用于檢測jak2基因的突變的探針及其用途的制作方法

專利名稱：用于檢測jak2基因的突變的探針及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于#r測與慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative disorder; CMPD ) 一目關的JAK2基因的突變的
探針及其用途。
背景技術：
作為在基因水平上分析所有疾病的原因、以及個體間疾病 易患性(患病的難易程度)、個體間藥效差異等的方法，點突變， 即單核苷酸多態性(SNP)的檢測被廣泛應用。
作為SNP的通常檢測方法，可舉出(l)擴增發生檢測目 標的突變的區域，對所得擴增產物的堿基序列進行分析的直接 溯寸序(Direct Sequencing )法，(2 )焦石粦酉臾觀寸序(Pyrosequencing ) 法，(3)擴增上述區域，在溫度梯度柱中進行HPLC,根據洗脫 時間檢測有無突變的變性高效液相色譜(Denaturing HPLC )法，
(4)利用熒光探針與含有檢測目標的突變的區域結合則發出熒 光的現象，通過測定熒光強度來檢測突變的侵入4全測(Invader) 法，(5)使用將3，末端區域的任一個堿基設計成與檢測目標的 突變互補的堿基的引物來進行PCR,根據是否發生擴增來判斷 突變的ASP ( Allele Specific Primer ) — PCR ( Polymerase Chain Reaction)法(等位基因特異性引物PCR法)等。
但是，上述(1 )、 (2)和(4)方法的靈敏度較低，分別為 約20%、約5%、約5%左右，操作需要很多功夫和時間。上述
(3 )的方法的靈敏度低達約10% ,另外，僅能確認有無突變， 而無法分析在何位點產生了何種突變，具有缺乏特異性的問題。 另外，上述(5 )的方法雖然靈敏度高，但特異性低，具有易于產生假陽性的問題。予以說明，靈敏度的數值(％)越小則靈 敏度越高。
由該問題出發，作為SNP的檢測方法，近年正在使用如下 所示的Tm ( Melting temperature, 解4連溫度)分才斤。該方法首
先使用與含有4全測目標的SNP的區域互補的揮:針，以形成待測 體的核酸與上述探針的雜交體(雙鏈核酸)。然后，對該雜交體
進行加熱處理，通過測定吸光度等信號來^r測隨著溫度上升的 雜交體向單鏈的解離(融解)。根據該檢測結果確定Tm值，從 而判斷SNP的方法。雜交體的同源性越高則Tm值越高，同源性 越低則Tm值越低。因此，例如，首先，預先求出含有突變型的 SNP的核酸和與其互補的探針的雜交體的Tm值(評價基準值)。 接著，測定待測體的核酸與上述探針的Tm值(測定值)。然后， 若該測定值與上述評價基準值相同，則可判斷為完全匹配，即， 待測體核酸的SNP為突變型。另一方面，若上述測定值低于上 述評價基準值，則可判斷為錯配，即，待測體核酸的SNP為正 常型。但是，這種使用Tm分析的檢測方法，普遍存在靈敏度較 低的問題。
據報道，真性紅細胞增多癥(Polycythemia vera; PV )、原 發性血小斧反增多癥(essential thrombocythemia; ET )等慢性骨 髓增殖性疾病(CMPD)中，可高頻率地發現JAK2基因的突變 型SNP (非專利文獻1 - 4 )。上述突變型SNP為JAK蛋白質的第 617位纈氨酸(V )被替換成苯丙氨酸(F)的突變，JAK2基因 的外顯子12的第73位(成熟mRNA(CDS)的第1849位)的鳥 嘌呤被胸腺嘧啶替代(JAK2 / V617F )。研究認為，表達這種 蛋白質的JAK2基因的突變(JAK2/V617F)的檢測，對CMPD 的診斷及治療有用。但是，即便是同一位患者的血液樣品，其血液細胞和含有正常型SNP的正常JAK2基因的血液細胞。這些 基因的不同，僅僅是SNP的類型，即，僅一個堿基的不同。這 樣，用于一企測突變型SNP的探針，會與含有突變型SNP的突變 序列(檢測對象序列)因完全匹配而雜交；雖與含有非突變型 SNP的正常型SNP的正常序列(非檢測對象序列)有一個堿基 錯配，但也發生雜交現象。這種情況下，存在如下問題在Tm 分析中，做成表示信號強度與溫度間關系的融解曲線時，屬于 完全匹配的突變序列的高溫側峰會因屬于錯配的正常序列的低 溫側峰的存在而難以;險測。即，即便存在突變序列時，其一企測 也會由于正常序列的存在而變得困難，導致檢測靈敏度下降。
非專利文獻l: Tefferi A. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006; 240 - 245.
非專利文獻2: Baxter EJ, Scott LM， Campbell PJ， et al. Lancet. 2005; 365: 1054 - 1061.
非專利文獻3: Kralovics R, Passamonti F, Buser AS ， et al. N Engl J Med. 2005; 352: 1779 - 1790.
非專利文獻4: Levine RL， Wadleigh M, Cools J, et al. Cancer Cell. 2005; 7: 387 - 397.

