一種酯酶新基因及其重組表達體系的制作方法

專利名稱：：一種酯酶新基因及其重組表達體系的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體地涉及不可培養微生物的基因克隆及表達。
背景技術：
：數量巨大的不可培養的微生物中蘊藏著豐富的資源優勢，宏基因組的研究為挖掘這一資源優勢提供了可靠的技術保障。95%的海洋微生物在現有的實驗條件下無法或很難實現人工培養，直接從環境中提取DNA,建立理論上可以覆蓋環境中所有微生物的遺傳信息宏基因組文庫。在海洋深度100米以上的極端環境中獲得的基因片段，將這些基因異源表達，有可能得到具有應用價值的新基因。通過構建海洋底泥宏基因組文庫，保存海洋微生物的基因多樣性，以利于不同類型新型基因的研究與開發利用。脂肪酶和酯酶是重要的工業酶制劑品種，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于油脂加工、食品、醫藥、日化等工業。不同來源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力。其中用于有機相合成的具有轉酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的規模化生產對于酶催化合成精細化學品和手性化合物有重要意義。當前能源危機備受人們的關注，傳統化石能源已不能滿足人類的需求，通過脂肪酶生物催化作用合成生物柴油的技術，具有提取簡單、反應條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無廢物產生、無污染等優點。本發明擬從海洋底泥宏基因組文庫中篩選抗逆性強，性質優良的新型酯酶和脂肪酶基因，為生物柴油的轉化和制備工藝提供備選資源。發明人在前期的工作中，成功構建了我國南海0100米深底泥宏基因組文庫，該庫容DNA達194MB，經酶切、連接和轉化，共獲得118,000個含有外源基因片段的重組子，其外源片段長度在1.0-8.0Kb之間。建立了酯酶和脂肪酶的篩選模型，為下一步篩選提供了技術保障。
發明內容本發明的目的是提供一種新的酯酶基因，用于脂類降解及其他油脂類化合物的生物轉化。本發明從南海底泥宏基因組文庫中，通過功能篩選獲得一種新的酯酶基因eW^7，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。eW大小為891bp，石威基組成226A(25.4%),232C(26.0%)，247G(27.7%),186T(20.9%)，0其他(0.0%);編碼蛋白大小為296aa,其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。將該基因序列在GenBank中進行同源搜索，發現一個與之相似性最高為59%的蛋白來源于一株未培養細菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank的注冊號為ABQ11268)。結構預測結果顯示，Est_pl具有完整的a/卩水解折疊保守結構域(COG0596)，該結構域包含了絲氨酸、谷氨酸和組氨酸組成的催化三聯體，構成酯酶/脂肪酶的催化中心，歸屬于酯酶/脂肪酶超級家族(cl09107)。綜上所述，EsU)l應為酯酶/脂肪酶超級家族(c109107)一名新成員。將M^p7克隆到表達載體pET28a并轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到pET28a-Est_pl/BL21重組表達體系。搖瓶培養并誘導表達Est_pl，經純化后獲得Est_pl，SDS-PAGE表明其表觀分子量為33.5kD，與預測值相符；通過酯酶活力測定表明Est_pl能夠特異地打斷化合物pNP-丁酸酯的酯鍵；通過對Estjl的最適反應pH測定表明，其最適反應pH值為pH8.57，偏堿性；通過對Estjl的最適反應溫度測定表明，其最適反應溫度約為40°C。酶的動力學常數測定表明，Est_pl的最適底物為pNP-丁酸酯，對于酰基碳鏈較短酯類的水解活力優于長鏈酯類。應當理解，在不影響Est一jDl蛋白活性的前提下，本領域技術人員可對SEQIDNO:2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響表達的條件下，可對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對SEQIDNo.l所示的核苷酸序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，且編碼上述蛋白的核苷酸序列。進而，本發明還提供一種含有上述基因的克隆載體或表達載體，含有所述載體的宿主細胞。進一步，本發明還提供一種制備Estjl的方法，其是通過培養含有上述表達載體的宿主細胞，從培養物中分離得到Est_pl。本發明還提供所述Estjl在催化解酯、酯交換或酯合成中的應用。優選的反應pH值為pH8.57，優選反應溫度為40。C。本發明從我國海洋底泥宏基因組文庫中釣出新型酯酶基因不僅為酯酶家族增添了新成員，發現該基因編碼的蛋白具有優良的酶學性質，可以應用于酶法合成酯產品，將有望成為補充和取代部分化學合成產品的新生產工藝的備選者。該酶的生產，將會在生物柴油制備(催化解脂，酯交換等反應)，廢紙漿脫墨再生等工藝中顯示其重要的經濟和社會價值。圖1顯示的是pNP的標準曲線；圖2顯示的是表達產物Est_pl各純化階段的SDS-PAGE圖，其中，M:低分子量蛋白Marker;CL:粗酶提取液；FL:NTA-Agarose柱流出液；EL:Est_pl蛋白于50mM咪唑溶液洗脫；圖3顯示的是pH對Estjl活性的影響；圖4顯示的是溫度對酯酶Estjl活性的影響；圖5顯示的是Est_pl在pNP-丁酸酯和pNP-癸酸酯底物條件下的雙倒數曲線圖，其中圖5A是測定底物為pNP-丁酸酯的Est_pl動力學常數測定，圖5B是測定底物為pNP-癸酸酯的Est_pl動力學常數測定。