專利名稱：粒狀聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法
技術領域：
本發明涉及一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶 菌酶體外復性的方法。
背景技術：
基因工程技術是現代生物技術的主體，其迅猛發展使得蛋白質的異體表達 成為發展生物醫藥工業和獲得特殊化學品的重要途徑。但是在基因工程蛋白質 產業化過程中往往面臨這樣一個難題重組表達產物通常是以無生物活性的包 涵體形式存在的。如何使包涵體高效地重折疊成為具有天然構象和生物活性的 蛋白質，是決定該基因工程蛋白質能否產業化和為人類所利用的關鍵，因而蛋 白質體外復性技術領域成為近年來的研究熱點之一。但由于蛋白質本身的多樣 性、結構和折疊過程的復雜性，使得人們不能簡單地把一種復性方法移植到多 種蛋白質復性體系中，也很難找到具有普適性而又低成本的高效復性方法。因 此實際操作過程中必須針對每種目標蛋白質的特點，對影響復性的各個因素逐 一優化，才能最終確定適用于該種蛋白質的復性方法。
到目前為止，蛋白質復性過程中的許多問題依然困擾著人們，如活性回收 率較低、復性起始和終了的蛋白質濃度偏低以及后處理過程繁瑣等。隨著研究 的深入，開發了一些能夠在高濃度條件下協助蛋白質進行體外復性的方法，主 要有色譜復性，該方法復性回收率高、操作簡便快速，但往往因為設備及材 料投入成本高而影響了其在工業生產中的大規模應用；分子伴侶和折疊酶介導 的蛋白質復性，該方法是受到體內蛋白質折疊過程的啟發，能夠在一定程度上 提高復性收率，但是其來源有限，購買價格昂貴，即使通過微生物發酵自行制 備，也會存在發酵成本較高且產品易失活等問題， 一般僅用于復性機理的研究； 常規的蛋白質復性添加劑如聚乙二醇、L-精氨酸、去污劑和表面活性劑以及人 工分子伴侶等，雖然對設備要求不高，但協助復性效果有限，且復性過程完成 后難以與目標蛋白質進行分離。在這種情況下，開發出一種新型、高效、易于 分離回收而又低成本的蛋白質體外復性添加劑就顯得尤為重要。近年來隨著交 叉學科的迅速發展，智能型聚合物作為一種新型的蛋白質體外復性添加劑越來 越引起人們的重視，其主要優點在于影響復性過程的參數較少、操作方便、儀 器設備要求較低且易于分離回收。
本課題組合成了各種分子量的線性聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)聚合 物并將其應用于溶菌酶體外復性過程(參見線性聚N-異丙基丙烯酰胺協助溶菌 酶體外復性的方法，發明專利申請號200810062428.3)，結果表明分子量適中 的PNIPAAm聚合物協助溶菌酶復性的效果很好，在蛋白濃度為60(Vg/mL時， PNIPAAm的加入可使酶的活性回收率從稀釋復性的10%提高到80%左右。但是 采用線性聚合物作為復性添加劑，復性完成后需先通過加熱的方式使PNIPAAm 從水溶液中析出，再經過一步高速離心才能實現復性后目標蛋白質與PNIPAAm 水溶性聚合物的分離，操作相對麻煩；另外由于該聚合物的聚合度不易控制， 一方面會導致其協助復性效果有較大的波動，另一方面那些聚合度較小的 PNIPAAm分子由于和復性液中目標蛋白的分子量差別不大而難以通過離心完 全除去。本課題組還曾合成了粒狀聚N-異丙基丙烯酰胺并考察其協助溶菌酶復 性的效果(參見溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協助溶菌酶復性的方法，發明 專利申請號ZL 200410073406.9，授權日2006年8月2日)，該聚合物是一 種交聯網絡狀凝膠，在水中可以顯著溶脹，但不能溶解。由于該凝膠具有線性 PNIPAAm聚合物所擁有的疏水特性，從而可以起到協助蛋白質體外復性的作 用；且復性過程結束后可利用其溫度響應特性，通過在溶液中反復溶脹(低于 其臨界溶解溫度LCST)和縮水(高于LCST)的方法使凝膠快速地分離、回收 并重復使用。但是該粒狀凝膠的機械強度較弱，且相變溫度的可調范圍較窄， 從而使其應用受到了限制。本發明在前期工作的基礎上，通過在聚合過程中引 入共單體丙烯酸鈉(SA)，制備得到粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共 聚凝膠。 一方面，該共聚凝膠具有疏水基團異丙基，可以通過疏水相互作用來 抑制變性蛋白及其折疊中間體因相互聚集而導致的沉淀，從而協助蛋白質復性； 另一方面，共聚單體SA的引入使得凝膠的機械強度明顯增強，從而顯著地提高 其吸水能力，大大增加了凝膠的最大溶脹倍率；最后，共聚單體SA的引入使得 該凝膠的相變溫度有所上升，且可通過改變SA的加入量方便地調節其相變溫 度，以適用于不同的目標蛋白。
發明內容
本發明的目的是在克服現有技術不足，提供一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰 胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法。 方法的步驟如下
1)取40~60mL濃度為0.2 0.4mol/L的NaOH溶液，加入過量的丙烯酸水 溶液，攪拌反應4 6h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙
烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于75~100mL有機相液體石蠟中，使其濃度為 1~1.5% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌20 30min，使表面活性劑充分 分散，然后將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍 緩慢滴加入反應器中，其原料水溶液組成為質量百分比濃度為14% (g/g)的 主單體、交聯度為10% (g/g)、單體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的摩 爾比為19:1 9:1、濃度為0.5 0.8% (g/mL)的氧化劑過硫酸銨，在氮氣保護下， 攪拌30 40min后，緩慢加入引發劑N， N, N，， N，-四甲基乙二胺2 3pL，聚合溫 度控制在20 25'C，攪拌速度控制在250 280rpm，反應3~4h出料，產物用無水 乙醇/水反復浸泡洗滌，于真空干燥箱中烘干，即得到粒狀聚(N-異丙基丙烯酰 胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠；其中，主單體包括單體N-異丙基丙烯酰胺與交聯劑 N,N，-亞甲基雙丙烯酰胺，交聯度是指交聯劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺在主單體 中所占的質量百分比；