發明內容
因此，本發明的目的在于提供一種用于檢測JAK2基因突變 的探針及其用途，所述探針即使在包含僅一個堿基不同的突變 的突變序列和不含突變的正常序列共存的情況下，也能夠以良 好的靈敏度檢測到作為檢測目標的所述突變。
為了達到所述目的，本發明的探針的特征在于，其為用于 檢測JAK2基因的突變的探針，由下述(X)和(Y)中的至少 一種寡核苷酸組成，
8(X ):與以序列號1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子 12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5，方向直至 第17 ~ 22位堿基的區域序列相同的至少 一 個寡核苷酸，該寡核 苷酸以上述胞嘧啶堿基(c)作為3，末端，
(Y):由所述(X)的互補序列組成的寡核苷酸。 本發明的突變的檢測方法，其特征在于，其為JAK2基因中 的突變的檢測方法，含有下述工序(A) ~ (C),
(A) 準備反應體系的工序，所述反應體系含有要檢測有 無所述突變的待測核酸以及本發明的探針，
(B) 改變上述反應體系的溫度，測定所述待測核酸與所 述探針形成的雜交體顯示融解狀態的信號值的工序，
(C) 通過隨溫度變化的所述信號值的變動，確定所述待 測核酸中有無所述突變的工序。
本發明的引物對，其特征在于，其為用于通過核酸擴增法 擴增JAK2基因的引物對，其包括一對引物，該一對引物包含由 下述(F)的寡核苷酸所組成的正向引物和由下述(R)的寡核 苷酸所組成的反向引物，
(F):與以序列號2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區域序 列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，
(R):與以序列號2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝3，方向直至第23 47位堿基的區域互 補的至少 一 個寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第255位的胞嘧咬 堿基(C)互補的鳥。票呤堿基(g)作為3，末端。
本發明的突變檢測試劑盒，其特征在于，其為為了在本發 明的JAK2基因的突變的檢測方法中使用的試劑盒，其包含本發
9明的探針。
根據本發明的探針，即使在發生檢測目標的突變JAK2 /
V617F的突變序列(突變基因)與未發生所述突變的正常序列 (正常基因)共存的情況下，也能夠檢測所述突變序列的有無， 即能夠4企測有無作為一企測目標的突變。如上所述，在前述Tm分 析中，探針通常會與僅一個堿基不同的突變序列和正常序列兩 者進行雜交。因此，在所述融解曲線中，兩者的信號重疊，導 致有無突變序列的檢測變得非常困難。對于此問題，根據本發 明的探針，雖然會與突變序列和正常序列兩者雜交，但融解曲 線中兩者的信號能夠充分分離。因此，利用本發明，能夠以良 好的靈敏度檢測JAK2基因的突變(JAK2/ V617F)。


圖1為示意本發明的實施例1中的T m分析結果的圖表。
具體實施例方式
在本發明中，下面將發生檢測目標的突變的JAK2基因稱為 "突變基因或檢測對象基因"，將發生檢測目標的突變的序列且 探針能夠雜交的區域或含有該區域的序列稱為"突變序列或檢 測對象序列"。另外，將未發生檢測目標的突變的JAK2基因稱 為"正常基因或非檢測對象基因"，將未發生檢測目標的突變的 序列且探針能夠雜交的區域或含有該區域的序列稱為"正常序 列或非檢測對象序列"。另外，將供突變檢測用的核酸稱為"待 測核酸或耙核酸"。
其第73位的堿基(k)為檢測目標的堿基。所述第73位的堿基(k) 已知為SNP,例如正常型為g,突變型為t。序列號2的石威基序列
10為JAK2基因的全長序列(包括外顯子和內含子)中的部分序列， 是包含外顯子12及其周圍區域的序列。例如，JAK2基因的全長 序歹'j ( 142751bp)的NCBI登錄號為No. NC一000009。另夕卜，例 如，JAK2基因的mRNA ( 5097bp )的NCBI登錄號為No. NM—004972,在it登錄的石威基序歹ll中，第2343J立石威基為才企測3十 象位點。另夕卜，以NCBI登錄號No. NM—004972登錄的堿基序列 中，第495位~第3893位的區域為CDS序列，CDS中的第1849 位石威基為;f企測目標位點。 <探針〉
如前所述，本發明的探針的特征在于，其為用于檢測JAK2 基因的突變的探針，其為由下述(X)和(Y)中的至少一種寡 核苷酸組成的探針。另外，本發明的探針亦可為含有上述寡核 苦酸的探針。在本發明中，上述寡核苷酸(X)只要3，末端滿 足下述條件即可。
(X):與以序列號1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子 12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5，方向直至 第17 ~ 22位堿基的區域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核 苷酸以上述胞嘧啶石威基(c)作為3，末端
(Y):由所述(X)的互補序列組成的寡核苷酸
本發明的探針，其為用于檢測序列號1中所示的JAK2基因 外顯子12的第73位(k)、即JAK2基因的cDNA(對應成熟mRNA) 的第1849位堿基(k)的突變(g—t)的探針。本發明的探針中， 由上述寡核苷酸(X)組成的探針，與JAK2基因的反義鏈 (opposite strand )互補，能夠確認反義鏈中的突變。另夕卜，本 發明的探針中，由上述寡核苷酸(Y)組成的探針，與JAK2基 因的有義鏈(正鏈)互補，能夠確認有義鏈中的突變。
本發明的探針，可設計為例如與JAK2基因的第73位突變后常(g)的 正常序列完全匹配。