具體實施方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1j57基因的獲得1.文庫初篩將文庫中的菌株稀釋涂布在含有1%三丁酸甘油酯的LB平板上，37"培養，12天后挑出產生透明圈的菌落備用；2.文庫復篩將挑取得菌株重新點接在含有1%三丁酸甘油酯的LB平板上，37°C培養，12天后確定并挑選出產生透明圈的菌落。3.挑取產生透明圈的菌株進行液體培養，通過TIANGEN質粒提取試劑盒提取質粒，送公司測序；4.測序結果該質粒外源DNA插入片斷大小為3650bp。通過ORFFinder預測得到4段完整的ORF序列。其中，編碼酯酶或脂肪酶的基因eWj77位于插入片斷的7281618bp。eW大小為891bp,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示編碼蛋白大小為296aa。將該基因序列在GenBank中進行同源搜索，發現一個與之相似性最高為59%的蛋白來源于一株未培養細菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank的注冊號為ABQ11268)。結構預測結果顯示，Est_pl具有完整的a/p水解折疊保守結構域(COG0596),該結構域包含了絲氨酸、谷氨酸和組氨酸組成的催化三聯體，構成酯酶/脂肪酶的催化中心，歸屬于酯酶/脂肪酶超級家族(cl09107)。綜上所述，Est_pl應為酯酶/脂肪酶超級家族(clO需)一名新成員。5、根據測序結果，設計引物進行PCR，得到MUW完整基因。PCR引物5，-CATGCCATGGCAAACATTATTGCG5，-ACGCGTCGACGATAAAAATTTTTTGGGTPCR反應體系dNTPs(2mM)KOD酶(lU/pl)0.2|il10xPCR反應緩沖液2|ilMgS04(25mM)0.5(il上游引物l^il下游引物l^il質粒模板lfilddH2013.3|il總體積20(ilPCR反應條件94°C，預變性2min;94°C,變性15s;51°C,退火30s;68°C，延伸lmin;共30個循環；68°C,再延伸lOmin。以MarkerIV為DNA分子量標記，甲基溴酚蘭為染料，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。實施例2Est一pl表達體系的構建及其酶學活性考察1、Est_pl表達體系的構建設計在Est_pl的5，端和3，端分別引入A^I和IoI酶切位點，交付上海生工合成，測序正確后用于構建表達載體。用A^I和^/zo1對合成的as/基因進行雙酶切；2Vco1和5WI對pET28a(Novagen)載體進行雙酶切，然后用DNA連接酶將上述片斷連接，最后將連接產物轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在LB(含kan50yg/ml)平板上培養，初步篩選陽性克隆，經酶切驗證后得到pET28a-Estjpl/BL21重組表達體系。2、目的蛋白的誘導表達及純化；，本例釆用Ni-agarose親和層析純化(pET表達系統)目的蛋白，具體步驟如下1)誘導培養將表達菌株接種到裝有5mlLB(含kan50ng/ml)的試管中，37°C、轉速250rpm、培養至OD600-0.5。以1%(V/V)接種量將菌液轉接到500ml同樣的培養基中，當OD600為0.51.0之間時，加入IPTG至終濃度為0.5mM誘導1215小時。2)蛋白粗提將經誘導的培養物10000g、4°C、離心10分鐘收集細胞，用裂解緩沖液洗滌2次。溶于30ml裂解緩沖液中，超聲波破碎細胞(240伏特，3秒超聲波破壁，7秒間歇，60個循環)后，離心(15000g、4°C、IO分鐘)，取上清。3)蛋白純化i.往柱子內添加lmlNi-agarose，用10倍體積雙蒸水洗滌，并用適量裂解緩沖液平衡柱子。ii.將Ni-agarose取出，與蛋白粗提液以體積比1:4混合，轉速200rpm，水浴結合1小時。iii.將結合后的Ni-agarose與蛋白粗提液重新添加到柱子中，用50倍體積的裂解緩沖液平衡柱子。iv.用50倍體積的清洗緩沖液洗去未結合的蛋白，直到流出液中蛋白含量為零。v.用5倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫。用1,5ml離心管，每管收集10滴。vi.洗脫結束后進行柱體保存。依次用10倍柱體積的0.3M乙酸、10%甘油、雙蒸水洗滌，30%乙醇浸泡，4。C保存。vi.電泳分析目的蛋白，將合乎要求的蛋白透析，進行酶學性質測定。裂解緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪哇，用NaOH調pH至8.0。清洗緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaGt、20mM咪唑，用NaOH調pH至8.0。洗脫緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、50mM咪唑，用NaOH調pH至8.0。透析緩沖液50mMNaH2P04、300mMNaCl，用NaOH調pH至8.0。3、酯酶酶活測定酯酶可以特異地打斷化合物pNP-脂肪酸酯的酯鍵，釋放出相同物質的量的脂肪酸和pNP,而pNP在堿性環境下405nm處有特殊的吸收峰，通過測定一定時間內產物pNP的生成量來計算脂肪酶/酯酶的活力。反應體系為Buffer940|ilpNP-脂肪酸酯10^1無水乙醇40fil酶液lOpl將緩沖液、底物溶液(pNP-丁酸酯，4-Nitrophenylbutyrate購自Sigma)和無水乙醇在40'C水洛中保溫lOmin,加入適當稀釋的酶液(0.128mg/ml),反應3min,測定405nm的吸光值，對照標準曲線計算酶活。