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37。C、 100 120rpm搖床中處理90 120min，得到無活性的去折疊態溶菌酶 溶液，取0.1 0.5mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入復性緩沖液，混 勻，得到10mL復性體系溶液；
4) 在復性體系溶液中加入粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝 膠，凝膠質量濃度為復性體系溶液中溶菌酶質量濃度的160 560倍，溶液在溫 度為20~40°C、轉速為100~140 rpm的搖床中復性16 2化；
所述的N-異丙基丙烯酰胺采用正己垸重結晶。變性緩沖液為含有8mol/L尿 素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基) 氨基甲烷-鹽酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、 3mol/L尿素、0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化 型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。凝膠在溶菌 酶復性完成后通過升高溫度至凝膠相變溫度之上，使凝膠縮水從而排出凝膠網 格中的蛋白溶液，再進行離心過濾即可將凝膠從復性液中分離回收，重復使用。
本發明在制備工藝上采用反相懸浮聚合法，制備得到的產物為球形粒狀凝 膠，凝膠的平均粒徑在0.3mm左右，且分布較窄。該共聚凝膠具有合適的低臨 界溶解溫度(LCST)范圍38 43。C,最大溶脹倍率為8.5 13。同時其表面分布 有直徑1 2pm的孔洞，從而具有較快的溫度響應特性，達到溶脹及縮水平衡僅 需15min。在協助溶菌酶復性時，去折疊態溶菌酶可以自由而快速地與共聚凝膠 側鏈上的疏水基團異丙基發生疏水相互作用，從而抑制蛋白質之間的相互聚集，
在處理濃度為500(ig/mL時，可使溶菌酶的活力回收率從稀釋復性的30%提高到 60%左右。凝膠重復利用6次后溶菌酶的活力回收率仍比稀釋復性提高13%以 上。因此，所開發的粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠可以作 為協助蛋白質體外復性的添加劑。本發明的優點在于1)制備工藝簡單，易于 控制和放大；2)制備的粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠在水 中能夠充分溶脹的同時，還具有一定的疏水性能，從而可以抑制蛋白質復性過 程中的聚集趨勢。該種凝膠協助溶菌酶復性時，可使溶菌酶的比活及活力回收 率均比稀釋復性有較大的提高；3)該法復性操作簡單，影響復性過程的參數少， 對儀器及設備的要求低；4)與線性PNIPAAm聚合物相比，在復性過程完成后， 利用該凝膠的溫敏特性，可方便地分離回收并重復使用，從而降低生產成本；5) 與一般的粒狀凝膠相比，可以通過控制共單體丙烯酸鈉的含量來調節該凝膠的 疏水性能，進而改變其低臨界溶解溫度和最大溶脹倍率，使其適用于不同的目 標蛋白。
圖1是本發明粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠 (P(NIPA-co-SA))與粒狀聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠(PNIPA)在不同溫度下溶
脹倍率的變化情況。圖中兩種凝膠的主單體濃度為14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， P(NIPA-co-SA)共聚凝膠中單體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的
摩爾比為15.7:1;
圖2是在不同溶菌酶初始濃度下，本發明粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙 烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性與稀釋復性效果比較。圖中復性液中 共聚凝膠的加入量為溶菌酶濃度的480倍，復性溫度為30°C 。
圖3是本發明粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠重復利用 次數對其協助溶菌酶復性效果的影響。圖中凝膠的主單體濃度為14% (g/g)， 交聯度為10% (g/g),單體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的摩爾比為 15.7:1，初始溶菌酶濃度為250嗎/mL，共聚凝膠的加入量為120mg/mL，復性溫 度為30°C。
具體實施例方式
本發明采用粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠 (P(NIPA-co-SA))協助溶菌酶體外復性。步驟包括粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺 一丙烯酸鈉)共聚凝膠的制備及其協助溶菌酶體外復性過程。為實現該過程，
首先，將NaOH與過量的丙烯酸反應，反應完成后減壓蒸發除去水及剩余的丙 烯酸，即可得到共單體丙烯酸鈉。然后配制反應物水溶液，將適當比例的單體 N-異丙基丙烯酰胺、共單體丙烯酸鈉、交聯劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺以及氧化 劑過硫酸銨溶于去離子水中，用微濾膜過濾溶液以除去未溶解的雜質；然后采 用反相懸浮法制備溫敏型P(NIPA-co-SA)共聚凝膠，向容器中加入液體石蠟和吐 溫-80，充分分散后加入反應物的水溶液，形成均一、穩定的油包水反相懸浮分 散體系，緩慢加入N,N,N，，N，-四甲基乙二胺引發聚合，將得到的粒狀凝膠用一定 比例的無水乙醇/水反復洗滌后，于真空干燥箱中烘干，得到呈顆粒狀、分散性 能較好的P(NIPA-co-SA)共聚凝膠；其次，進行P(NIPA-co-SA)共聚凝膠協助溶 菌酶體外復性，將溶菌酶溶于變性緩沖液中，獲得無活性去折疊態溶菌酶溶液。 再按照不同的稀釋倍數緩慢加入不同體積的復性緩沖液，向溶液中加入粒狀 P(NIPA-co-SA講聚凝膠。充分震蕩使其分散均勻后，進行復性過程；最后，溫 敏型P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的回收。