在本發明的探針中，作為所述寡核苷酸(X)，例如，可舉 出序列號3 ~ 8中所示的寡核苷酸。在下述序列中，k可以是g和t 中的任意一個，設計為與突變序列完全匹配時，優選"t";設計 為與正常序列完全匹配時，優選"g"。這些序列中，優選由序列 號5所示的寡核苷酸組成的探針，更優選由序列號5中堿基k為胸 腺嘧啶的寡核苷酸組成的探針。
5， - tatgtktctgtggagac - 3，(序歹'J號3 )
5 ， - gtatgtktctgtggagac - 3 ，(序歹'J號4 )
5， - agtatgtktctgtggagac - 3，(序歹ll號5 )
5， 一 gagtatgtktctgtggagac — 3，(序歹寸號6 )
5, - ggagtatgt^tctgtggagac - 3,(序歹'J號7 )
5， _ tggagtatgt^tctgtggagac — 3，(序歹寸號8 )
這些寡核苷酸為分別與序列號l的堿基序列中從第62、 63、 64、 65、 66或67位到第84位的區域(第73位是g或t)的互補序 列結合的序列。
本發明的纟笨針優選用標記物標記的纟罙針。所述標記物并無 限定，可舉出熒光染料(熒光團)。作為所述標記探針的具體例 子，例如優選用所述熒光染料標記、單獨時顯示熒光且通過雜 交而熒光強度減弱(例如猝滅)的探針。這種現象一般稱為熒 光猝滅現象(Quenching phenomenon )。作為利用這種熒光猝滅 現象的探針，優選其中一般稱為鳥嘌呤猝滅探針的探針。這種 探針已知有所謂的QProbe (注冊商標)。鳥。票呤猝滅探針是指， 例如將寡核苷酸的3 ，末端或5，末端的堿基設計為胞嘧啶，使用 一種當該末端的石威基胞嘧啶接近與其互補的i咸基鳥噤呤時發光 就會減弱的熒光染料標記前述末端的探針。在本發明的探針中，例如可使顯現焚光猝滅現象的熒光染料與前述寡核苷酸的3，末 端的胞嘧咬結合，亦可將上述寡核苷酸的5，末端^L計為胞嘧啶， 并使其與顯現熒光猝滅現象的熒光染料結合。
上述熒光染料并無限定，例如可舉出熒光素、磷光體、羅
丹明、聚甲炔染料衍生物等、市售的熒光染料可舉出例如 BODIPYFL (商標名，Molecular Probes7>司生產)、FluorePrime
(商品名，Amersham Pharmacia公司生產)、Fluoredite (商品 名，Millipore公司生產)、FAM ( ABI公司生產)、Cy3和Cy5
(Amersham Pharmacia公司生產)、TAMRA ( Molecular Probes 公司生產)等。探針的檢測條件并無特別限定，可根據使用的 焚光染^牛適當決定，例如太平洋藍(Pacific Blue )可在才企測波 長450 ~ 480nm下才企觀'j , TAMRA可在沖企須'J S皮長585 ~ 700nm下斗全 測，BODIPYFL可在檢測波長515 ~ 555nm下檢測。若使用此類 探針，能根據信號的變動容易地確定雜交與解離。
本發明的探針，例如可在3，末端上附加磷酸基團。如后文 所述，可以通過PCR等核酸擴增方法制備用來檢測有無突變的 待測核酸(耙核酸)，此時可使本發明的探針與核酸擴增反應的 反應體系共存。這種情況下，若探針的3，末端預先附加有磷酸 基團，則能夠充分防止探針自身通過核酸擴增反應而延伸。此 外，亦可以在3，末端附加上述標記物來獲得同樣的效果。
如前所述，本發明的^:針，可用于檢測JAK2基因的突變。 該突變的檢測方法無任何限定，只要是利用待測核酸與所述探 針雜交的方法即可。作為應用本發明探針的方法的 一 個例子， 以下對利用Tm分析進行的突變檢測方法進行說明。 <突變4企測方法>
如前所述，本發明的突變^r測方法的特4正在于，其為^f全測 JAK2基因中的突變的方法，包含下述工序(A) ~ (C)。
13(A)準備反應體系的工序，所述反應體系含有要檢測有 無所述突變的待測核酸與本發明的探針
(B )改變上述反應體系的溫度，測定所述《爭測核酸與所
述探針形成的雜交體顯示融解狀態的信號值的工序
(c)通過隨溫度變化的所述信號值的變動，確定所述待
測核酸中有無所述突變的工序
根據本發明的突變檢測方法，可檢測序列號1所示的JAK2 基因的外顯子12中第73位的堿基(k)的突變(g—1)。根據本 發明的突變一全測方法，例如能夠以比目前的直接測序法以及焦 磷酸測序法更優異的靈敏度進行檢測。
本發明中的待測核酸，例如可以是單鏈，也可以是雙鏈。 雙鏈的情況下，例如為使待測核酸和l笨針雜交以形成雜交體， 優選包括通過加熱將所述雙鏈解離為單鏈的工序。
所述待測核酸的種類并無特別限定，例如，可舉出DNA以 及總RNA、 mRNA等RNA等。另夕卜，所述待測核酸例如可列舉 生物樣品等樣品中包含的核酸。所述樣品中的核酸，例如可以 是生物樣品中本來所包含的核酸，但從能提高突變檢測精度的 角度出發，例如可列舉以上述生物樣品中的核酸作為模板， 利用核酸擴增法擴增得到的擴增產物等。作為具體例子，例如 可列舉以上述生物樣品中本來所包含的DNA為才莫板，通過核 酸擴增法擴增得到的擴增產物；以及由上述生物樣品中本來所 包含的RNA通過反轉錄反應(RT-PCR: Reverse Transcription PCR)生成cDNA，將該cDNA作為模板利用核酸擴增法擴增得
上述擴增產物的長度并無特別限定，例如可為50~ 1000堿基， 優選為80~ 200堿基。
所述生物樣品并無特別限定，例如，可列舉白細胞等血細胞樣品，全血樣品等。另外，本發明中，對取樣方法、DNA及 RNA等核酸的制備方法等并無限定，可采用以往公知的方法。
在待測核酸為上述那樣利用核酸擴增法由模板核酸擴增得 到的擴增產物時，上述(A)工序還可包含使用引物由模板核 酸擴增4寺測核酸的工序。
所述引物并無特別限定，只要能擴增JAK2基因中本發明的 探針能夠雜交的區域即可。所述擴增區域，例如既可僅限于所 述探針所雜交的區域，亦可為包含上述雜交區域的區域。作為 引物，例如可以為正向引物和反向引物中的^f壬意一種，優選以 兩者作為一對同時使用。作為引物，可使用后文所述的引物， 但并不限于此。
