轉錄因子誘餌、組合物和方法

專利名稱：轉錄因子誘餌、組合物和方法
技術領域：
本發明提供了用于鑒定順式調節序列的方法和組合物。本發明還涉及通過改變體 內轉錄因子與順式調節元件的結合，伴隨著基因表達樣式的改變，用于特異性調控細胞表 型例如原核表型的方法和組合物。
背景技術：
基因表達是細胞表型的主要決定因素，而DNA-蛋白相互作用則在很大程度上決 定了基因表達樣式。在工業微生物、實驗模型、病原體中或為了解決人類疾病，改變基因表 達以致影響表型是生物學和醫學的主要目標。在本文中，基因組中的順式調節序列(轉錄 機的DNA成分)是具有吸引力的用于干預的靶標。與對付蛋白相比，對DNA起作用遠遠容 易得多測序高度自動化且相對便宜，并且DNA能容易操縱并易于擴增或合成。基于DNA的 治療也已涌現為一類令人激動的新治療藥物。與傳統藥物(天然產物或小分子)相比，DNA 是一類具有吸引力的治療藥物，因為其能·通過理性方法設計，最簡單的是通過研究序列數據來進行；·規模化便宜制備，通過化學合成寡核苷酸或生物學復制來進行；·預計具有低毒性，因為DNA是一種‘天然’化合物且其中或自身通常不會誘導免 疫應答，并且特異性能通過基于DNA治療的序列得到控制；·大大降低了研發經費，因為縮短了常規藥物開發的全部階段(靶標鑒定、先導化 合物發現、藥物化學)。因而，挑戰就變成了如何鑒定關鍵的順式調節元件。在基因組測序計劃的同時所 開發的技術和專門知識，例如利用DNA微陣列的大規模并行基因表達分析以及使用生物信 息學來注釋基因組數據庫，皆不足以鑒定所有順式調節元件或將功能歸屬于已知的那些順 式調節元件。在2003年，美國國家衛生研究院啟動了 ENCODE計劃以編目人基因組中
的順式調節元件(Science (2004) 306 :636_640 ；Nature (2007) 447 :799_816)并開發高通 量技術作為發現平臺。該開發的方法包括使用染色質免疫沉淀反應，超靈敏地探查對體內 DNA酶I消化的敏感性(使用DNA微陣列、高通量定量PCR和基因組文庫)并開發用于生 物信息檢測的新算法。雖然這些技術具有大大加速順式調節元件發現的潛力，但是它們未 必會產生它們的功能特征該計劃的輸出結果是這些元件的綜合性編目。雖然從該項工作 中，根據哪一種類型的反式作用因子結合它們，有可能獲知大多數元件的組織特異性，以及 它們與基因的距離和分類，但是其仍不足以確定元件的生物功能實際上是什么。對于所有 這些方法而言，所共有的進一步的缺點在于它們依賴被測序的生物體的基因組。此外，利用 對DNA酶I消化的超靈敏性的方法具有額外的缺點，即它們特異于真核細胞，因為在該環境 中DNA酶I是染色質結構的探針，而在原核生物中則無可比較的結構存在。此外，迄今尚無用于針對大量序列快速篩選可能的順式調節序列的手段。發明概述本發明人通過提供用于在原核和真核生物中鑒定及表征順式調節序列的新方法 解決了本領域中的這些問題。
一種鑒定并表征各順式調節元件功能的方式是使用轉錄因子誘餌(decoy) (TFD)。 設計誘餌寡核苷酸以模擬轉錄因子結合位點并阻止后者與它們的關連基因組靶標結合，隨 之發生基因表達的改變。同樣，它們代表了一種用于操縱DNA-蛋白相互作用的簡單且通 用的手段，其調節特定基因并因此決定表型。業已主要在真核系統中證實了它們的效用， 在該系統中鞭策它們開發的是它們起新一類治療劑作用的潛力(Marm&DzaU(2000) J. Clin. Investigation 106:1071-1075)。為此，誘餌寡核苷酸已被用于證實轉錄因子EF2抑制 大鼠中平滑肌增殖(Morishita 等(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5855-5859)；阻斷 STAT3 介導的癌增殖(Leong 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4138-4143)；以及顯 示靶向cAMP應答元件能控制體內癌增殖(Park等(1999) J. Biol. Chem. 274 1573-1580)。