專利名稱：：云南水稻老品種秈粳鑒定的分子技術方法
技術領域：
：本發明涉及一種云南水稻老品種秈粳鑒定的分子技術方法，屬于農業生物
技術領域：
，更具體地說屬于育種領域。
背景技術：
：我國是世界公認的亞洲栽培稻起源中心之一，是世界上稻種資源最豐富的國家之一，也是世界上種稻最早的國家之一。而云南由于緯度低，海拔高差大(海拔最低點為76米，最高點為6800米)，具有明顯的立體氣候特點，其地理氣候多樣性孕育了豐富多樣性的稻種資源，是中國稻作生態和遺傳資源多樣性最豐富的中心，構成了亞洲栽培稻最重要的基因庫之一。目前，已從云南收集到6000余份的稻種資源，云南稻種幾乎擁有我國栽培稻種的各種類型及特點，這些材料為水稻育種、研究亞洲栽培稻的秈粳分化歷史提供了寶貴的資源。云南水稻秈粳有垂直分布的特點，從海拔76m的河口縣到2695m的寧蒗縣永寧鎮均有稻作分布，其中海拔1600m以上主要為粳稻栽培區，76—1400m為秈稻栽培區，1400-1600m為秈粳交錯區，以寧蒗縣永寧2695m為最高，是我國目前水稻種植最高海拔。發掘利用云南稻種資源時，須對稻種資源特性有充分的了解，尤其是材料的秈粳分化特性。秈粳分化是亞洲栽培稻演化過程中重要的進化事件。雖然亞洲栽培稻起源于亞洲的熱帶、亞熱帶的野生稻，但在漫長的自然進化與受人工選擇過程中已演變分化為種質資源類型豐富、廣泛種植的作物，適于在熱帶、亞熱帶、溫帶等許多溫度條件不同的地區種植。隨著緯度由南向北增加或海拔由低向高的增加，水稻分化形成了適應于不同溫度環境的氣候生態型，即秈稻(//^/^)和粳稻(1^/7朋/^)兩個亞種。典型的秈稻和粳稻在地理分布上有明顯不同，秈稻主要分布在熱帶、亞熱帶的低海拔及低緯度的濕熱地區種植，在我國主要分布于華南熱帶和淮河以南的亞熱帶地區。粳稻適應于高緯度或低緯度中高海拔溫涼的地區。在亞洲，粳稻主要分布于夏季氣候溫和、緯度較高的北方(如我國的東北和朝鮮、日本)，以及低緯度的一些海拔較高的地區，如中國的西南地區。在我國主要分布于華東太湖流域和華北、西北、東北等溫度較低的地區以及南部熱帶、亞熱帶的高地，如我國的云貴高原區。.典型的秈稻、粳稻在農藝性狀及生理生化特性上差異較大。粳稻一般表現為耐寒性較強，較抗白葉枯病、抗倒、葉片硬而堅實、不易早衰、以及谷粒短圓、出米粒高、胚乳直鏈淀粉含量較低、脹性小等。秈稻通常適宜在炎熱氣候條件下栽培，一般表現為耐熱性較強，較抗稻瘟病，易倒，生長繁茂以及谷粒長，胚乳直鏈淀粉含量較高、脹性大等。前人依據典型秈粳稻的差異，已形成一些鑒別秈粳稻的指標體系，列舉的性狀多達十幾項。在云南，程侃聲等根據抽穗時殼色、葉毛、子粒長寬比、酚反應、1-2穗節長和稃毛等6項形態學指標的綜合評分，提出了以形態為指標的"形態指數法"，可以區分絕大多數秈、粳品種(^1)。他的這種分類法簡易快速，經得起雜交親和力和同工酶分析的檢驗，已開始為國內一些學者所采用，是目前研究水稻秈粳分化較為常用的體系之一。但這種方法須將材料種植于田中，并做大量的田間觀察記載，耗時費力，尤其是面對大量的稻種資源時。而且，用現在的方法對一些秈粳分化不明顯、既表現秈稻特征又有粳稻特征的老品種很難區分。總而言之，目前，還沒有一種技術能準確、快速、經濟的鑒別水稻云南老品種秈粳的方法。表l秈粳分化指標<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>各性狀的分數相加，0-8分為秈，9-13為偏秈，14-17為偏粳，18-24為粳。
發明內容本發明克服現有鑒定方法的不足，提供一種準確、快速、高效的秈粳鑒定方法。本發明的技術方案是取待鑒定材料種子5粒于20-35'C發芽，發芽5天取葉片，提取水稻總DNA;測定樣品DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul;然后用依照水稻第10染色體特定長臂區段的序列設計特異性引物JI，進行PCR反應；2%的瓊脂糖(含EtBrO.lug/ml)凝膠電泳分離；在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果，依據電泳結果鑒定材料秈粳特性。云南水稻老品種秈稻材料的PCR有兩個產物分子量分別是280bp，380bp;云南水稻老品種粳稻材料PCR有一個產物的分子量為280bp，由此鑒定云南水稻老品種材料秈粳分化特性。PCR擴增反應的反應液組成及擴增程序如下JI弓l物序歹!jF:AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTGR:ATATCAGGACTAACACCACTGCTC反應液組成反應總體積為12.5ul，含ddH208.95ul，模板DNAlul，引物各1.6pmol，lXbuffer，60uMdNTP，0.5UTaq酶，1.8MmMgCL2擴增程序94'C4min;94。