本發明中，本發明的探針的添加比例并無限定，由于能夠 充分確保檢測信號，本發明的探針相對于待測核酸的摩爾比優 選為l倍以下，更優選為0.1倍以下。此時，待測核酸既可以指 例如發生檢測目標突變的突變序列(檢測對象序列)與未發生 所述突變的正常序列(非檢測對象序列)的總和，亦可指含有 所述突變序列的擴增產物與含有所述正常序列的擴增產物的總 和。另外，雖然通常含有待測核酸的樣品中突變序列的比例不 詳，但從結果來看，所述探針的添加比例(摩爾比)優選相對 于突變序列或包含其的擴增產物為10倍以下，更優選為5倍以 下，進一步優選為3倍以下。另外，其下限并無特別限定，例如 為0.001倍以上，優選為0.01倍以上，更優選為0.1倍以上。
本發明的探針相對于所述待測核酸的添加比例，例如可以 為相對于雙鏈核酸的摩爾比，亦可以為相對于單鏈核酸的摩爾比。
對Tm值進行說明。例如，當持續對含有雙鏈DNA的溶液進 行加熱時，260nm處的吸光度將上升。這是因為，雙鏈DNA中兩條鏈之間的氫4建因加熱而打開，解離成單鏈DNA ( DNA的融 解)。而且，當全部雙鏈DNA解離為單鏈DNA時，其吸光度顯 示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈DNA時的吸光度)的約1.5 倍左右，由此可以判斷融解結束。根據該現象，融解溫度Tm— 般定義為吸光度達到吸光度總上升量的50%時的溫度。
在本發明中，用于確定Tm值的、伴隨溫度變化的信號變動 的測定，可基于上述原理，通過測定260nm處的吸光度而進行， 但優選測定附加在本發明的探針上的標記的信號。因此，本發 明的探針優選使用前述標記探針。所述標記探針，例如可列舉 單獨顯示信號且通過雜交而不顯示信號的標記探針，或者單獨 不顯示信號且通過雜交而顯示信號的標記探針。如為前者的探 針，則在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈)時不顯示信號， 而在探針因加熱而游離時顯示信號。另外，如為后者的探針， 則在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈)時顯示信號，并在探 針因加熱而游離時信號減少(消失)。因此，通過在信號特有的 條件(吸光度等)下4全測該標記所產生的信號，可如上述260nm 處的吸光度測定一樣，實施融解的進行及確定Tm值。標記探針 中的標記物，例如如前所述。
其次，將以使用用熒光染料標記的標記探針作為本發明的 探針為例，來說明本發明的突變檢測方法。另外，本發明的突 變檢測方法的特征在于，其使用本發明的探針，對于其他工序 及條件并無任何限定。
首先，從全血中分離基因組DNA。全血中基因組DNA的分 離可根據以往7>知的方法進行，例如可使用市售的基因組DNA 分離試劑盒(商品名稱GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE Healthcare Bio-Sciences公司生產)等。
其次，向包含分離出的基因組DNA的才羊品中添加標記牙笨針。所述標記探針例如優選為QProbe。該QProbe — 4殳為#笨針末 端的胞嘧口定堿基被熒光染料標記的探針，通過其與檢測對象序 列雜交，所述熒光染料與檢測對象序列的鳥嘌呤堿基相互作用， 其結果使熒光減少(或猝滅)。
所述纟果4j"的添加時才幾并無特別限定，例如既可以在下述擴 增反應之前，也可以在擴增反應的過程中以及擴增反應之后任 意時機添加到擴增反應的反應體系中即可。其中，為使擴增反 應與上述(B)工序能夠連續進行，優選在擴增反應之前添加。 這樣在核酸擴增反應之前添加所述纟果4十時，例如如前所述，優 選在其3，末端上附加熒光染料或附加磷酸基團。
所述探針可以添加到含有分離出的基因組DNA的液體樣 品中，亦可以在溶劑中與基因組DNA混合。所述溶劑并無特別 限定，例如，可列舉Tris - HC1等緩沖液、含有KC1、 MgCl2、 MgS04、甘油等的溶劑、PCR反應液等以往公知的溶劑。
接著，以分離出的基因組DNA為模板，利用PCR等核酸擴 增法，擴增包含檢測目標的堿基位點的序列。所述核酸擴增法 并無限定，例^(口， 可歹寸舉PCR ( Polymerase Chain Reaction, 聚 合酶鏈反應)法、NASBA ( Nucleic acid sequence based amplification , 基于核酸序歹'J的擴增)法、TMA (Transcription-mediated amplification, 轉錄介導的擴增)法、 SDA ( Strand Displacement Amplification,鏈置換擴增)法等， 但優選PCR法。另外，以下將以PCR法為例對本發明進行說明， 但并非局限于此。另外，PCR的條件并無特別限定，可根據以 往/>知的方法進4亍。
PCR引物的序列只要能擴增含有檢測目標的堿基位點的序 列即可，并無特別限定，如前所述可根據目的序列，基于以往 公知的方法進行適當的設計。引物的長度并無特別限定，可設計為一l殳長度(例如IO ~ 30mer )。
本發明的4全測方法中使用的引物對，例如可列舉后述的本 發明的引物對。另外，本發明的引物對的用途并不局限于本發 明的檢測方法，還有本發明的檢測方法中使用的引物對也并不 局限于本發明的引物對。
其次，進行所得PCR擴增產物的解離、及通過解離得到的 單鏈DNA與所述標記探針的雜交。該步驟例如可通過改變上述 反應液的溫度來進行。
所述解離工序中的加熱溫度，只要可以使所述擴增產物解 離即可，并無特別限定，例如為85 95。C。對加熱時間也并無 特別限定，通常為1秒 10分鐘，優選1秒 5分鐘。
另外，解離的單鏈DNA與所述標記探針的雜交，例如可在 上述解離工序之后，通過降低上述解離工序中的加熱溫度來進 行。溫度條件為例如40 50°C。