酶活單位(unit)定義為，在上述反應條件下，每分鐘釋放出l(imolpNP的酶量為一個酶活單位。。",ApNPA化5X稀釋倍數酶活力(iamol/min'm1^——x100='冊歸x100ttXpNP消光系數酶活力Omol/min'ml)-(14.312+3+16.731)x100=28.514比酶活0^101/11^11'11^)=28.514+0.128=222.7654、酶學性質分析1)SDS-PAGE方法測定分子量SDS-PAGE方法測定酶的亞基分子量，根據已知分子量的標準蛋白在SDS-PAGE中的相對遷移率Rf作圖，得其分子量。結果如圖2所示，Est_pl的SDS-PAGE表觀分子量約為33.5kDa。并且SDS-PAGE電泳表明，經過Ni-agarose親和層析純化后的Est_pl可達到電泳純。2)酶的最適反應pH值配制各種50mM的緩沖液，pH分別為3.12、4.55、5.11、5.53、6.15、6.45的獰檬酸緩沖液，pH分別為6.33、6.62、6.94、7.33、7.45、7.83、8.09的MOPS緩沖液，pH分別為6.9、7.16、7.55、8.05、8.57、8.93的Tri-HCl緩沖液，pH分別為8.94、9.42、9.95的CHES緩沖液，以及pH分別為9.73、9,9、10,41、10.88的CAPS緩沖液。將酶液分別加入到上述pH的緩沖液中，按標準方法測定酶活力，以酶活最高者定位100%，以相對活力和對應的pH值作圖。結果表明(圖3),Est_pl的最適pH值約為pH8.57,偏堿性。3)酶的最適反應溫度將底物溶液和pH8.57、50mmol/L的Tri-HCl緩沖液分別在0°C、5°C、9。C、15°C、18。C、24.5。C、30.5。C、35°C、37°C、40°C、42。C、45°C、50°C、55°C、60°C的不同溫度的水洛中保溫lOmin,然后加入酶液按照標準方法測定酶活力，得到酶液在不同反應溫度下具有的酶活力，以酶活最高者定為100%，以相對活力對溫度作圖。，結果表明(圖4)，酶的最適反應溫度約為40°C。4)酶的動力學常數測定釆用的底物為pNP-丁酸酯(4-Nitrophenylbutyrate)和pNP-癸酸酯(4-Nitrophenylstearate)購自Sigma公司，配制一系列不同濃度的底物，使反應體系中底物的濃度分別為O.lmM、0.05mM、0.025mM、0.0125mM、0扁25mM、0扁13mM。將配好的底物、無水乙醇和pH8.57的Tri-HCl緩沖液在4(TC下預熱10min，分別加入10pl適當稀釋的酶液(稀釋后0.0128mg/ml),根據底物濃度和測得的反應初速度v(計算公式同酶活力測定)，以1/[S]對1/v作Lineweaver-Burk雙倒數圖，求得《m，《cat，i^at/《m。結果表明(見圖4及表2)，Est_pl的較佳的底物是pNP-丁酸酯，對于酰基碳鏈較長酯類的水解活力不如短鏈酯類，因此，EstjDl是一個酯酶。計算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>][E]為酶蛋白濃度表2不同底物的Estjl的酶動力學常數<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095gccgacgatgcggtcgggctgctggatgetttagaaateg3aaaggcc336AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110catgtctgcggtatgteaatgggagggatgategcccagaccateggg384HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125ctgaatcatcagcagegggtgttaageetcatttegatatacagecat432LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140acgggcaaccctgaacttccgccgccgacacccgaagcattggaatac480ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160ctggtcacgccgccacctatggaacgtgaagccaacateacctatacc528LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175etcgatgtgtggcgcacgtttteagggaagggctttccgctggatgag576LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190gattggaacagaaaaategccgccaaagcctatgaccgcgccttttac624AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ccggaaggcgtggcccgtcagatggcggccgtcttaacccaaaaaaat672ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220cgaaaattcgaactgggtteggtcaccatgcccacactggtgattcac720ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240ggagccgatgacccgctggtgccggttgaaggcggcaaagatacggetGlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysAspThrAla245250255768gaagcaataccgggggetgagctgataateattgacggaatgggacacGluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieAspGlyMetGlyHis260265270816gatctgccgcatggtggagcctggccgcagatagtcgatgcgategtaAspLeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