專利名稱：一種腐霉屬菌種及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)及其在滅蚊方面的用途。
背景技術：
農業害蟲每年給人類的農業、林業生產帶來嚴重的損失。衛生害蟲不但騷擾人群，而且可以傳播疾病，威脅人類健康。由于化學農藥的發明，人們從蟲口里奪回了糧食，也控制了媒介昆蟲的數量，減少了蟲媒傳染病的流行。
然而長期大量使用化學殺蟲劑帶來了嚴重問題。1)環境污染由于化學農藥多數不溶于水，進入動、植物體內不易排除，越是高等的動物，農藥成分越容易在體內富集(積累到很高的濃度)，對身體造成危害。農藥中的重金屬殘留在土壤中，造成土地變質，農業減產；農產品殘毒含量高，出口受阻；2)生態平衡被破壞經過長期進化和相互適應，自然界各種生物的相對數量達到動態平衡。使用化學農藥，把害蟲和益蟲全殺死，使自然界控制害蟲的天敵大大減少，害蟲數量反彈，造成更大的危害；3)害蟲產生抗藥性昆蟲基因有很強的突變能力。在化學農藥的誘導下，昆蟲很快就產生抵抗農藥毒性的能力，使農藥施用的劑量越來越大，甚至農藥完全失效。一般來說，一種新農藥使用2年，害蟲就產生明顯抗藥性。而開發新的化學殺蟲劑要花大量資金和時間(把統計，約1億美元和10年時間開發一種新農藥)。
生物防治是采用害蟲天敵或可對害蟲致病的微生物來控制或殺滅害蟲。它有對害蟲高度特異性，對非靶生物無毒無害，不污染環境，不破壞生態平衡，不易誘導害蟲的抗藥性的優點，所以，是很理想的害蟲防治方法。無論國際國內，農業害蟲的生物防治較之醫學昆蟲的生物防治要發達很多。醫學昆蟲的生物防治是薄弱環節。到目前為止，市場上尚沒有滅蚊真菌的商品。
發明內容
本發明的目的在于克服上述缺點而提供的一種新的腐霉屬菌種-貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)。
本發明的另一目的在于提供該腐霉屬菌種在滅蚊方面的用途。
一種腐霉屬菌種，其形態特征菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型，有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步。該菌種已于2005年3月7日提交中國典型培養物保藏中心(地址武漢大學)保藏。
(一)貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)的分離步驟(1)取貴醫花園土壤1000克，加自來水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白紋伊蚊卵于水中；(2)約一周以后，卵孵化成幼蟲，并發育至三齡，幼蟲大量死亡懸浮于水面下，取死幼蟲，用75％酒精體表消毒，無菌蒸餾水清洗3次，然后置于KPYG2(成分見后)瓊脂培養基上，每平板中央放1只死幼蟲，將接種后的平板置25℃培養；(3)2～3天后有大量菌絲從幼蟲體內長出，菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步；(4)無菌條件下，切取帶菌絲的瓊脂塊轉種至新KPYG2或SFE瓊脂培養基上；(5)反復從平板上切取純的菌絲轉種，最后就得到純化的貴陽腐霉。
(二)培養貴陽腐霉采用的瓊脂培養基KPYG2瓊脂培養基將1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉、3.0克葡萄糖、0.025克膽固醇、0.11克無水氯化鈣、1.0克玉米油加入水中，加水至1000毫升。
SFE(葵花籽培養基)生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6層紗布過濾，濾液再加水至2000毫升；分裝冷凍于-20℃。用時，取出解凍，加水一倍即可以上為液體培養基。固體培養基需按1.5％加瓊脂。高溫高壓消毒后倒在培養皿中，冷卻即可。
(三)菌種的保種和傳代保種用的培養基為KPYG2或SFE兩種培養基中的一種。
保存方法有3種(1)每周一次，從已長滿的平板上切取一塊帶菌絲的瓊脂培養基塊轉種到新的平板上。
(2)用15×200mm的試管，盛瓊脂培養基5ml，做成斜面，接種真菌，25℃培養2～3天，倒10ml左右滅菌石蠟油覆蓋其上，置25℃保存。3個月轉種一次。
(3)水保存法。用10×100mm帶蓋試管，加蒸餾水3ml，亞麻籽3粒，高溫消毒，冷卻，無菌條件下取2帶菌絲的瓊脂塊(約50mm2)加于其中，加蓋，置25℃，半年轉種一次。
(四)菌種的生態特征菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步。
(五)菌種的培養特性(1)培養溫度5℃～35℃，最適溫度25℃～27℃；(2)培養pH5～12；最佳范圍為9～11。
對照腐霉屬的特征(《中國真菌志)》第55頁)，本真菌按形態結構應該屬于腐霉屬。由于其綜合特征與已經描述的腐霉屬真菌有明顯的不同，因此應該是尚未認識的新種，特根據首先發現的地名命名為貴陽腐霉(Pythiumguiyangense Su)。
本發明的貴陽腐霉對對溫度、pH等自然環境條件的適應范圍廣，對不良環境的耐受力強，容易培養和保存及工業化生產，生產成本低，滅蚊效果好，經多種動、植物測試證實其無毒無害，對非靶生物是安全的。不污染環境，不破壞生態平衡。
具體實施例方式