復性過程結朿后需將溶液升溫至 P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的相變溫度LCST之上，使其充分縮水，實現凝膠與復 性后目標蛋白的分離，將凝膠回收，以便重復利用。本發明所采用的復性方法 中，表面活性劑吐溫-80的加入量為有機相的1~1.5% (g/mL)，原料水溶液中單 體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的摩爾比為19:1-9:1，氧化劑過硫酸銨 的濃度為0.5~0.8%(g/mL)，主單體(包括單體N-異丙基丙烯酰胺與交聯劑N,N，-亞甲基雙丙烯酰胺)濃度為14% (g/g)，交聯度(交聯劑的質量與主單體質量之 比)為10% (g/g),反應溫度控制在20 25°C，攪拌速度為250 280rpm，氮氣 保護下反應3 4h,所得產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，烘干后待用。變性液 中蛋白質濃度為10mg/mL，將溶液置于37°C、 100 120rpm搖床中處理 90 120min。復性液中變性溶菌酶溶液的加入量為0.1 0.5mL，復性體系的終體 積為10mL，在復性體系中加入粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠，凝膠的質量濃度 為溶菌酶質量濃度的160 560倍，復性溫度為20~40°C，搖床轉速為100-140 rpm，復性時間為16 24h。
單體N-異丙基丙烯酰胺(99%，聚合級，購自北京百靈威化學技術有限公 司)，交聯劑N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺(化學純，購自中國醫藥上海試劑公司)， 引發劑N，N, N，， N，-四甲基乙二胺(TEMED)、溶菌酶、二硫蘇糖醇(DTT)、 乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、還原及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、三(羥甲基) 氨基甲烷(Tris)和考馬斯亮藍均購自上海生工生物工程公司，底物微球菌 M/crococcws /;;socfe/to'ci ATCC4698購自Sigma公司，其它試劑均為市售分析純。
變性緩沖液為含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L 二硫蘇 糖醇的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5;復性緩沖液為含有 1 mmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、0.15 mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型 谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的0.1 mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。溶菌酶比活測定采用標準的F.LP.法，溶菌酶濃度采用考馬斯 亮藍法測定，溶菌酶的活力回收率為復性后溶液中溶菌酶的活力與變性前溶菌 酶活力之比。
以下通過實施例對本發明作進一步的描述
實施例1
1) 取40mL濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應4h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于75mL有機相液體石蠟中使其濃度為1% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌20min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的摩爾比為15.7:1，氧化劑過硫酸銨 的濃度為0.5% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌30min后，緩慢加入引發劑N,N, N，， N，-四甲基乙二胺2pL，聚合溫度25。C，攪拌速度250rpm，反應3h出料。 產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀P(NIPA-co-SA) 共聚凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溶解溫度(LCST)為39"C，比相應條件 下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33"C)有顯著的提高， 結果如圖1所示。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2~0.5mm的較窄區域， 分散性能良好，且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2pm的孔洞。該粒狀 凝膠具有較好的溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅需要15min左 右。
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37'C、 100rpm搖床中處理120min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 0.25mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性 體系的終體積為lOmL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為40mg/mL
(為溶菌酶濃度的160倍)，溶液在溫度為3(TC、轉速為120rpm搖床中復性16h。 復性后溶菌酶活力回收率達到56.5%。變性緩沖液為含有8mol/L尿素、lmmol/L 乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽
酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、 0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的 0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。 實施例2
