 79號的羧基化微球順序 分別加入5'端12C氨基修飾的煙曲霉菌檢測探針、陰性質控探針、串珠鐮 刀菌檢測探針、尖孢鐮刀菌檢測探針、陽性質控探針、茄病鐮刀菌檢測探 針和黃曲霉菌檢測探針，形成各檢測探針和相應熒光編碼微球的混合物并 混勻；室溫避光孵育30分鐘；再以0.02%TWEEN20和0.1%SDS溶液洗滌， 最后溶于pH8.0的TE緩沖液，即獲得各檢測探針與相應熒光編碼微球的 偶聯體，并分別于2-8'C條件下避光保存。
3、 利用權利要求l所述的液相芯片系統進行檢測的方法其特征在于 首先提取待測的真菌菌株基因組DNA，并以5'生物素標記的真菌的通用引 物進行擴增；再將檢測探針與羧基化微球的偶聯體和生物素化的PCR產物 混合，在95。C變性后于雜交溫度50'C孵育1小時，使探針與相應的生物素 化的PCR產物特異性雜交；雜交后加入濃度為2-4嗎/mL的75pL鏈霉親 和素-藻紅蛋白，混勻，再于雜交溫度5(TC孵育；將上述孵育后的混合物 上樣到LuminexlOO檢測儀通過紅綠雙通道激光系統即可檢測確定真菌菌 種的種類和數量。
全文摘要
本發明涉及一種角膜常見致病真菌菌種檢測的液相芯片系統及其檢測方法。該液相芯片系統由3、5、7、20、35、47、79號的羧基化微球、待測的角膜常見致病真菌的種特異性探針和2條質控探針組成。該系統的微球偶聯體特異性的識別相應真菌菌種基因組DNA通用引物的PCR產物，然后再與鏈霉親和素-藻紅蛋白報告分子結合并通過液相芯片檢測儀，經由紅綠雙色激光的同時檢測確定待測真菌菌種的種類和數量。本發明能夠同時檢測5種真菌菌種，且有快速、所需樣本量少、高特異性、高靈敏度、高重復性的優點，因而對角膜常見致病真菌菌種的快速鑒定和早期診斷方面具有重要的應用價值，有望為真菌性角膜炎乃至全身性真菌感染的早期快速診斷和針對性治療做出貢獻。
文檔編號C12Q1/04GK101434993SQ200810140338
公開日2009年5月20日 申請日期2008年10月1日 優先權日2008年10月1日
發明者董燕玲, 謝立信, 銀紅梅 申請人:山東省眼科研究所