專利名稱：一種核殼結構基因載體系統的組裝方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及納米生物醫藥技術領域，具體地說是一種核殼結構基因載體 系統的組裝方法及用途。
背景技術：
基因治療由于可從基因水平治療或預防先天性遺傳疾病或后天獲得性疾 病，在生物醫藥領域開創了一條治療疾病的革命性的新途徑。盡管在過去的
20多年，臨床試驗不下千次，因其效果不理想致使美國食品和藥物安全局至 今仍未批準認可任何一個基因治療方案，因此，提高治療基因的轉染效率及 艽臨床安全性依然是具有挑戰性的課題。病毒型載體基于轉染效率高的優點 應用于大多數臨床試驗，然而其高免疫原性、致癌性、非導向性、不能多次 用藥、制備成本高等缺陷使毒性低、免疫原性低、臨床安全性更高、易于制 備的非病毒基因型載體受到更多的關注。
基于聚乙烯亞胺(PEI)的聚陽離子因其良好的基因轉染效率、結構易于 改造等特點，作為基因載體成為人們廣泛研究的對象，但因其易于非特異性 吸附血紅蛋白而導致在血漿中的轉染效率較低。Kissel等用聚乙二醇修飾PEI
(Bioconjugate Chem. 2006， 17, 1209-1218)，以期減少對血紅蛋白的吸附， 但卻降低了細胞對聚合物/基因復合納米粒的內吞能力，轉染效率不理想。
發明內容
本發明的目的是利用線形低分子量聚乙烯亞胺(PEI)開環a， (3-聚(L-天冬氨酸)合成刷子狀的聚陽離子基因載體，通過低分子量PEI對a， p-聚(L-天冬氨酸)的高接枝率，提高低分子量PEI的"質子海綿效應"，即提高其基 因轉染效率并維持其低毒性。再將刷狀聚陽離子a， p-聚(L-天冬氨酸-g-聚乙烯亞胺)(AE)與DNA通過電荷相互作用能自組裝形成核殼結構的納米粒子，
該納米粒子具有高的基因轉染效率，因基于其親水的殼層，可減少對蛋白的 吸附，從而使該核殼結構的納米基因載體系統在血漿存在下具有良好的基因 轉染效率，可望用于體內基因治療。
本發明的目的是這樣實現的
(a) 刷狀聚陽離子的合成
將毒性低的、小分子量PEI接枝到水溶性好、毒性低的聚合物上，獲得水 溶性好、毒性低的刷狀聚陽離子。即將小分子量PEI完全開環聚(L-天冬酰亞 胺)(PSI)，純化得a， P-聚(L-天冬酰亞胺-g-聚乙烯亞胺)(AE);具體是
(1) a， p-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI)的合成 在1L圓底燒瓶中加入25克(0. 19 mol) L-天冬氨酸粉末和12. 5克85%的磷
酸，混合均勻，于旋轉蒸發儀上185 。C減壓反應3小時至不再有水蒸汽產生為 止，加入150mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液攪拌溶解固體物，然后在攪拌下將 得到的溶液緩慢滴加到盛有1000mL水的燒杯中，得白色沉淀，靜置，傾去上 清液，過濾，將固體用水洗至中性，于50 。C真空干燥48小時，得粉狀固體一 a ， P-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI);
(2) 、聚乙烯亞胺(PEI)開環a，后-聚(L-天冬酰亞胺) 取低分子量Mm 423的聚乙烯亞胺(PEI)和上步驟得到的a ， 0 -聚(L-
天冬酰亞胺)(PSI)、將其分別溶解于二甲基甲酰胺(DMF)溶液，再按摩爾
比l :3 (PSI/PEI)混合，于室溫下攪拌22h，過濾后，溶液用3500^透析袋 在室溫下透析6天，冷凍干燥得刷狀聚陽離子(a， (3-聚(L-天冬酰亞胺-g-聚乙
烯亞胺)} (AE);
(b) 核殼結構基因載體系統的組裝將(a)步驟所得刷狀聚陽離子(AE)與DNA溶液按N:P比為(5、 10、 20、 30或40充分混合，室溫靜置24小時，得AE/DNA復合納米顆粒即為核殼結 構基因載體系統。納米顆粒的核層由聚乙烯亞胺與DNA通過電荷相互作用形 成的復合物組成，納米顆粒的殼層由親水性聚合物構成。
所述刷狀聚陽離子的分子量不小于10KDa。
所述核殼結構基因載體系統用于HeLa、 293T或H印G2細胞的基因轉染，尤 其是在血清存在下的基因轉染。
本發明刷狀聚陽離子的合成方法簡單，成本低廉；由于所用原料無毒， 所得刷狀聚陽離子基因載體的毒性很低；該刷狀聚陽離子與DNA通過電荷 相互作用能形成核殼結構的納米粒子；該納米粒子具有高的基因轉染效率； 基于其親水的殼層，可減少對蛋白的吸附，從而使該核殼結構的納米基因載 體系統在血漿存在下具有良好的基因轉染效率，可望用于體內基因治療。
