專利名稱：一種在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體的制作方法
一種在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體 [技術領域]
本發明涉及利用香蕉果實特異表達Banlec基因啟動子攜帶葡萄 甚合酶基因構建植物表達載體。
為了培育具有較高經濟價值和保健功能的水果，我們將從葡萄中 克隆的芪合成酶基因，構建含有果實特異表達啟動子和芪合酶基因的 植物表達載體，轉化番茄。
本發明提供的技術方案為 一種在果實中特異表達白藜盧醇的植 物表達載體，其特征在于載體中啟動子為香蕉凝集素基因啟動子，載 體中目的基因為葡萄芪合酶基因。
上述在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體的構建方法為 葡萄芪合酶基因克隆、植物表達載體pBIL2雙酶切去除gus基因、回 收酶切載體大片段、葡萄芪合酶基因PCR產物回收及酶切回收、載體 大片段與葡萄芪合酶基因連接構建果實特異表達白藜蘆醇的植物表 達載體。
一、葡萄芪合酶基因克隆
提取葡萄雷司令品種葉片總DNA,根據文獻報道的序列設計引 物5'端添加酶切位點的芪合酶基因PCR引物(S. Kobayashi et al.， 2000):
5' Primer CCteXfCCGCTTCAATTTCATTACGT
3' Primer CCJAGCfccTCCTATTTGATACATTA
I
以葡萄雷司令品種的總DNA為模板進行PCR反應，反應體系及 反應條件如下
Template DNA 1.0叱10 XPCR buffer 2.5叱
dNTP(10mMeach) 1.0叱
Taq Polymerase 0.5 ML
Primer 1(1 OuM) 1.5 1^
Primer 2(1 OuM) 1.5叱
ddH2Q_18.5叱
Total 25叱
95。C變性lmin; 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸2min， 35個循環；72。C延伸10min。
PCR產物凝膠電泳顯示，獲得一條1.5kb大小的條帶，與文獻報 道相符。目的條帶連接pGEM-Teasy Vecter,交與上海生物工程公司測 序，結果與文獻中報道的序列(S. Kobayashieta1.,2000)同源率99%。
二、植物表達載體pBIL2雙酶切去除gus基因
pBIL2植物表達載體質粒DNA用5awHI、 5bcl雙酶切，切去載 體上的gus基因，1%瓊脂糖電泳凝膠回收載體大片段。反應體系及反
應條件如下
pBL2 plasmid 10叱
DNA(0.4ug/uL)
10X Buffer K 5.0叱
B簡HI (15units/uL;) 5.0 PL
(15units/uL) 5.0 ML
BSA(100X) 5.0 PL
ddH20_20叱
Total 50.0 PL
混勻后，稍稍離心，37-C水浴，3h。凝膠電泳檢測酶切結果。 三、葡萄芪合酶基因PCR產物回收及酶切回收 葡萄芪合酶基因PCR產物1%瓊脂糖電泳回收，回收的目的產物用與載體pBIL2相同的內切酶B"mffl、 5WcI雙酶切，酶切體系及反應條 件如下。酶切產物利用瓊脂糖凝膠電泳回收。
LAB PCR product 3.0 PL (lug/uL)
10XBuffer K 5.0叱
BawHI (15units/uL) 5.0 PL
SacI(15units/uL) 5.0 ML
BSA(100X) 5.0 PL
ddH20_27 ML
Total 50.0 PL
四、載體大片段與葡萄芪合酶基因連接構建果實特異表達白藜蘆 醇的植物表達載體
在0.5mL無菌離心管中依次加入經過雙酶切的pBIL2載體片段與 同樣雙酶切的葡萄茛合酶基因PCR產物進行連接反應
pBIL2 DNA 2.0 ML
LAB DNA 2.0叱
T4DNAlagase 1.0叱
10 X lagation buffer 1.0 PL
ddH20__4.0 uL
Total 10.0 uL
16"C水浴，16h進行連接反應。連接產物轉化￡."http://0115感受態細胞， 得到重組質粒。質粒DNA用&mHI、 5^1酶切切下與目的基因大小 相同條帶，初步推測目的基因已經插入植物表達載體預定位置，將載 體交與上海生工公司測序，表明目的片段已插入植物表達載體中。將 其命名為pBIB2。
8五、結果分析
(一) 成功構建果實特異表達啟動子攜帶葡萄芪合酶基因植物表 達載體采用SflmHI、 &CI內切酶對構建的植物表達載體進行酶切鑒 定，酶切結果證明目的基因已經插入到載體中，同時對插入的序列進行
序列測定分析,與己發表的葡萄芪合酶基因100%同源。
(二) 載體pBIB2導入農桿菌GV330h將載體pBIB2采用三親 交配法導入農桿菌GV3301，導入表達載體的農桿菌投于三抗 (Kanl00mg/L,Rif25mg/L，S tr25mg/L)培養基上，挑選克隆提取質粒 DNA，用葡萄芪合酶基因引物進行PCR鑒定，證明載體pBIB2已成功
導入農桿菌。 '
(三) 載體pBIB2轉化番茄用含有pBIB2載體的農桿菌浸染 番茄子葉,經過在Kan70mg/L抗性培養基誘導愈傷、分化出苗及生根 篩選，獲得10株抗性番琉植株。