C50s、58°C50s、72。Clmin，38個循環;72°C4min。本發明的有益效果是由于利用了分子遺傳學、分子生物學技術及水稻基因組測序結果，并結合多年來我們對云南水稻老品種特征特性及分子研究的結果，為快速準確鑒別云南水稻老品種秈粳特性提供了有力的工具。具體表現為(1)用JI作引物鑒別云南水稻老品種秈粳特性準確性高，準確率為99%以上，而且用時不超過10天，鑒別材料只需發芽，提取DNA，PCR反應及電泳即可；(2)由于鑒別方法簡單易行，鑒別不受季節及材料數量的限制，避免了田間農藝性狀鑒定的繁瑣程序，鑒別方法簡單經濟，鑒定一個材料需人民幣約1.5元。具體實施案例具體實施方式為用不同海拔(高海拔2000m以上；中1400—2000m;低低于1400m)云南水稻老品種，分別用"形態指數法"及分子鑒定法鑒定材料秈粳特性，比較兩種方法鑒別結果，考察分子鑒別法的可靠性。實施例一來源于云南高海拔的稻種資源30份，分別用"形態指數法"及分子鑒定法鑒定材料秈粳特性，比較兩種方法鑒別結果，考察分子鑒別法的可靠性。分子鑒定時，取待鑒定材料種子5粒于20'C發芽，發芽5天取葉片提取水稻總DNA，測定樣品DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul，然后用特異性引物JI進行PCR反應；2%的瓊脂糖(含EtBrO.lug/ml)凝膠電泳分離；在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果，依據電泳結果鑒定材料秈粳特性。云南水稻老品種秈稻材料的PCR有兩個分子量分別是280bp、380bp的產物，云南水稻老品種粳稻材料PCR有一個分子量為280bp的產物，由此鑒定云南水稻老品種材料秈粳分化特性。PCR擴增反應的反應液組成及擴增程序如下JI引物序列F:AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTGR:ATATCAGGACTAACACCACTGCTC反應液組成反應總體積為12.5ul，含ddH208.95ul，模板DNAlul，引物各1.6pmol，IXbuffer,60uMdNTP，0.5UTaq酶，1.8MmMgCL2擴增程序94XMmin;94°C50s、58°C50s、72。Clmin，38個循環；72。C4min。結果見表2，由表2可看出，來源于云南高海拔的稻種資源30份，均為粳稻材料，"形態指數法"鑒定為粳稻或偏粳稻材料，分子鑒定法為粳稻材料，表明分子鑒定與形態鑒定完全一致，分子鑒定準確率為100%。表2供試云南高海拔水稻老品種材料農藝性狀及分子鑒定表現<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例二來源于云南中海拔的稻種資源34份，分別用"形態指數法"及分子鑒定法鑒定材料秈粳特性，比較兩種方法鑒別結果，考察分子鑒別法的可靠性。分子鑒定時，取待鑒定材料種子5粒于35。C發芽，發芽5天取葉片提取水稻總DNA，測定樣品DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul，然后用特異性引物JI進行PCR反應；2%的瓊脂糖(含EtBrO.lug/ml)凝膠電泳分離；在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果，依據電泳結果鑒定材料秈粳特性。云南水稻老品種秈稻材料的PCR有兩個分子量分別是280bp、380bp的產物，云南水稻老品種粳稻材料PCR有一個分子量為280bp的產物，由此鑒定云南水稻老品種材料秈粳分化特性。PCR擴增反應的反應液組成及擴增程序如下JI弓I物序歹UF:AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTGR:ATATCAGGACTAACACCACTGCTC反應液組成反應總體積為12.5ul,含ddH208.95ul,模板DNAlul，引物各1.6pmo1，1Xbuffer，60uMdNTP，0.5UTaq酶，1.8MmMgCL2擴增程序94。C4min;94°C50s、58°C50s、72。Clmin，38個循環；72。C4min。結果見表3，由表3可看出，來源于云南高海拔的稻種資源34份，"形態指數法"鑒定將其分為4類，即秈稻、偏秈、偏粳及粳稻，其中秈稻和偏秈材料分子鑒定為秈稻，偏粳及粳稻分子鑒定為粳稻，表明分子鑒定與形態鑒定完全一致，分子鑒定準確率為100%。