圖1為刷狀聚陽離子(AE)合成路線圖
圖2為AE的& NMR譜圖
圖3為AE/DNA復合物凝膠電泳圖
圖4為DNA保護和釋放實驗圖
圖5為N : P = 10時AE/DNA復合物的EF-TEM圖
圖6為AE的細胞毒性，(a) 239T; (b) HeLa; (c) HepG2
圖7為AE/DNA (pGL3)在不同N : P比對不同細胞系的轉染效率，(a) 239T;(b) HeLa;(c) HepG2
圖8為AE/DNA對HeLa細胞在血清存在下的基因轉染效率具體實施方式
實施例
(x， P-聚(L-天冬氨酸-g-聚乙烯亞胺)(AE)的制備、核殼結構基因載體
系統的組裝及其結構表征和性能評價
(1) 、 (x， |3-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI)的合成 在1L圓底燒瓶中加入25克(0.19 mol) L-天冬氨酸粉末和12.5克85。/。的磷
酸，混合均勻，于旋轉蒸發儀上185 t:減壓反應3小時至不再有水蒸汽產生為
止。加入150 mL DMF攪拌溶解固體物，然后在攪拌下將得到的溶液緩慢滴 加到盛有1000 mL水的燒杯中，得白色沉淀，靜置，傾去上清液，過濾，將 固體用水洗至中性，于50 "C真空干燥48小時，得粉狀固體(PSI) 17克，產率 93% 。
(2) 、小分子PEI (Mn: 423)開a， (3-聚(L-天冬酰亞胺) 先將PEI423和PSI分別溶解于DMF，在按摩爾比1:3 (PSI/PEI)混合，于
室溫下攪拌22h。過濾后，溶液用3500^透析袋在室溫下透析6天，冷凍干燥。 由圖2可知，用PEI開環PSI合成的AE具有很高的接枝率。
(3) 、凝膠電泳
新鮮制備不同N : P比的AE/DNA復合物(納米顆粒)，室溫下放置孵育 20分鐘，加入2pl染料，再放置10分鐘，將混合溶液裝載于含溴化乙錠的瓊脂 凝膠上，在TAE電泳緩沖溶液中100V的電壓下電泳40分鐘后紫外曝光拍照。 由圖3可知，PEI423因其分子量小，甚至當N:P比為30時，也不能有效的縮 合DNA。然而，AE/DNA復合物即使N : P比為3， DNA的遷移相當遲緩，說 明AE/DNA復合物對DNA有很強的縮合能力。
(4) 、 DNA保護和釋放實驗
N : P比為5的AE/DNA復合物和DNA質粒分別用l(alPBS或DNase-I在DNase/Mg2+消化緩沖溶液中孵育。為使DNase失活和釋放DNA，所有樣品均 用4iil250mMEDTA處理10分鐘，再用8plSDS處理。樣品在室溫下孵育2h， 然后加入3ial染料，進一步孵育10分鐘，將混合溶液裝載于含溴化乙錠的瓊脂 凝膠上，在TAE電泳緩沖溶液中50V的電壓下電泳1小時后紫外曝光拍照。由 圖4可知，裸DNA在30min內被DNase-I直接降解，而N : P比為5的AE/DNA 復合物有效保護了DNA以免其被酶水解。
(5) 、 EF-TEM觀察形貌
復合物溶液中DNA的濃度為20 pg/ml用于EF-TEM測試，取10pl N : P比 為10的AE/DNA復合物小心地滴到干凈的銅網并用pH為7.4質量分數為1.5y。 的磷鎢酸染色5秒，成像前銅網室溫干燥5分鐘。由圖5(a)可知，AE是在納米 尺度縮合DNA。圖5(b)為N : P比為10時，AE/DNA復合物的EF-TEM圖。
(6) 、細胞毒性實驗
以起始密度為1 x 10"細胞/孔(HeLa和293T)，或起始密度為2x 104細胞/孔 (HepG2)接種到96孔板中，在200pl的培養基內孵育18—20h，在處理時間內 細胞融合度達80%，培養基換成100pl含不同濃度的聚合物(1， 5， 10， 20 和30pg/ml)的新鮮無血清培養基。將細胞培養24h后加入20[ilMTS繼續培養 2h，用ELISA測定吸光度值，計算細胞的成活率 細胞存活率(％) = (ODsample/ODc。ntrol) xlOO
由圖6可知，PEI423在所測濃度下，對293T， HeLaandHepG2細胞系 幾乎沒有毒性，而PEI25KorAE隨著濃度的增加，其毒性也隨之增加。在 同一濃度下，與PEI25K的毒性相比，AE幾乎是無毒的，尤其是在高劑量 下。甚至在聚合物濃度為30pg/ml下培養24h后，AE的細胞從存活率仍大 于60%。相比之下，當細胞用PEI25K處理，細胞的存活率下降約40% 。AE毒性低的主要原因是其電荷密度低，縮氨酸主鏈能降解。 (7)、體外基因轉染效率評價