然而，尚未開發能查詢基因組片段或全基因組中序列的每一事件的大規模使用 TFD的系統。按照實際情況來說，其應當需要合成非常大量的誘餌寡核苷酸以及涉及它們轉 染和對表型改變進行篩選的繁重實驗程序。這里描述的本發明通過開發基于質粒攜帶文庫的系統解決了該需要，該系統能系 統地測試大量序列以確定它們是否在基因組中充當順式調節子，并將它們與特定表型效應 相關聯。我們在此將該系統稱為“n[圈套]，，(snare)。此外，一旦發現相關順式調節序列，那些序列可用于創建TFD，該TFD可用于改變 基因表達并獲得對表型的控制。出于數項原因，盡管誘餌被開發用于哺乳動物細胞，但是 它們更好地適用于細菌中。在真核生物中讓誘餌起作用可能存在問題，原因在于它們在 血清和細胞核提取物中能快速降解(Chu&Orgel (1992)Nucl. Acids. Res. 20 :5857_5858)， 誘餌的細胞攝取及其跨核膜遷移可能是無效的(Griesenbach等(2002)Gene Therapy 9 1109-1115)，以及某些處理能觸發非特異性或毒性效應。在原核生物中使用誘餌回避了大 多數的這些問題，因而它們能被證實是一種有效用于順式作用調節序列例如控制特定基因 和較大調節網絡的轉錄因子結合位點快速鑒定的工具。該方法的一個成功的示范是使用 富含AT的誘餌來改變藍細菌中CO2應答基因的表達(Onizuka等(2003)FEBS Lett. 542 42-46)。在該系統中，退火帶有修飾的主鏈的互補寡核苷酸(包含硫代磷酸酯以減緩核酸 酶降解)形成摻入之前鑒定的轉錄因子結合位點的雙鏈誘餌寡核苷酸。將這些雙鏈誘餌寡 核苷酸直接加到其有效從中進入細胞的培養基中。然而，所報道的僅僅是一個實例，我們知 道在該方法中已成功地嘗試改變特定的原核性狀。因此，在本領域中仍然需要將該誘餌方 法學擴展到原核轉錄因子領域中，以從而改變廣泛原核表型。此外，在本領域中還需要用于 鑒定順式作用調節因子的高通量方法，無論是在原核或在真核系統中。本專利公開內容提 供了針對本領域的上述局限和需要的解決方案。在一個具體的方面，本發明提供了用于增加細胞如細菌細胞對抗生素敏感性的新 手段。因此，在一方面本發明提供了誘餌多核苷酸在調控細胞抗生素抗性的方法中的應 用，該方法包括(a)提供包含轉錄因子結合位點(誘餌序列)的誘餌多核苷酸；并(b)將該多核苷酸導入細胞中，其中細胞包含可操作地連接包含轉錄因子結合位 點的順式調節序列的一種或更多種基因；其中多核苷酸的導入減少了細胞中轉錄因子與順式調節序列的結合并導致細胞中可操作地連接的一種或更多種基因表達的改變，從而調控細胞的抗生素抗性。本發明還提供了 -一種包含轉錄因子結合位點的誘餌多核苷酸，其中轉錄因子是原核生物或真核 生物中一種或更多種抗生素抗性基因表達的調節子，以及其中誘餌多核苷酸中的結合位點 不與基因可操作地連接。-一種包含一個或更多個拷貝的單體序列的質粒，其中單體序列包含圈套序列，該 圈套序列包含轉錄因子結合位點，以及其中結合位點不與基因可操作地連接。-一種包含兩個或更多個本發明的質粒的質粒文庫，其中文庫中的圈套序列共同 包含原核生物或真核生物基因組DNA或基因組DNA片段中所有或基本上所有的順式調節序 列；-一種包含兩個或更多個本發明的質粒的質粒文庫，其中每個質粒中的圈套序列 都包含長度η個核苷酸的隨機化核苷酸序列，其中基本上所有的長度η個核苷酸的核苷酸 序列都呈現在文庫中；-一種制備具有兩個或更多個拷貝的單體序列的質粒的方法，該方法包括(1)提供包含如下的環狀寡核苷酸(i)目標測試序列；和(ii)適用于滾環擴增的引物的結合位點；其中單體序列包含(i)和(ii)；(2)使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多 核苷酸；以及(3)將該多核苷酸克隆入質粒載體中；_ 一種由基因組DNA樣品制備質粒文庫的方法，其中每個質粒都包含一個或更多 