本發明的腐霉屬菌種貴陽腐霉(Pythium guiyangense Su)的分離方法(1)取貴醫花園土壤1000克，加自來水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白紋伊蚊卵于水中；(2)約一周以后，卵孵化成幼蟲，并發育至三齡，幼蟲大量死亡懸浮于水面下，取死幼蟲，用75％酒精體表消毒，無菌蒸餾水清洗3次，然后置于KPYG2瓊脂培養基上，每平板中央放1只死幼蟲，將接種后的平板置25℃培養；(3)2～3天后有大量菌絲從幼蟲體內長出，菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細；孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，卵形和梨形的孢子囊，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步；(4)無菌條件下，切取帶菌絲的瓊脂塊轉種至新SFE瓊脂培養基上；(5)反復從平板上切取純的菌絲轉種，最后就得到純化的貴陽腐霉。
取在SFE瓊脂培養基上生長6天的貴陽腐霉，用打孔器(為了保證瓊脂塊的面積規范)取帶菌絲瓊脂塊，每塊面積約200mm2，取容積為200ml的白色塑料杯，每杯盛自來水100ml，加瓊脂塊2塊，2～3齡蚊幼蟲25只，4％兔肝粉懸液3滴。每一實驗組設3～4杯，并設對照組(3～4杯)。對照組的杯中所加之物，除沒有真菌外，其余與實驗組同。
實驗溫度16～25℃。每天觀察2次，取出死亡蚊幼蟲，顯微鏡下觀察有無菌絲從體內長出。有菌絲者為被感染。記錄死亡數及感染數，計算死亡率和感染率。相關數據見表1-6。
表1 不同培養基上的貴陽腐霉培養物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)
注帶有相同字母的數據間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表2 含不同碳源的培養基上的貴陽腐霉培養物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)
注帶有相同字母的數據間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表3 不同pH值培養基上的貴陽腐霉培養物對致倦庫蚊幼蟲的感染率(％)
注帶有相同字母的數據間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表4 不同光照條件下貴陽腐霉培養物對致倦庫蚊幼蟲的感染(％)
注帶有相同字母的數據間無顯著性差異，檢驗水準α＝0.05。
表5 所采集的蚊幼蟲分類鑒定情況及被貴陽腐霉感染情況(已鑒定到種的部分蚊蟲)
表6 所采集的蚊幼蟲分類鑒定情況及被貴陽腐霉感染情況(未能鑒定到種的部分)
結論已觀察的七種天然或人工培養基(KPYG2、PYG、SFE、SDAY、CMA、CAP、PDA)都可以培養。其中按菌絲生長率和真菌對蚊蟲的毒力綜合考慮，SFE是最佳培養基；光照周期對真菌的生長和滅蚊能力沒有明顯影響，但紫外光對菌絲生長和游動孢子有抑制作用。菌絲生長對碳源要求不嚴格，在葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇及可溶性淀粉分別作為碳源的情況下，菌絲生長速度，產孢量和滅蚊能力沒有顯著差異；在七種氮源中即蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫銨及尿素，用有機氮做氮源時，菌絲生長速度，產孢量和滅蚊能力明顯優于無機氮做氮源的培養基。
用SFE培養基取得了較好的滅蚊效果，并且是針對庫蚊，特別是對三帶喙庫蚊(流行性乙型腦炎的傳播媒介)的殺滅效果好。用KPYG2培養基的滅蚊率比較低。
權利要求
1.一種腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型。有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步。
2.如權利要求1所述的腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于培養溫度為5℃～35℃，培養pH5～12。
3.如權利要求1或2所述的腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)，其特征在于培養溫度為25℃～27℃，培養pH為9～11。
4.一種腐霉屬菌種(Pythium guiyangense Su)在來滅蚊方面的用途。
全文摘要
本發明公開了一種腐霉屬菌種(Pyghiumguiyangense Su)及其用途，該菌形成的菌落在KPYG培養基上呈放射狀與玫瑰花狀的混合型，有大量氣生菌絲；菌絲無隔分支，較細，孢子囊為球形、卵形或梨形，頂生，頂端有一乳突，泡囊形成于乳突頂端；每個孢子囊可產生8～24或更多的游動孢子，游動孢子雙鞭毛、腎形；有孢子囊層出現象，孢子囊有時直接萌發產生芽管；卵孢子為球形、平滑、滿器或幾乎滿器，有一個藏卵器內產兩個卵孢子的現象，這兩個卵孢子的發育可以不同步。該菌對自然環境條件的適應范圍廣，容易培養和保存，滅蚊效果好，不污染環境，不破壞生態平衡。
文檔編號C12N1/14GK1673347SQ20051000302
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月18日 優先權日2005年3月18日
發明者蘇曉慶 申請人:貴陽醫學院