起始密度為lxl(^細胞/孔(HeLa和293T)，或起始密度為2><104細胞/孔 (HepG2)，接種在24孔板中，在lml的培養基內培養孵育18—20h，當細胞 融合度為70-80%時將培養基換成是500 ^無血清或是含10%血清的培養基， 并加入N:P比分別是(5， 10， 20， 30和40)的聚合物/pGL3-contro1 (l昭) 復合物，繼續培養6小時。最后將培養基換成完全培養基繼續培養24h。每 個轉染實驗重復做三遍，轉染活性用RLUs值表示。由圖7可知，AE在293T、 HeLaandHepG2細胞系中的基因轉染效率隨N : P比從呈單調遞增的趨勢， 當N : P比控制在40, AE的基因轉染效率最佳，甚至高于PEI25K和脂質 體在293T、 HeLa and HepG2 cells的基因轉染效率。除此之外，從圖7中還 能看出，AE的毒性相當低。
由圖8可知，在反相熒光顯微鏡下觀察到PEI423/DNA復合物是盲目的 基因表達。與PEI25K/pEGFP-N2復合物相比，在AE/pEGFP-N2復合物中 可以觀察到更多的GFP表達，這就說明作為有效的基因載體，AE有很好的 前景。
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權利要求
1、一種核殼結構基因載體系統的組裝方法，其特征在于該方法包括以下步驟a)、刷狀聚陽離子{α，β-聚(L-天冬酰亞胺-g-聚乙烯亞胺)}(AE)的合成(1)α，β-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI)的合成在1L圓底燒瓶中加入25克(0.19mol)L-天冬氨酸粉末和12.5克85％的磷酸，混合均勻，于旋轉蒸發儀上185℃減壓反應3小時至不再有水蒸汽產生為止，加入150mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液攪拌溶解固體物，然后在攪拌下將得到的溶液緩慢滴加到盛有1000mL水的燒杯中，得白色沉淀，靜置，傾去上清液，過濾，將固體用水洗至中性，于50℃真空干燥48小時，得粉狀固體-α，β-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI)；(2)、聚乙烯亞胺(PEI)開環α，β-聚(L-天冬酰亞胺)取低分子量Mn423的聚乙烯亞胺(PEI)和上步驟得到的α，β-聚(L-天冬酰亞胺)(PSI)、將其分別溶解于二甲基甲酰胺(DMF)溶液，再按摩爾比1∶3(PSI/PEI)混合，于室溫下攪拌22h，過濾后，溶液用3500A透析袋在室溫下透析6天，冷凍干燥得刷狀聚陽離子{α，β-聚(L-天冬酰亞胺-g-聚乙烯亞胺)}(AE)；b)、核殼結構基因載體系統的組裝將a步驟所得刷狀聚陽離子(AE)與DNA溶液按N∶P比為5、10、20、30、或40充分混合，室溫下靜置24小時，得復合納米顆粒即為核殼結構基因載體系統。
2、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于所述刷狀聚陽離子的分子量 不小于10KDa。
3、 一種核殼結構基因載體系統的用途，其特征在于用于HeLa、 293T或 H印G2細胞的基因轉染，尤其是在血清存在下的基因轉染。
全文摘要
本發明公開了一種核殼結構基因載體系統的組裝方法，該方法是將小分子量聚乙烯亞胺(PEI)完全開環聚L-天冬酰亞胺(PSI)，純化得α，β-聚L-天冬酰亞胺-g-聚乙烯亞胺(AE)，以AE為載體與DNA組裝成核殼結構的納米基因載體系統；本發明的特點是刷狀聚陽離子的合成方法簡單，成本低廉；由于所用原料無毒，所得刷狀聚陽離子基因載體的毒性很低；刷狀聚陽離子與DNA通過電荷相互作用能形成核殼結構的納米粒子；該納米粒子具有高的基因轉染效率；基于其親水的殼層，可減少對蛋白的吸附，從而使該核殼結構的納米基因載體系統在血漿存在下具有良好的基因轉染效率，可望用于體內基因治療。
文檔編號C12N15/63GK101492691SQ20081020769
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月25日 優先權日2008年12月25日
發明者余家會, 劉順英, 王成運, 羅淑芳, 范耐茜 申請人:華東師范大學