個拷貝的單體序列，以及其中每條單體序列都包含來源于基因組DNA的圈套序列；該方法 包括(1)提供雙鏈基因組DNA樣品；(2)片段化基因組DNA ；(3)將銜接頭連接到來自(2)的DNA片段的每一末端上，其中每一銜接頭包含(iii)用于固定DNA片段的手段(means)；(iv)在與該識別位點隔開一段距離切割的第一限制酶的識別位點；和(ν)第二限制酶的識別和切割位點；(4)任選地除去未連接的銜接頭；(5)用第一限制酶消化帶有銜接頭的片段，從而產生兩條銜接片段，其中每條銜接 片段包含(vi)銜接頭；和(vii)包含如下的DNA片段較短的鏈，和較長的鏈，其中較長的鏈包含圈套序 列；(6)固定(5)中產生的銜接片段；(7)變性該片段以提供單鏈片段；(8)通過將互補寡核苷酸連接到銜接頭來再建第二限制酶識別位點并用第二限制酶消化該銜接片段，從而產生包含如下的銜接頭_圈套片段(viii)銜接頭片段；和(ix)單鏈圈套序列；和(9)從固定狀態釋放(8)中產生的銜接頭_圈套片段；以及(10)將該銜接頭_圈套片段克隆入質粒載體中；-一種制備質粒文庫的方法，其中每個質粒都包含兩個或更多個拷貝的單體序列， 以及其中每條單體序列都包含長度η個核苷酸的隨機化核苷酸序列，該方法包括(1)提供包含如下的環狀寡核苷酸(i)長度η個核苷酸的隨機化序列；和(ii)適用于滾環擴增的引物的結合位點；其中單體序列包含(i)和(ii)；(2)使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多 核苷酸；以及(3)將該多核苷酸克隆入質粒載體中；-根據本發明的方法制備的質粒或質粒文庫；-一種包含外源誘餌多核苷酸的細胞，該多核苷酸包含不與基因可操作地連接的 轉錄因子結合位點(誘餌序列)；其中該細胞包含可操作地連接包含轉錄因子結合位點的 順式調節序列的一種或更多種基因；以及其中該誘餌多核苷酸導致細胞抗生素抗性改變。-包含本發明的質粒或質粒文庫的一種或多種宿主細胞；_ 一種鑒定蛋白-DNA復合物中一個或更多個蛋白結合位點邊界的方法，該方法包 括1.提供蛋白-DNA復合物；2.用如下的進行消化a.具有非特異性DNA切口能力的酶；和b. 5’ -3’外切核酸酶；以及3.相對于DNA鏈上已知固定點，測定(2)中的每條DNA鏈中產生的5，缺失的位 置；-一種鑒定原核或真核一種或更多種基因表達的順式作用調節子的方法，包括1.提供本發明的質粒文庫；2.將該質粒文庫導入宿主細胞中，其中該宿主細胞包含可操作地連接一種或更多 種基因的目標順式調節序列，該一種或更多種基因的表達可直接或間接測定；以及3.在質粒文庫存在和不存在下，直接或間接測定該一種基因(或多種基因)的表 達；-一種改變原核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含原核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多核苷酸 中基因可操作地連接；和(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序 列包含轉錄結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合；
以及其中(i)多核苷酸包含根據本發明的質粒或質粒文庫；(ii)多核苷酸包含多于一個拷貝的結合位點；(iii)多核苷酸包含多個同向重復的結合位點；(iv)多核苷酸包含附加到結合位點上的額外的序列；(ν)多核苷酸包含至少一個二級結構元件；(vi)多核苷酸包含環狀雙鏈DNA ；-一種改變原核或真核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含原核或真核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多 核苷酸中基因可操作地連接；和(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序 