專利名稱：Hccr基因核酸原位雜交檢測試劑盒和檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測和疾病診斷領域，更具體地涉及癌癥的基因 檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數170 萬，死亡人數近170萬，患者600多萬，全球每年新增癌癥患者800 萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400萬人，到2020年以上人數 將翻一番。男性癌癥發病率和發生部位以肺、肝、胃依次排列；女性 是乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌依次排列，以上幾種癌癥已占總癌癥病 例的一半以上。
2005年美國國立衛生院(NIH)癌癥研究院、疾控中心等多家單位對"抗癌 大戰"進行年度回顧，認為人類在抗癌戰役中，沒有取得勝利，原因是癌癥死亡 率沒有降低。年度報告中指出幾個問題與失敗有關l.動物模型設計有缺陷；2. 癌細胞多態性；3.癌細胞的耐藥性。中國的財經雜志在今年八月份也發表了中國 在癌癥戰役中大潰敗的文章。本發明人在研究中認識到，應該補充二個重要的 內容早期診斷乏力；癌癥轉移機制的研究不夠。
以往早期診斷的概念有待進一步的探討，傳統的生化指標和醫學影像的早 期診斷，實際不是真正科學的早期診斷，特別是以腫塊2公分以下屬于早期這 一界定，是導致癌癥死亡率不降的真實原因。以細胞學的角度，l公分的腫塊約 有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加的數目遠不止2億個腫 瘤細胞。同樣生化檢測對早期診斷有時會不敏感，比如AFP對早期肝癌的診斷 敏感度不高，超過2公分以下的肝癌陽性率較低。事實上，從單克隆的癌細胞 到癌塊在2公分左右，已有相當長時間的病理演變過程，可能是一年或兩年，甚至更長。這個過程難以證實腫塊是唯一的發生地和孤獨的癌癥病灶。 一旦形 成腫塊的同時，其他癌細胞通過不同途徑遷移到其他部位克隆生長或在同一器 官有多個發源地，快慢不均的生長。這在臨床上已得到了證實,一旦腫塊被切除 后，其他部位或臟器有轉移或復發。因此，臨床上以2公分以下的腫塊大小來 界定早期與否，不夠嚴謹(當然有些病例在發現原發病灶時，也發現轉移灶，
這種情況不是我們要表述的內容)，這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。
隨著分子生物學和腫瘤分子病理生理學，功能基因組學，疾病基因組學， 癌癥基因組學的研究深入，以及分子生物技術的日益完善，至今有可能在癌變 前期或癌細胞形成(單克隆時)或突破血管壁早期轉移時,就能做到早期預測 診斷，這一技術的實施可能是腫瘤診治方法的一次革命。做到更科學的早期診 斷、早期預防、早期治療，希望徹底治愈癌癥。
本發明的癌癥早期診斷試劑盒的臨床價值和創新點在于基因水平，即癌變 前期或癌變細胞中檢測與肝癌，乳腺癌，卵巢癌，子宮頸癌等有關的癌癥密切
相關的HCCR基因的表達程度，早于蛋白標記物產生以前，當然更早于腫瘤形 成之前，檢測HCCR基因的變化信息，做到真正意義上的早期診斷。
HCCR基因被發現與肝癌，子宮頸癌，乳腺癌，卵巢癌等發生密切相關。 實驗研究表明HCCR基因在細胞培養中促進不同種類癌細胞增長作用。實驗研 究和臨床研究表現HCCR基因在子宮頸癌，乳腺癌，卵巢癌及肝癌等癌癥中表 達增加。已有學者用HCCR蛋白作為靶標記物來檢測宮頸癌，乳腺癌，卵巢癌 及肝癌的發生率。在上述癌癥患者中，HCCR蛋白表達異常高，可以作癌癥檢 査的生物標志物。
本發明公開的癌癥早期基因診斷試劑盒是采用核酸原位雜交技術，以HCCR 基因為癌基因為檢測對象。HCCR基因的序列全長523bp (Human cervical cancer oncogene binding protein),位于染色體12q的位點上，合成的探針是HCCR基因 的DNA序列，探測的底物是人體血液標本的白細胞或組織細胞的mRNA。原位 雜交技術的顯色能提供HCCR基因半定量表達程度判定，正常人HCCR基因不 表達。前述的癌癥病患有不同程度的高表達。
發明內容
為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下
本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標 記物，其中，所述的雜交探針分別具有序列表SEQIDNO:l所示。基 因的核苷酸序列長度是523bp，位于染色體12q位點上。其中，所述 的標記物選自放射性核素或非放射性標記物，所述的放射性核素選自 3H、 35S、 1251或32P中的一種，所述的非放射性標記物選自生物素、地 高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種，所述的非放射性標 記物優選自地高辛，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
本發明的癌癥早期診斷、轉移復發基因診斷試劑盒應用價值在于， 能在基因水平，及早對癌癥的發生和轉移，以及在治療后及早檢測癌 癥復發轉移的病變情況，因HCCR基因與癌癥的發生有特異相關,是致
癌基.因o
本發明還提供一種HCCR基因原位雜交的檢測方法，包括以下步
驟
(1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條 件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2) 檢測所述雜交復合體。
本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交 復合體的條件為核酸雜交的溫度為42'C;核酸雜交的時間為16—24小時。
本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血 液白細胞標本或其他器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標 本或其他器官組織細胞標本來自癌癥和/或伴有轉移灶的患者、健康 人。
本發明所述的檢測方法，其中優選地是肝癌、乳腺癌、子宮癌、 肺癌、腦癌。
本發明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以HCCR基因為檢測對象，合成探針是HCCR基因的DNA或RNA 序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達 量。原位雜交技術的顯示方法能提供HCCR基因的半定量或定量表達 程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上兩基因的表達量，正常 人HCCR基因不表達，HCCR基因在癌癥病人高表達，和正常人有顯 著差異。
本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增 效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知， 具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行 定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1.儀器操作