雜交工序的反應體系(反應體系)中的各組成的體積及濃 度并無特別限定。作為具體例子，所述反應體系中的DNA濃度， 例如為O.Ol ~ ljimol/L，優選為O.l ~ 0.5|imol/L，所述標記4罙4十 的濃度，優選例如可滿足對所述DNA的添加比例的范圍，例如
o.ooi ~ io,oi/l,優選為o.ooi ~ i拜o1/:l。
然后，改變上述反應液的溫度，測定上述擴增產物和上述 標記探針形成的雜交體顯示融解狀態的信號值。具體而言，例
如將上述反應液(上述單4連DNA與上述標記纟笨針形成的雜交 體)加熱，并測定隨著溫度上升的信號值的變動。如前所述， 當使用末端的C堿基被標記的探針(鳥噤呤猝滅探針)時，在 與單鏈DNA雜交的狀態下熒光減少(或猝滅)，在解離的狀態 下發出熒光。因此，例如只需緩慢加熱熒光已減少(或猝滅) 的雜交體，測定隨溫度上升而增加的熒光強度即可。測定熒光強度的變動時的溫度范圍并無特別限定，例如起
始溫度為室溫~ 85°C ，優選為25 ~ 70°C ，終止溫度為40 ~ 105°C。 另外，對溫度的上升速度并無特別限定，例如為O.l ~ 20。C/秒， 優選為0.3 ~ 5。C/秒。
其次，分4斤所述4言號的變動，以確定TnHi。具體而言，由 得到的熒光強度，來計算例如各溫度下每單位時間的熒光強度 變化量。變化量為(-d熒光強度增加量/dt)時，例如可將顯示 最低值的溫度確定為Tm值。另外，變化量為(d熒光強度增加 量/dt)時，例如可將最高點確定為Tm值。另夕卜，在使用的標記 探針不是猝滅探針，而是單獨不顯示信號且通過雜交而顯示信 號的探針的情況下，則恰好相反，只需測定熒光強度的減少量 即可。
所述Tm值，例如既可以通過以往公知的MELTCALC軟件 (http:〃www.meltcalc.com/ ) 等計算，也可通過最近鄰法 (Nearest Neighbor Method )確定。
然后，由這些Tm值確定目標堿基位點的基因型(突變型、 正常型等)。Tm分析中，能夠獲得如下的結果完全互補的雜 交體(完全匹配)與一個堿基不同的雜交體(錯配)相比，其 顯示解離的Tm值將變高。因此，通過對上述探針預先確定完全 互補的雜交體的Tm值和 一 個堿基不同的雜交體的Tm值，可確 定目標堿基位點的基因型。例如，假設目標堿基位點的堿基為 突變型，則在使用的探針與包含該突變型堿基的檢測目標序列 互補的情況下，如果形成的雜交體的Tm值與完全互補的雜交體 的Tm值相同，則可將目標堿基判斷為突變型。另外，如果形成 的雜交體的Tm值與一個堿基不同的雜交體的Tm值相同(比完 全互補的雜交體的Tm值更低的值)，則可將目標堿基判斷為正 常型。
19另夕卜，如前所述，在本發明中，例如，也可以進行雜交體 形成時的信號變動的測定，來代替升高包含所述探針的反應液 的溫度(加熱雜交體)后，測定伴隨溫度上升的信號變動的方 法。即，也可以在降低包含所述探針的反應液的溫度以形成雜 交體時，測定伴隨所述溫度下降的信號變動。
作為具體例子，在使用單獨時顯示信號且通過雜交而不顯
示信號的標記探針(例如，鳥嘌呤猝滅探針)的情況下，當處
于單鏈DNA與探針解離狀態時發出熒光，然而在通過降低溫度
而形成雜交體時，所述熒光則減少(或猝滅)。因此，例如只需 通過緩慢降低上述反應液的溫度，測定隨著溫度下降而減少的 熒光強度即可。另一方面，在使用單獨時不顯示信號且通過雜
交而顯示信號的標記探針的情況下，當處于單鏈DNA與探針解 離狀態時不發出熒光，然而在通過降低溫度而形成雜交體時， 則發出熒光。因此，例如只需通過緩慢降低上述反應液的溫度， 測定隨著溫度下降而增加的熒光強度即可。 <引物對〉
本發明的引物對，其特征在于，其為用于通過核酸擴增法 擴增JAK2基因的引物對，其包括一對引物，該一對引物包含由 下述(F)的寡核苷酸組成的正向引物及由下述(R)的寡核苷 酸組成的反向引物。
(F ):與以序列號2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基(c ) 作為第一位》威基并朝5，方向直至第24 ~ 44位石成基的區域序列相 同的至少一個寡核香酸，該寡核苷酸以所述胞嘧咬堿基(c)作 為3，末端
(R):與以序列號2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區域互 補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與所述第255位的胞嘧啶
20堿基(C)互補的鳥噤呤堿基(g)作為3，末端
在本發明中，只要各引物中起著決定DNA聚合酶的擴增起 始點作用的3，末端堿基滿足上述條件即可。
這樣，由于只需將正向引物和反向引物的3，末端的堿基固 定即可，各引物的長度本身并無特別限定，可以適當地調整為 一般長度。作為引物長度的一例，例如在13 ~ 50mer的范圍內， 優選14 45mer,更優選15 40mer。作為具體例子，上述正向 引物優選為與以序列號2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基(優選第 25~35位石威基，更優選第27 ~ 32位石威基)的區域序列相同的至 少一個寡核普酸。另外，上述反向引物優選為與以序列號2 的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝3， 方向直至第23 ~ 47位堿基(優選第25 ~ 38位堿基，更優選26~ 31位堿基)的區域互補的至少一個寡核苷酸。另外，由于正向 引物與反向引物的3，末端被固定，由引物延伸出的區域為例 如序列號2中的第194位~第254位的區域，獲得的擴增產物的總 長根據所使用的引物長度而變化。
而且，反向引物可以是與序列號2所示的堿基序列不完全互 補的寡核苷酸，正向引物也可以是與上述堿基序列的互補鏈的 堿基序列不完全互補的寡核普酸。即，各引物中除3，末端的堿 基以外的部分，例如可以與完全互補的寡核苷酸有l個~ 5個堿 基不同。