1) 取50mL濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應4h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于75mL有機相液體石蠟中使其濃度為1% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌30min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為19:1，氧化劑過硫酸 銨的濃度為0.5y。(g/mL)，在氮氣保護下，攪拌40min后，緩慢加入引發劑N，N, N，， N，-四甲基乙二胺2^iL，聚合溫度25X:，攪拌速度250rpm，反應3h出料。 產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀P(NIPA-co-SA) 共聚凝膠最大溶脹倍率為8.5，其低臨界溶解溫度(LCST)為38°C，比相應條 件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33'C)有顯著的提 高。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2 0.5mm的較窄區域，分散性能良好， 且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2,的孔洞。該粒狀凝膠具有較好的 溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅需要15min左右。
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37。C、 120rpm搖床中處理卯min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 0.25mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性 體系的終體積為10mL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為 120mg/mL (為溶菌酶濃度的480倍)，溶液在溫度為30°C、轉速為120 rpm搖 床中復性16h。復性后溶菌酶活力回收率達到71.9%。變性緩沖液為含有8mol/L 尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和3Ommol/L 二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基) 氨基甲垸-鹽酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、 3mol/L尿素、0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化 型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。
實施例3
1)取60mL濃度為0.4mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應6h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體;
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于100mL有機相液體石蠟中使其濃度為1.5% (g/mL),加入反應器，通入氮氣，攪拌30min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為9:1，氧化劑過硫酸銨 的濃度為0.5% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌40min后，緩慢加入引發劑N,N, N，， N，-四甲基乙二胺2pL，聚合溫度25X:，攪拌速度280rpm，反應3h出料。 產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀P(NIPA-co-SA) 共聚凝膠最大溶脹倍率為13，其低臨界溶解溫度(LCST)為43°C，比相應條 件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33°C)有顯著的提 高。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2 0.5mm的較窄區域，分散性能良好， 且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2pm的孔洞。該粒狀凝膠具有較好的 溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅需要15min左右。
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37'C、 100rpm搖床中處理90min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 0.25mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性 體系的終體積為10mL，其中，P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為140mg/mL(為 溶菌酶濃度的560倍)，溶液在溫度為30°C、轉速為120 rpm搖床中復性16h。 復性后溶菌酶活力回收率達到67.1%。變性緩沖液為含有8mol/L尿素、lmmol/L 乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲垸-鹽 酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、 0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的 0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。
實施例4