1) .將待測標本放入反應槽中；
2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3) .儀器自動棄去液體，自動后固定；
4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
6) .儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
8) .儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本核酸原位雜交的流程圖是分子生物學業內人士均熟知的雜交探針的制 作、標本處理、預雜交、雜交、結果檢測分析的全過程。
圖1是本發明實施例中肝癌病人HCCR基因過量表達圖片 圖2是本發明實施例中正常人HCCR基因過量表達圖片。
具體實施例方式
下面將根據流程過程，展開實施的步驟，更具體地說明本發明的內容。應 該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變或變 通將落入本發明的保護范圍。
實施例1
按照常規方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以DLK1基 因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。
試劑盒組成
消化液100pL/管l管/盒無色透明液體
保護液100pL/管l管/盒無色透明液體
預雜交液1300[iL/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10liL/管l管/盒無色透明液體
反義雜交液10pL/管l管/盒無色透明液體
封閉液1000nL/管l管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體W管l管/盒無色透明液體
顯色劑A175nL/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320jiL/管1管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90mL/瓶1敏盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II 10x80mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III 10x20mL/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液卯mL/瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1. 消化液20mg/mL蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，力卩DEPC-H20 5mL;
2. 保護液0.2g的glycine加入lmL的lx緩沖液I;3. 預雜交液lx緩沖液II7.5mL 50xD 3mL
10mg/ml yest t-RNA 750uL
1 lmg/ml SALMON TESTES DNA 682uL
0.04M EDTA 3mL
50% formamide 15mL
4. 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入lmL lx緩沖液III;
5. 10x緩沖液I: (PH7.1-7.4) NaCl 80g
Na2HP04.12H20 360g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至IL，并高壓滅菌；
6. lOx緩沖液n: (PH7.0) NaCl 175.3g
檸檬酸鈉88.2g HC1 幾滴
加三蒸水至1L，并高壓滅菌；
7. 緩沖液III: (PH7.9) Tris 12Ug
NaCl 87.66g HC160mL左右 加三蒸水至1L，并高壓滅菌；
8. 緩沖液IV:
1M Tris-HC1(PH9.5): Tirs 12Ug加HC1 3ml左右，加水900mL，調PH至 9.5,加水至1L，并高壓滅菌；
1MNaCl: NaCl 58.44加水至1L，并高壓滅菌； 0.5MMgCl2: 101.65gMgCl2.6H20加水至1L，并高壓滅菌；9. 固定液多聚甲醛40g加lx緩沖液I至1 L，稍加熱(約50-60度)攪拌至 溶解；
10. 顯色齊!]A: NBT lg加70%DMFlL44mL;
11. 1顯色劑B: BCIPlg加100%DMF30mL。
實施例2
標本處理
1) .用10ml的離心管，裝4.5ml淋巴細胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢加入 含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液^:1.5)的離心管中,2000r/min離心10 min
2) .吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的lx緩沖液I， 混勻，1500g/min離心10 min
3) .棄上清.沉淀加入約兩倍的lx緩沖液I,混勻，1500g/min離心10 min
4) .棄上清,并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在 玻片上推片，自然干燥。(有條件的醫院可以用制片機制片。)3 ml血，可以做4 張片子。
5) .用40ml 4%固定液,在玻璃缸中，固定30min,再用lx緩沖液I洗5min。每 缸可以放16片。
6) 標本可保存在-20'C，或繼續做實驗。
實施例3
將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1) .將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I ;
2) 潛20x緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2x緩沖液I1;
按1:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成0.1 x緩沖液II;
3) .將10x緩沖液m用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液III;
4) .10x緩沖液IV用三蒸水按l:10稀釋成x緩沖液IV(取1弁，2#， 3弁各10mL， 加水至100mL既可)。實施例4
實驗步驟
1) .取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復査用)及陽性對照標本兩張 (每次實驗做一對陽性對照)。
2) .在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加lx緩沖液199.9ml，即為使用濃度)20 ml。 37'C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37匸處理12 min,再用lx緩沖液 I洗5min.