但本發明不限于此。其中，正向引物優選序列號25,反向引物 優選序列號51。 [表l ]( 正向引物) 序列號
5 ， -1tagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'9
5， -tagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3，10
5， -agtctttctttg3agcagca8gtatgatgagcaagctttctc-3'11
5' -gtctttctttg8agc鄉38gt8tgatgagcaagctttctc-3'12
5' -tctttctttgaagc3gc朋gtatgatgagcaagctttctc-3'3
5， -ctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'14
5' -tttctttgaagc鄉aagtatgatgagcaagctttctc-3'15
5 ， -ttctttgasgcagcaagtatgatgagcaagctttcte—3'16
5' -tctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'17
5 ， -ctttgaagc鄉鄉t8tgatgagcaagctttctc-3，18
5， -tttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3，19
5' -ttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'20
5' -tgaagc8gca灘tatgatgagcaagc tttctc-3'21
5' -gaagcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3 ，22
5 ， -aagcagcaagtatgatgagcaagc tttctc-3'23
5 ， -agcagc卿tatgatg鄉aagctttctc-3 ，24
5 ， -gcsgcasgtatgatgagcaagctttctc-3 ，25
5 ， -C8gcaagtatgatgagca3gctttctc-3，26
^ -agcaagtatgatgagcaagctttctc-3，27
5， -gcaetgtatgatgagc卿ctttctc-3，28
5, -caagtatgatgagcaagctttctc-3，29
5， —aagtatgat跳caagctttctc—3,30(反向引物〉 序列號
5 ， —ctatataa3ca88Ji8cagatgctctgaga朋ggC3ttagaaagcctg"3 ，31
5 > -tatataa8ca朋aacagatgctctg8gaaaggcatt3gaaagcctg"3 ，32
5， —atataaaca3aaa.c3gatgctctg3gaaaggcattaga33gcctg~3，33
5' -tataaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3，34
5' -ataaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg~3，35
5' —taaacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3，36
5' -a3ac3a3aacagatgctctg3gaaaggcattagaaagcctg—3，37
5 ， 一aacaaaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，38
5, -ac幼a88eagatgctctg8gaaaggcattaga冊gcctg-3,39
5' —casaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，40
5 ， 一a3aaac8g3tgctctgaga8aggcatt8gaEiagcctg—3 ，41
5 ， —aaaacagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg"3'42
5 ， -asacagatgctctgagaaaggcatt8gaaagcctg~3}43
5 ， —aacagatgctctgaga83ggcattegaaagcctg"3 ，44
5， 一acagatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-"3 ，45
5 ， —cagatgctctgagaa8ggcatt觀aaagcctg-3'46
5， ~agatgGtctgagaaaggcattagaaagcctg~3 ，47
5 ， 一gatgctctgagaaaggcattagaaagcctg-3'48
5' -atgctctg3gaaaggcattaga犯gcctg~3'49
5 ， —tgetctgagaaaggeattagaaagcctg—3 ，50
5， —gctctgagaaaggcattaga幼gcctg-3,51
5 ， —ctctgagaaaggcattagaaagcctg~3 ，52
5' -tctgag3aaggcattagaaagcctg~3 ，53
5' —ctgagaaaggcattagaaagcctg-3 ，54
5， —tgaga朋ggc8ttag朋agcctg"3，55
本發明的引物對中的正向引物與反向引物的摩爾比并無特 別限定。而且，核酸擴增反應過程中的上述兩者的摩爾比也并
無特別限定，例如，正向引物(F)與反向引物(R)的摩爾比 (F: R)優選為1:0.01 ~ 100,更優選為1:0.1 ~ 10,特別優選為 1:0.5 ~ 2。<突變一企測試劑盒〉
本發明的突變檢測試劑盒，其特征在于，其為為了在本發