1) 取60mL濃度為0.3mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應6h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于75mL有機相液體石蠟中使其濃度為1.5% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌20min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為15.7:1，氧化劑過硫 酸銨的濃度為0.8% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌30min后，緩慢加入引發劑
N, N， N，， N，-四甲基乙二胺3nL，聚合溫度20。C，機械攪拌速度280rpm，反應 4h出料。產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀 P(NIPA-co-SA)共聚凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溶解溫度(LCST)為39 °C ，比相應條件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33°C ) 有顯著的提高，結果如圖l所示。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2 0.5mm 的較窄區域，分散性能良好，且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2pm的 孔洞。該粒狀凝膠具有較好的溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅 需要15min左右。
3)將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37。C、 100rpm搖床中處理120min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 0.25mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性 體系的終體積為10mL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為 120mg/mL (為溶菌酶濃度的480倍)，溶液在溫度為20"C、轉速為100 rpm搖 床中復性24h。復性后溶菌酶活力回收率達到60.1%。變性緩沖液為含有8mol/L 尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L二硫蘇糖醇的O.lmol/L三(羥甲基) 氨基甲烷-鹽酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、 3mol/L尿素、0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化 型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲垸-鹽酸溶液，pH8.5。
實施例5
1) 取40mL濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應5h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于80mL有機相液體石蠟中使其濃度為1.5% (g/mL),加入反應器，通入氮氣，攪拌30min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為15.7:1，氧化劑過硫 酸銨的濃度為0.8% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌30min后，緩慢加入引發劑 N,N,N，，N，-四甲基乙二胺3nL，聚合溫度2(TC,攪拌速度280rpm，反應4h出 料。產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀 P(NIPA-co-SA)共聚凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溶解溫度(LCST)為39 °C，比相應條件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33'C) 有顯著的提高，結果如圖1所示。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2 0.5mm
的較窄區域，分散性能良好，且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2(im的
孔洞。該粒狀凝膠具有較好的溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅
需要15min左右。
3)將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37。C、 100rpm搖床中處理120min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 0.25mL無活性的去折疊態溶菌酵溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性 體系的終體積為10mL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為 120mg/mL (為溶菌酶濃度的480倍)，溶液在溫度為40。C、轉速為100 rpm搖 床中復性24h。復性后溶菌酶活力回收率達到57.2%。變性緩沖液為含有8mol/L 尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L 二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基) 氨基甲垸-鹽酸溶液，pH 8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、 3mol/L尿素、0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化 型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲垸-鹽酸溶液，pH8.5。
實施例6