3) .用0.2%的保護液(保護液lml加lx緩沖液I99ml即為使用濃度)洗10min, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥。
4) .將玻片放入保濕盒內，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42"C恒溫水浴箱中3h以上。
5) .取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內,用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥
6) .將玻片放入保濕盒內,每位病人標本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片，另 一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42X:恒溫水浴箱中 16-24h。
7) .取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內
在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液II洗兩次，每次15min 在42。C恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次，每次15min 在42'C恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液II洗兩次，每次15min
8) .用lx緩沖液III洗30s，取出玻片,自然干燥
9) .將玻片放入保濕盒內，加0.5%1封閉液(lml封閉液加5mllx緩沖液m) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。
10) .取出玻片,用lx緩沖液III洗30s，自然干燥
11) .將玻片放入保濕盒內,加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllx緩沖液m)100u1/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min
12) .取出玻片，用lx緩沖液III洗3次，每次15min13) .lx緩沖液IV洗2min，加顯色齊[J(顯色劑A73.3ul，顯色劑B157.5ul加到 30mllx緩沖液IV中,混勻),室溫避光12h以上
14) .用三蒸水洗5min,自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片鏡
檢
實施例5
結果判斷
在光鏡下計數100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。 陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。
本發明的一個優選實施例的方案是以HCCR基因為目的基因合成的核酸 探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不但探針的 具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內 源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進 行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染 色的細胞數，判斷目的基因的表達量。
本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中 的HCCR基因表達量，用來確定癌癥是否發生，研究表明HCCR基因是致癌基 因，因為HCCR基因在正常人中低表達，如果HCCR基因表達高，說明癌癥已 經發生，從而獲得癌癥的診斷信息。 一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
實施例6
肝癌病人5名，正常對照組10名。抽所有待檢人的外周血3-5毫 升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌癥患者HCCR基因 有過度表達，細胞染色；正常對照組HCCR基因不表達，細胞無染色。 具體結果請見圖1是肝癌病人的HCCR基因表達圖，圖2是正常人 HCCR基因表達圖片。
本發明具有如下有益效果本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測癌癥發生、侵潤轉移動態過 程，同時可檢測癌癥治療后的轉移復發狀況，以及用于癌癥預防醫學 檢測。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及 影像醫學檢査有顯著不同。本發明可以在基因水平上(癌變前期或癌
細胞增殖)檢測HCCR基因異常表達，在影像醫學檢查未發現占位性 癌病灶之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫塊之前，能 及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的 早期診斷和轉移侵入以及治療后轉移復發及早預測。這樣才有可能實 施癌癥的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治 癌癥惡疾。
此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同 時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用 和推廣。序列表
SEQUENCE LISTING <110〉芮屈生物技術(上海)有限公司
<120>HCCR基因核酸原位雜交檢測試劑盒和檢測方法和應用 <130> /
<150> 200710171738.4 <151> 2007-1卜30
<160> 1
<170>Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 336
<212> 醒
<213> Homo sapiens
〈400> 1
atgtccgtgg agacactgtg gaaagtctgg accgagctct tggatgttct tggacttgac 60
gtctccaacc tgtcccagta tttcagccca gcctcggtgt ccagcagccc ggcccgcgcg 120
ctcctgctgg tcggcgtcgt cctcctggcc tactggttct tgtccctgac cctgggcttc 180
actttcagcg tcctgcacgt ggtgttcggc cgcttcttct ggatcgtgcg gtcgtcctgt 240
tttccatgtc ctgcgtgtac atcctgcaca agtacgaggg cgagccggag aacgcggtgc 300
tgccgctgtg cttcgtggtg gccgtctact tcatga 33權利要求
1. 一種HCCR基因核酸原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。
3. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的 標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的放射 性核素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中 的一種。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標記物優選自地高辛。
7. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種HCCR基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟a、將權利要求1或2所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測 RNA接觸，形成雜交復合體；.b、檢測a步驟得到的雜交復合體。.
9. 根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16_24小時，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其他器 官組織細胞標本，優選地是，所述的血液標本或其他器官組織細胞 標本來自癌癥和/或伴有轉移灶的患者、健康人。
10. 根據權利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測癌癥早期疾 病藥物中的應用，所述的癌癥是肝癌、乳腺癌、子宮癌、肺癌或腦 癌。
全文摘要
本發明涉及一種HCCR(Human cervical cancer oncogene binding protein)基因癌癥早期的原位雜交檢測試劑盒，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO1所示。本發明還提供了一種HCCR基因的原位雜交檢測方法。本發明的檢測試劑盒和檢測方法能在基因水平檢測癌變前期或癌變細胞中HCCR基因的表達量，早于蛋白標記物產生以前、更早于腫瘤形成以前，就能檢測HCCR基因變化信息，做到真正意義上腫瘤的早期診斷。本發明優點在于提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點；檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101429554SQ20081017961
公開日2009年5月13日 申請日期2008年11月25日 優先權日2007年11月30日
發明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司