明的JAK2基因中的突變的檢測方法中使用的突變檢測試劑盒，
其包含本發明的探針。本發明的特征在于，使用上述本發明的 探針，對其它組成等并無任何限定。而且，本發明的使用方法，
可按照本發明的突變^r測方法進行。
本發明的突變檢測試劑盒，還可進一步包括構成本發明的 引物對的正向引物和反向引物中的任意一種，也可同時包括兩 者。而且，本發明的突變纟全測試劑盒，例如還可進一步包括核 酸擴增所需的試劑、使用說明書等。
下面，對本發明的實施例進行說明。但是，本發明并不局 限于下述的實施例。
實施例1
JAK2基因外顯子12的第73位堿基的點突變(g—t)的檢測 使用本發明的探針，對序列號1所示的JAK2基因的外顯子 12的第79位石威基的點突變(g—t)進行Tm分析。 (受試品)
使用JAK2 / V617F陽性白血病細胞抹HEL和JAK2野生型 白血病細胞抹MYL。將各細胞的培養液混合，使其細胞數達到 以下比例，并將10[iL該培養混合液在95。C下處理5分鐘，將處 理后的樣品作為PCR用樣品。 [表3 ]HEL: MYL
(mt脆)銜生型DNA)
0: 10 0
0個: 1 X 1 06個
1: 9 9
1 X 1 o4個:9 9 X104個
1 0: 9 0
1 X 1 0 5個: 9 X 1 0 5個
10 0: 0
1 X 1 0 6個 0個
(探針和引物對)
檢測用探針(序列號3) 5， - agtatgtTtctgtggagac - ( TAMRA ) _ 3, 正向引物(序列號25) 5" - gcagcaagtatgatgagcaagctttctc - 3' 反向引物(序列號51 ) 5' - gctctgagaaaggcattagaaagcctg - 3， (Tm分析)
在5pL上述PCR用樣品中加入由20^L下述P -mix和25|aL下 述E-mix形成的混合液，進行PCR反應。所述PCR反應如下使 用熱循環儀，95。C處理60秒后，以95。C處理5秒和58。C處理30 秒為一循環，重復35 50個循環，隨后95。C處理1秒，40。C處理 60秒。此后繼續以rC/3秒的溫度上升速度，將所述PCR反應液 從40。C加熱至70°C ,測定經時的熒光強度的變化(波長585 ~ 700腿)。
25[表4]
(P-m i x) 蒸餾水
100Mmol/L正向引物 100/xmol/L反向引物 5"m。l/L檢測用探針
(E-m i x) 18.75 蒸餾水 8.5
0.25 2.5廳1/L dNTP 4 '
0.5 10X Gene Taq buffer* 5
_0.5 40%甘油 6.25
總計 20 mL 20% bsa 1
5U/u1 GeneTaa FP* 0. 25 總計 25 m L
* 商品名GeneTaqFP (二'7求y^—V.公司制)
該結果如圖l所示。圖l為表示隨溫度上升的熒光強度變化
的Tm分析圖。該圖中，(W)表示野生型(正常型)DNA( 100%) 的結果；(M)表示mt (突變型)DNA ( 100%)的結果；(Ml ) 表示mtDNA:野生型DNA為l:99的混合物的結果；(M10 )表示 mtDNA:野生型DNA為10:90的混合物的結果。如該圖(W)所 示，野生型DNA( 100%)的峰^f直為52。C,如(M)所示，mtDNA (100%)的峰值為58。C。以這些峰值溫度(Tm值)作為評價 標準，對野生型DNA與mtDNA的混合物的峰進行了評價。其結 果，如該圖中的(Ml)與(M10)所示，使用上述檢測用探針 的結果，分別在與所述評價標準相同的溫度下，檢測到野生型 DNA的峰和mtDNA的峰。由此結果可知，通過本發明的探針， 即使在mtDNA和野生型DNA共存的情況下，也可以充分確保 mtDNA的檢測靈敏度。而且，可知在采用一^:的直接測序法和 焦磷酸測序法的情況下，檢測靈敏度約為5 20%，即，若不存 在5 ~ 20%的mtDNA則難以檢測到，但通過使用所述檢測用探針 進行Tm分析，即便mtDNA僅約為1%也能夠充分地檢測，可知 其靈敏度極高。
另外，采集慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者的血液，進行基因組DNA的提取，采取同樣的方法，對JAK2基因的突變 進行Tm分析。其結果，在眾多患者中，所有真性紅細胞增多癥 病例(PV病例10例)和原發性血小^反增多癥病例(ET病例 4例)中均檢出JAK2-V617F。另夕卜，對于ET病例，其位于直接 測序法的4企測限以下，所以可知本實施例中的方法具有才及高的 檢測靈敏度，特別有用。 工業上的可利用性
如上所述，通過本發明的探針，即使在發生檢測目標突變 的JAK2基因(突變基因)與未發生突變的JAK2基因(正常基 因)共存的情況下，也能夠檢測出含有檢測目標突變的突變基 因。例如，在所述Tm分析中，若為以往的探針，如上所述，因 探針會與僅一個堿基不同的突變基因以及正常基因兩者雜交， 因此所述融解曲線中兩者的信號重疊，而非常難以檢測出突變 基因的存在。相對于此，利用本發明的探針，雖然探針會與突 變基因以及正常基因兩者雜交，但在融解曲線中可以分離兩者 的信號。而且，通過使用本發明的探針的方法，具有比已知方 法直接測序法和焦磷酸測序法更高的檢測靈敏度。因此，根據 本發明，例如，即使利用Tm分析也能夠以高靈敏度實現突變基 因的檢測。
權利要求
1.一種探針，其為用于檢測JAK2基因的突變的探針，其由下述(X)和(Y)中的至少一種寡核苷酸組成，(X)與以序列號1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子12中第84位的胞嘧啶堿基(c)作為第一位堿基并朝5’方向直至第17～22位堿基的區域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(c)作為3’末端，(Y)由所述(X)的互補序列組成的寡核苷酸。
2. 根據權利要求l所述的探針，其中，所述(X)為由選 自序列號3 ~ 8所組成的組中的至少 一 個序列號的石威基序列組成 的寡核苦酸。