285864aatcacAsnHis290ThrGin3333tttttLysliePhe295atelietg3891〈210>2〈211〉296<212〉PRT<213〉未知<400>2MetAlaAsnlielieAlaAsnGlylieGinlieGluTyrAspThrPhe151015GlyAsnProAspGluProProLeuLeuLeulieMetGlyLeuAlaCys202530GinLeulieHisTrpAspGluAspLeuCysGluGinLeuAlaArgArg354045GlyHisTyrVallieArgPheAspAsnArgAspThrGlyLeuSerThr505560LysPheAlaGluAlaGlylieProAsplieGlyGinlielieGluAla65707580ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240GlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysA印ThrAla245250255GluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieAspGlyMetGlyHis260265270A印LeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285AsnHisThrGinLysliePhelie290295<210〉3<211>304<212>PRT〈213>未知〈400〉3MetAlaAsnlielieAlaAsnGlylieGinlieGluTyrAspThrPhe151015GlyAsnProAspGluProProLeuLeuLeulieMetGlyLeuAlaCys202530GinLeulieHisTrpAspGluAspLeuCysGluGinLeuAlaArgArg354045GlyHisTyrVallieArgPheAspAsnArgAspThrGlyLeuSerThr505560LysPheAlaGluAlaGlylieProAsplieGlyGinlielieGluAla65707580ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240GlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysAspThrAla245250255GluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieA印GlyMetGlyHis260265270AspLeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285AsnHisThrGinLysliePhelieValGluHisHisHisHisHisHis290295300<210〉4<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>4CATGCCATGGCAAACATTATTGCG24<210〉5<211>28<212〉DNA<213>人工序列<400〉5ACGCGTCGACGATAAAAATTTTTTGGGT28權利要求1、一種酯酶，其氨基酸序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或該序列經缺失、添加和/或替換一個或幾個氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。2、編碼權利要求1所述酯酶的基因。3、如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列為SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，或該序列經缺失、添加和/或替換一個或幾個核苷酸，且編碼相同蛋白質的核苷酸序列。4、含有權利要求2或3所述基因的表達載體。5、如權利要求4所述的表達載體，其源自pET28a。6、含有權利要求4或5所述表達載體的宿主細胞。7、如權利要求6所述的宿主，其為大腸桿菌。8、權利要求1所述酯酶在催化解酯、酯交換或酯合成中的應用。9、一種制備權利要求l所述酯酶的方法，其是通過培養權利要求6或7所述的宿主細胞，從培養物中分離得到所述酯酶。10、如權利要求9所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)活化取權利要求7所述宿主的單菌落于5ml含kan50昭/ml的LB培養基中，于37°C、250rpm培養至OD600-0.5;2)培養以1%接種量將菌液轉接到500ml含kan50昭/ml的LB培養基中，于37°C、250rpm培養至OD600為0.51.0之間；3)誘導向菌液中添加IPTG至終濃度為0.5mM,于30。C、250rpm誘導培養1215小時。4)收集細胞4°C、10000g離心10分鐘收集細胞；棄上清，沉淀以lxPBS緩沖液洗滌2遍，細胞重懸浮于3040mlPBS緩沖液中；5)獲取粗酶提取液冰洛條件下，超聲波破碎細胞；細胞破壁后，以4。C、15000g離心10分鐘，收集上清即粗酶提取液。全文摘要本發明提供了一種酯酶新基因Est_p1及其重組表達體系。該基因克隆自中國南海海底100米深海洋底泥的宏基因組文庫。基因全長891bp，編碼296氨基酸。構建成功大腸桿菌pET28a-Est_p1/BL21重組表達體系。目的蛋白分子量為33.5kD。以pNP-丁酸酯為催化底物，證明Est_p1是一個偏堿性的中溫酯酶，對于短鏈酯類有極高的催化活力，適于脂化、轉酯化等工業領域。文檔編號C12N15/55GK101402947SQ20081022694公開日2009年4月8日申請日期2008年11月20日優先權日2008年11月20日發明者關國華,晴彭,穎李,李季倫,王珍芳申請人:中國農業大學