表3供試云南中海拔水稻老品種材料農藝性狀及分子鑒定表現<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例三來源于云南低海拔的稻種資源120份，分別用"形態指數法"及分子鑒定法鑒定材料秈粳特性，比較兩種方法鑒別結果，考察分子鑒別法的可靠性。分子鑒定時，取待鑒定材料種子5粒于30'C發芽，發芽5天取葉片提取水稻總DNA，測定樣品DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul，然后用特異性引物JI進行PCR反應；2%的瓊脂糖(含EtBrO.lug/ml)凝膠電泳分離；在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果，依據電泳結果鑒定材料秈粳特性。云南水稻老品種秈稻材料的PCR有兩個分子量分別是280bp、380bp的產物，云南水稻老品種粳稻材料PCR有一個分子量為280bp的產物，由此鑒定云南水稻老品種材料秈粳分化特性。PCR擴增反應的反應液組成及擴增程序如下JI弓l物序歹!jF:AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTGR:ATATCAGGACTAACACCACTGCTC反應液組成反應總體積為12.5ul,含ddH208.95ul，模板DNAlul，引物各1.6pmo1，1Xbuffer，60uMdNTP,0.5UTaq酶，1.8MmMgCL2擴增程序94'C4min;94°C50s、58°C50s、72。Clmin，38個循環；72°C4min。結果見表4，由表4可看出，來源于云南低海拔的稻種資源120份，其中秈稻98份，粳稻10份，光殼16份，光秈4份，光粳12份，除黃皮糯號外，其余分子鑒定與田間形態鑒定結果一致，分子鑒定與田間形態鑒定的一致性為99.2%。。表4供試云南低海拔水稻老品種材料農藝性狀及分子鑒定表現<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5是分子鑒定方法與常規方法比較。表5不同鑒定方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表1表5可看出，用JI引物鑒別云南水稻老品種秈粳特性時，準確率為99%以上，且分子技術鑒定較田間形態鑒定的成本低，可明顯縮短育種進程(表4)。權利要求1一種云南水稻老品種秈粳鑒定的分子技術方法，其步驟是1)將待鑒定材料種子5粒于20-35℃發芽；2)發芽5天取葉片，提取水稻總DNA；3)測定樣品DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul；4)用依照水稻第10染色體特定長臂區段的序列設計的特異性引物JI進行PCR反應；特異性引物序列為AAGAAGGGAGGGTTATAGAATCTG，ATATCAGGACTAACACCACTGCTC；5)用含EtBr0.1ug/ml的2％瓊脂糖凝膠電泳分離；6)在紫外透射儀上檢測PCR擴增產物及電泳結果；7)用JI作引物，云南水稻老品種秈稻材料的PCR有兩個產物，分子量分別是280bp、380bp；云南水稻老品種粳稻材料PCR有一個產物，分子量為280bp，由此鑒定云南水稻老品種材料秈粳類型。2.根據權利要求1所述的一種云南水稻老品種秈粳鑒定的分子技術方法，其特征是所述PCR擴增反應的反應液組成及擴增程序為反應液組成反應總體積為12.5ul，含ddH208.95ul，模板DNAlul，引物各L6pmo1，1Xbuffer，60uMdNTP，0.5UTaq酶，1.8MmMgCL2;擴增程序94。C4min;94°C50s、58°C50s、72。Clmin，38個循環;72。C4min。全文摘要本發明涉及一種云南水稻老品種秈粳鑒定分子技術的方法，屬于農業生物
技術領域：
育種領域。本發明的技術方案是取待鑒定材料種子5粒于20-35℃發芽，發芽5天取葉片提取水稻總DNA；測定DNA濃度并將DNA定量稀釋為25ng/ul；用依照水稻第10染色體特定長臂區段序列設計的特異引物JI，進行PCR反應；2％的瓊脂糖(含EtBr0.1ug/ml)凝膠電泳；在紫外透射儀上檢測PCR產物，依據電泳結果鑒定材料秈粳特性。秈稻有兩個分子量分別是280bp、380bp的PCR產物；粳稻的有一個分子量為280bp的PCR產物，由此鑒定云南水稻老品種秈粳特性。本發明的效果用途能快速、有效鑒別云南水稻老品種秈粳類型。文檔編號C12Q1/68GK101407845SQ20081023363公開日2009年4月15日申請日期2008年11月24日優先權日2008年11月24日發明者張忠林,洪汝科,譚亞玲,譚學林,艾郭,金壽林,陳麗娟,黃大軍申請人:云南農業大學