3. 根據權利要求l所述的探針，其中，所述堿基序列中的 堿基(k)為胸腺嘧啶(t)。
4. 根據權利要求l所述的探針，其中，所述探針為用于檢 測序列號l的堿基序列中第73位堿基的突變(g—1)的探針。
5. 根據權利要求l所述的探針，其中，所述探針為用標記 物標記的標i己4笨4十。
6. 根據權利要求5所述的探針，其中，所述標記探針為 單獨時顯示信號且通過雜交而不顯示信號的標記探針，或為單 獨時不顯示信號且通過雜交而顯示信號的標記探針。
7. 根據權利要求5所述的探針，其中，所述標記探針為用 熒光染料標記的探針，所述標記探針在單獨時顯示熒光且通過 雜交熒光強度減弱。
8. 根據權利要求5所述的探針，其中，所述標記探針為寡 核苷酸的3 ，末端的胞嘧啶堿基被標記的探針。
9. 根據權利要求l所述的探針，其中，所述探針為用于Tm 分析的探針。
10. —種突變的檢測方法，其特征在于，其為JAK2基因中的突變的檢測方法，包含下述工序(A) ~ (C),(A) 準備反應體系的工序，所述反應體系含有要檢測有 無所述突變的待測核酸以及權利要求1所述的纟罙針，(B) 改變上述反應體系的溫度，測定所述待測核酸與所 述探針形成的雜交體顯示融解狀態的信號值的工序，(C) 通過隨溫度變化的所述信號值的變動，確定所述待 測核酸中有無所述突變的工序。
11. 根據權利要求10所述的檢測方法，其中，JAK2基因中 的突變為序列號1中所示的JAK2基因的外顯子12中第73位堿基 的突變(g—t)。
12. 根據權利要求10所述的檢測方法，其中，所述(A) 工序中的所述待測核酸為利用核酸擴增法由模板核酸擴增得至)J 的擴增產物。
13. 根據權利要求12所述的檢測方法，其中，所述(A) 工序還包括使用引物對由模板核酸擴增待測核酸的工序。
14. 根據權利要求13所述的檢測方法，其中，所述引物對 為包括由下述(F )的寡核苷酸所組成的正向引物和由下述(R) 的寡核苷酸所組成的反向引物的一對引物，(F):與以序列號2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區域序 列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，(R):與以序列號2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c )作為第 一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區域互 補的至少 一 個寡核香酸，該寡核苷酸以與所述第2 5 5位的胞嘧啶 堿基(c)互補的鳥噪呤堿基(g)作為3，末端。
15. 根據權利要求14所述的檢測方法，其中，所述(F)的寡核苷酸為下述(Fl)的寡核苷酸，所述(R)的寡核苷酸為下述(Rl )的寡核苷酸，(Fl):由序列號25的堿基序列組成的寡核苷酸， (Rl):由序列號51的堿基序列組成的寡核苷酸。
16. 根據權利要求10所述的檢測方法，其中，所述探針為 用熒光標記的標記^笨針，在上述(B)工序中，測定所述熒光 標記的熒光強度。
17. 根據權利要求10所述的檢測方法，其中，待測核酸為 生物樣品來源的核酸。
18. 根據權利要求17所述的檢測方法，其中，所述生物樣 品為血液。
19. 一種引物對，其特征在于，其為用于通過核酸擴增法 擴增JAK2基因的引物對，其包括一對引物，該一對引物包含由 下述(F)的寡核苷酸所組成的正向引物及由下述(R)的寡核 苷酸所組成的反向引物(F):與以序列號2的堿基序列中第193位的胞嘧啶堿基 (c)作為第一位堿基并朝5，方向直至第24 44位堿基的區域序 列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核香酸以上述胞嘧啶堿基(c) 作為3，末端，(R):與以序列號2的堿基序列中第255位的胞嘧啶堿基 (c)作為第 一位堿基并朝3，方向直至第23 ~ 47位堿基的區域互 補的至少 一 個寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第2 5 5位的胞嘧咬 堿基(c)互補的鳥噤呤堿基(g)為3，末端。
20. 根據權利要求19所述的引物對，其中，所述(F)的寡 核苷酸為下述(Fl)的寡核苷酸，所述(R)的寡核香酸為下 述(Rl )的寡核苷酸，(Fl):由序列號25的堿基序列組成的寡核苷酸，(Rl):由序列號51的堿基序列組成的寡核苷酸。
21. 根據權利要求19所述的引物對，其中，所述引物對為 用于擴增生物樣品來源的JAK2基因的引物對。
22. —種突變檢測試劑盒，其特征在于，其為為了在權利 要求10所述的、JAK2基因中的突變的檢測方法中使用的突變檢 測試劑盒，含有權利要求l所述的探針。
23. 根據權利要求22所述的突變檢測試劑盒，其中，還含 有權利要求19所述的引物對。
全文摘要
本發明提供一種用于檢測JAK2基因突變的探針，其在包含僅一個堿基不同的突變的檢測對象序列與不含突變的非檢測對象序列共存的情況下，也能檢測出含所述突變的檢測對象序列。使用的探針如下與以序列號1的堿基序列組成的JAK2基因的外顯子12中第84位的胞嘧啶堿基(C)作為第一位堿基并朝5’方向直至第17～22位堿基的區域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端。通過在例如Tm分析中使用這些探針，即便是包含發生突變的JAK2基因與未發生突變的JAK2基因的樣品，亦能夠檢測出前者的突變。所述探針優選為用熒光染料標記的探針。
文檔編號C12Q1/68GK101622363SQ20088000654
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月11日 優先權日2007年7月13日
發明者前川平, 平井光春, 木村晉也, 間島智史 申請人:愛科來株式會社