(四) 轉基因番茄分子檢測及目的產物測定對獲得的IO株抗性 植株經過PCR和Southern blot檢測證明6株抗性篩選的番茄插入 了目的基因，即外源的葡萄芪合酶基因己經插入到番茄基因組中，其 中1株未結果實。RT-PCR和Northern blot檢測6株轉基因番茄的 葉片和成熟果實，1株的葉片有目的基因的表達，結果的5株均在成熟 的果實中大量表達。采集轉基因番茄的葉片、莖、幼果和成熟果實， 采用高效液相色譜(HPLC)分析，檢測白藜聲醇含量，5株果實均測到 白藜蘆醇；第2、 6株的莖、葉中也測到了微量白藜蘆醇，但其含量 僅有果實白藜蘆醇含量的1/10-1/20。實驗結果證實我們構建的植物 表達載體能夠在植物的果實中特異表達白藜戶醇。
具體實施方式
一種在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體，其特征在于 載體中啟動子為香蕉凝集素基因啟動子。載體中目的基因為葡萄貧合 酶基因。下面結合實施方式對本發明進行詳細說明一、 材料
番茄a少copem'co". w)(純系TX0014)由中國熱帶農科院品質資 源所提供。
二、 方法
(一)凝集素基因啟動子連接葡萄芪合酶基因植物表達載體的構
建
1、 芪合酶基因PCR擴增
根據已發表的芪合酶基因序列設計兩個引物
5' Primer CCGGATCCGCTTCAATTTCATTACGT 3' Primer CCGAGCTCCTCCTATTTGATACATTA 利用葡萄的總DNA為模板進行PCR反應，取5.0ulPCR擴增反 應液進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳30min后， 通過凝膠成像系統觀察并照相。獲得一條長約1500bp的條帶，測序 證明是葡萄芪合酶基因。
2、 芪合酶基因PCR產物回收
采用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收芪合酶基因 PCR產物。
回收的PCR產物及pBIL2植物表達載體用BamHl、 Sacl
雙酶切
將下列反應體系分別加入到兩個無菌的1.5ml離心管中進行酶 切。
LAB DNA 3.0ML
Buffer K 2，L BamHl
Sacl 5凰
BSA 5凰ddH20_ 29里
Total 50M
PBIL2 IO.O叱
Buffer K 2.5叱
BamHl 5.0叱
Sacl 5，L
BSA 5服
ddH20_ 22.5叱
Total 50凰 37 。C水浴，3. 5h。
4、 回收芪合酶雙酶切及凝集素基因啟動子表達載體(pBIL2) 雙酶切目的片段，方法同2。
5、 芪合酶基因片段與PBIL2載體雙酶切片段連接構建載體 pBIB2:
酶切pBIL2載2.0叱
體
酶切甚合酶基因 2.0叱
T4DNAlagase 1.0叱
10 Xlagation buffer 1.0 ML
ddH20 _4.0 uL
Total 10.0 uL
16。C水浴，16h。
連接產物用3反應體系進行酶切鑒定，篩選果實特異表達啟動子 攜帶葡萄芪合酶基因的植物表達載體。
(二)pBIB2質粒導入農桿菌GV3103
采用三親交配法將含有Rifamycin (簡稱Rif)和Streptomycin (簡 稱Str)抗性的農桿菌GV3103、含有Kan抗性的大腸桿菌"協助"質粒PRK2013和含有Kan抗性的帶有pBIB2植物表達載體的新鮮活 化的大腸桿菌等體積混勻，涂布于不含任何抗生素的YEP固體培養 基上，28匸過夜培養。菌生長到OD,為0.5左右時，用接種環將長 出的菌落轉接到含有100mgL Kan、 25mgL Rif和25 Str的YEP 固體培養基上，挑取三親交配后經抗性培養長出的獨立菌落，于三抗 液體培養基(KanlOOmg/L, Rif25mg/L, Str25mg/L)，搖菌提取質粒 DNA，檢測外源目的基因是否導入農桿菌。 (三)GV3103介導的番茄遺傳轉化
1、 播種番茄種子用70%乙醇浸泡lmin，再用20%次氯酸鈉 溶液處理20min，期間不斷地輕微攪動。用無菌水沖洗3遍后播種于 MS培養基上。
2、 農桿菌培養從平板上挑取一個新鮮活化的pBIB2單菌落， 接種到2mL附加相應抗生素的YEP液體培養基(Kan: 100m經L、 Rif: 50mgL、 Str: 50rngU中，在28。C恒溫搖床，180rpm/min培養至OD600 為0.6—0.8。取OD麵為0.6 —0.8的菌液，按1%的比例，轉入新配制 的無抗生素的20mL YEP液體培養基中，在與上相同的條件下培養至 OD6o。為0.5。將培養物倒入一無菌離心管中，5000rpm/min 禺心lmin 收集菌體。用20mLMS液體培養基重懸菌體，5000rpm/min離心lmin 收集菌體。最后用20mLMS液體培養基重懸菌體。
3、 侵染于超凈工作臺上，將菌液倒入無菌小培養皿中同時加 入250umol/L的乙酰丁香酮(AS)。從無菌培養的組培苗切取0.5X 0.5cm的子葉小塊，放入菌液中，浸泡5min，并輕搖培養皿，使葉片 與菌液充分接觸。取出葉片于無菌濾紙上吸去附著的菌液，但不可吸 干。