1) 取60mL濃度為0.4mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應4h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于100mL有機相液體石蠟中使其濃度為1% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌25min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g)， 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為15.7:1，氧化劑過硫 酸銨的濃度為0.5% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌40min后，緩慢加入引發劑 N, N, N，， N，-四甲基乙二胺2^iL,聚合溫度2(TC，機械攪拌速度280rpm，反應 3h出料。產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀 P(NIPA-co-SA)共聚凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溶解溫度(LCST)為39 °C ，比相應條件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33°C) 有顯著的提高，結果如圖1所示。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2 0.5mm 的較窄區域，分散性能良好，且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2pm的 孔洞。該粒狀凝膠具有較好的溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅 需要15min左右。
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37'C、 120rpm搖床中處理90min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取
0.5mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性體 系的終體積為10mL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為240mg/mL (為溶菌酶濃度的480倍)，溶液在溫度為30°C 、轉速為140 rpm搖床中復性20h, 結果如圖2所示。復性后溶菌酶活力回收率達到58.5%，而相同條件下稀釋復性 的活力回收率僅為34.8%。變性緩沖液為含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺四 乙酸鈉和30mmol/L 二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液， pH8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、0.15mol/L 氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的0.1mol/L 三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。 實施例7
1) 取50mL濃度為0.3mol/L的NaOH溶液，加入過量丙烯酸水溶液，攪 拌反應6h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；
2) 將表面活性劑吐溫-80溶于100mL有機相液體石蠟中使其濃度為1% (g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌25min，使表面活性劑充分分散。然后
將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加 入反應器中，原料水溶液組成為主單體濃度14% (g/g)，交聯度為10% (g/g), 單體N-異丙基丙烯酰胺與自制共單體丙烯酸鈉的摩爾比為15.7:1，氧化劑過硫 酸銨的濃度為0.5% (g/mL)，在氮氣保護下，攪拌40min后，緩慢加入引發劑 N,N,N，，N，-四甲基乙二胺2iiL，聚合溫度20。C，攪拌速度280rpm，反應3h出 料。產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于干燥箱中烘干。得到的粒狀 P(NIPA-co-SA)共聚凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溶解溫度(LCST)為39 °C，比相應條件下粒狀PNIPA凝膠(最大溶脹倍率6.3，低臨界溶解溫度33'C) 有顯著的提高，結果如圖1所示。凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2~0.5mm 的較窄區域，分散性能良好，且凝膠粒子表面分布有一定數量直徑為1 2pm的 孔洞。該粒狀凝膠具有較好的溫度敏感性，在水溶液中達到溶脹及縮水平衡僅 需要15min左右。
3) 將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液 置于37。C、 100rpm搖床中處理120min,得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取 O.lmL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入到復性緩沖液中，混勻，復性體 系的終體積為10mL，其中，粒狀P(NIPA-co-SA)共聚凝膠的加入量為48mg/mL
(為溶菌酶濃度的480倍)，溶液在溫度為3(TC、轉速為140 rpm搖床中復性20h, 結果如圖2所示。復性后溶菌酶活力回收率達到81.7%，而相同條件下稀釋復性
僅能得到74.3%的活力回收率。變性緩沖液為含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二 胺四乙酸鈉和30mmol/L二硫蘇糖醇的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲垸-鹽酸溶 液，pH8.5。復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、0.15mol/L 氯化鈉、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的0.1mol/L 三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。 實施例8