4、 培養將浸染過的葉盤接種在分化培養基上(MS+6-BA2mg/L +IAA0.2mg/L)，其中含AS 250umol/L，在28。C暗培養條件下共培養 2天。
5、 選擇培養將經過共培養的葉盤轉移到加有選擇壓的(MS+6-BA2mg+ IAA0.2mg/L+Kan70mg/L)分化培養基上，在光照為 2000 — 10000LX， 16小時光照，8小時黑暗，25'C條件下進行選擇培養。
6、 繼代選擇培養每10天轉移一次培養基，待葉盤的轉化細 胞分化出抗性不定芽后，將這些抗性材料轉入相同的選擇培養基中進 行繼代擴繁培養，并同時以未轉化的植株在抗性培養基上的培養作為 陰性對照。
7、 待不定芽長到lcm以上時，切下單株并轉入到 (1/2MS+IAA0.lmg/L +Kan70mg/L)生根培養基上進行生根培養。
8、 待根長到l-1.5cm時，將試管苗經過10-15天時間的練苗后， 移植大田。
(四)轉化番茄的鑒定 1、 PCR檢測
提取抗性篩選的轉化番琉植株葉片的總DNA,用合成的葡萄甚 合酶基因5'、 3'引物，以抗性番茄植株葉片總DNA為模板，進行 PCR擴增。在0.2mL無菌PCR管中依次加入
Sample DNA(層ng)1.0 PL
10 X Buffer2.5叱
dNTP (10uMeach)0.5 PL
Taq Polymerase0.5 PL
Primer 1(1 OuM)1.5叱
Primer 2(1 OuM)1.5叱
ddH2018叱
Total25叱
95。C變性lmin; 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸2min， 35個循環;72。C延伸10min。
2、轉化植株的Southern blot檢測取7個1.5mL離心管，6個分別加入6株轉基因番茄葉片總 DNA，另一管加入未轉基因番茄基因組DNA各40.0ug，每管加入 五coRI輕輕混勻后，于37。C溫育4h酶切。
酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳在轉到尼龍膜上，按照分子克 隆手冊上描述的方法進行Southern雜交。
3、 轉基因番茄RT-PCR檢測
采用上海生物工程公司生產的UNIQ-10柱式總RNA抽提純化 試劑盒提取番茄葉片、果實RNA，按照反轉錄酶說明書反轉錄cDNA 第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。在0.2mL無菌PCR
管中依次加入
cDNA 1.0叱
10 X Buffer 2.5化
dNTP (10uMeach) 0.5叱
Taq Polymerase 0.5 ML
Primer 1(10uM) 1.5叱
Primer 2(10uM) 1.5 ML
ddH20_18 ML
Total 25 PL
95。C變性lmin; 94。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸2min， 35個循環；72。C延伸10min。
4、 HPLC分析
取6株轉基因番茄的莖、葉、果材料，進行高效液相色譜 (HPLC)分析，檢測各器官中白藜戸醇的含量(由農業部植物質量測 試中心檢測)。
權利要求
1. 一種在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體，其特征在于載體中啟動子為香蕉凝集素基因啟動子。載體中目的基因為葡萄芪合酶基因。
2. 根據權利要求1所述的用香蕉凝集素基因啟動子替代植物表達載體pBI121 上的CaMV35S啟動子。
3. 根據權利1要求所述的目的基因為葡萄芪合酶基因,其特征在于用葡萄芪合酶 基因置換權利要求2所述載體中的gus基因，構建成在香蕉凝集素基因啟動 子下游含有葡萄芪合酶基因的果實特異表達白藜蘆醇植物表達載體。
全文摘要
一種在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體，涉及在果實中特異表達白藜蘆醇的植物表達載體，該載體利用香蕉果實特異表達的凝集素基因啟動子取代植物表達載體pBI121上的組成型35S啟動子，以葡萄芪合酶基因置換pBI121上的gus基因。利用農桿菌浸染法將該載體進行番茄轉化，PCR檢測和Southern blot檢測證明外源基因成功插入番茄基因組中；RT-PCR檢測和Northern blot檢測證明香蕉凝集素基因啟動子驅動芪合酶基因在番茄果實中特異表達。該啟動子的獲得，為在果實中特異表達白藜蘆醇提供了有利的工具，特別是利用該載體培育具有保健功能的水果新品種奠定了基礎。因此，該啟動子在今后的轉基因研究中具有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/82GK101440377SQ200810181490
公開日2009年5月27日 申請日期2008年11月11日 優先權日2008年11月11日 公開號200810181490.發明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 李美英, 楊小亮, 賈彩紅, 金志強 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所;中國熱帶農業科學院海口實驗站