復性過程結束后只需將溶液置于45'C的恒溫槽中30min，即可使凝膠充分 縮水，實現凝膠與復性后目標蛋白的分離。將分離后的粒狀P(NIPA-co-SA)共聚 凝膠分別置于4'C和5(TC的水浴中使其反復溶脹、縮水，重復10次后，即可方 便、快速地實現凝膠的回收。將清洗干凈的P(NIPA-co-SA)共聚凝膠用無水乙醇 置換出其中的水后，放于烘箱中烘干，即可再次用于蛋白質的復性實驗中。通 過該方法回收的凝膠可反復用于溶菌酶復性實驗，結果如圖3所示。當溶菌酶 初始濃度為250嗎/mL時，凝膠重復利用6次后，仍能達到58.1。/。的溶菌酶活力 回收率，比稀釋復性提高13%左右。
權利要求
1．一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺—丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，其特征在于方法的步驟如下1)取40～60mL濃度為0.2～0.4mol/L的NaOH溶液，加入過量的丙烯酸水溶液，攪拌反應4～6h后，減壓蒸發除去溶劑及殘余的丙烯酸，即可收集得到丙烯酸鈉固體；2)將表面活性劑吐溫-80溶于75～100mL有機相液體石蠟中，使其濃度為1～1.5％(g/mL)，加入反應器，通入氮氣，攪拌20～30min，使表面活性劑充分分散，然后將體積為有機相體積1/3的含有各種反應組分的原料水溶液用移液槍緩慢滴加入反應器中，原料水溶液組成為質量百分比濃度為14％(g/g)的主單體、交聯度為10％(g/g)、單體N-異丙基丙烯酰胺與共單體丙烯酸鈉的摩爾比為19:1～9:1、濃度為0.5～0.8％(g/mL)的氧化劑過硫酸銨，在氮氣保護下，攪拌30～40min后，緩慢加入引發劑N，N，N’，N’-四甲基乙二胺2～3μL，聚合溫度控制在20～25℃，攪拌速度控制在250～280rpm，反應3～4h出料，產物用無水乙醇/水反復浸泡洗滌，于真空干燥箱中烘干，即可得到粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺—丙烯酸鈉)共聚凝膠；其中，主單體包括單體N-異丙基丙烯酰胺與交聯劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺，交聯度是指交聯劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺在主單體中所占的質量百分比；3)將溶菌酶溶于變性緩沖液中，配制成濃度為10mg/mL的溶液，將溶液置于37℃、100～120rpm搖床中處理90～120min，得到無活性的去折疊態溶菌酶溶液，取0.1～0.5mL無活性的去折疊態溶菌酶溶液，緩慢加入復性緩沖液，混勻，得到10mL復性體系溶液；4)在復性體系溶液中加入粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺—丙烯酸鈉)共聚凝膠，凝膠質量濃度為復性體系溶液中溶菌酶質量濃度的160～560倍，溶液在溫度為20～40℃、轉速為100～140rpm的搖床中復性16～24h。
2. 根據權利要求1所述的一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共 聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，其特征在于所述的N-異丙基丙烯酰胺采用 正己垸重結晶。
3. 根據權利要求1所述的一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共 聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，其特征在于所述的變性緩沖液為含有 8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸鈉和30mmol/L 二硫蘇糖醇的O.lmol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，pH8.5。
4. 根據權利要求1所述的一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，其特征在于所述的復性緩沖液為含有lmmol/L乙二胺四乙酸鈉、3mol/L尿素、0.15mol/L氯化鈉、3mmol/L還原型谷 胱甘肽和0.375mmol/L氧化型谷胱甘肽的0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-鹽 酸溶液，pH8.5。
5. 根據權利要求1所述的一種粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺一丙烯酸鈉)共 聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，其特征在于所述凝膠在溶菌酶復性完成后 可通過升高溫度至凝膠相變溫度之上，使凝膠縮水從而排出凝膠網格中的蛋白 溶液，再進行離心過濾即可將凝膠從復性液中分離回收，重復使用。
全文摘要
本發明公開了一種用粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性的方法，具體步驟如下1)反相懸浮聚合法制備粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸鈉)共聚凝膠；2)粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸鈉)共聚凝膠協助溶菌酶體外復性。本發明所開發的粒狀聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸鈉)共聚凝膠，作為一種新型的蛋白質體外復性添加劑，具有以下優點①在高變性蛋白濃度條件下可顯著提高目標蛋白的活力回收率；②復性完成后可利用凝膠的溫敏特性方便地分離回收，凝膠可重復利用；③可以通過控制共單體丙烯酸鈉的含量來調節凝膠的疏水性能，改變低臨界溶解溫度和最大溶脹倍率，使其適用于不同的目標蛋白。因而該凝膠在蛋白質復性領域具有較好的應用前景。
文檔編號C12N9/36GK101363018SQ20081016165
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月19日 優先權日2008年9月19日
發明者關怡新, 姚善涇, 翔 葛, 金佳鈺 申請人:浙江大學