列包含轉錄結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合；以及其中該順式調節序列是一種通過本發明方法鑒定的順式調節序列；-一種改變真核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含真核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多核苷酸 中的基因可操作地連接；和(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序 列包含轉錄結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合；以及其中多核苷酸包含根據本發明的質粒或質粒文庫；-一種根據本發明的方法制備的細胞；-用于治療細菌感染的誘餌多核苷酸，其中該多核苷酸包含轉錄因子結合位點以 及該結合位點不與基因可操作地連接；-誘餌多核苷酸用于治療細菌感染的應用，其中該多核苷酸包含轉錄因子結合位 點以及該結合位點不與基因可操作地連接；-誘餌多核苷酸在制備用于治療細菌感染的藥物中的應用，其中該多核苷酸包含 轉錄因子結合位點以及該結合位點不與基因可操作地連接。因此，在本專利公開內容的本發明的一個實施方案中，我們提供了一種將誘餌法 與簡單的體內足跡法相結合以快速鑒定候選的順式作用調節基序的方法。通過將這些序 列摻入啞鈴狀誘餌寡核苷酸中，該環狀形式抑制了外切和內切核酸酶降解[Ahn等(2003) Biochemical Biophysical Res. Comm. 310 1048-1053]，并通過在體內測試它們對表型的 影響，從而實現了它們的功能驗證。在根據本發明的另一個實施方案中，我們證實了使用通過應用足跡法鑒定的誘餌 寡核苷酸，我們能顯著地改變鏈霉菌中抗生素產生水平。在根據本發明的一個進一步的實施方案中，我們證實了在治療方法中利用原核誘 餌的能力，借此使得對萬古霉素具有抗性的致病細菌在治療窗口中再次對抗生素敏感。因此，本發明人提供了一種通用篩選系統，借助于該系統，鑒定了任何基因組中的 順式作用調節元件，以及來源于以該方式鑒定的這樣元件的序列以一種如下的方式用于改變所選擇的表型，該方式類似于根據通過本發明別的實施方案所闡明的而被證實。本發明人還已修改并擴展了誘餌寡核苷酸技術用于原核生物，并證實了增加抗生 素產生的能力。此外，本發明人已證實了誘餌寡脫氧核苷酸可被應用以有利地克服正在治療的病 原體中的抗生素抗性。本發明的其他實施方案、效用和細節可通過對完整公開內容的回顧而得以領會， 所述完整的公開內容包括在此提供的具體實施例以及所附的權利要求書，包括它們的等價 物。附圖簡述

圖1。η[圈套]質粒的構建和測試。該方案還可用于產生由隨機寡核苷酸制成的 ‘通用’ η[圈套]文庫，或來自片段化的基因組的種特異性文庫。圖2。提供了 η[圈套]質粒如何能用于影響基因表達的圖示。通過標準手段將 η [圈套]質粒導入靶定細胞(如原核生物)中，并通過對其標記進行選擇確保其穩定增殖， 該標記通常是編碼對抗生素的抗性的基因。當這樣導入細胞中時，η[圈套]質粒通過從基 因組啟動子滴定掉轉錄因子“B”以減輕下游基因的轉錄阻遏，從而能影響靶定基因的表達 (如水平框“D”，右上所示的)。圖3。η[圈套]方法的示范。η[圈套]質粒能以伴有表型改變的可預測的方式調 控基因表達的控制。這些質粒較誘餌生產更便宜且更易于轉化入細胞中，提供了更持久的 效果，并且至關重要的是它們使文庫法能發現關鍵調節元件。圖4。創建定制η[圈套]質粒文庫過程的一部分將基因組片段轉變為短單鏈 核苷酸。以DNA中每條順式調節序列都應呈現在文庫中的這樣一種方式，由大片DNA創建 η[圈套]質粒文庫。圖5。η[圈套]質粒文庫可用于獲得被靶定表型例如抗生素產生的控制。在通過 接合將文庫成員導入后，在增加的肉桂霉素產生的基礎上選擇克隆(右)。圖6。應用η[圈套]以對抗抗生素抗性的更多細節。該圖中的示意圖顯示了當關 于該機制的遺傳途徑未知時，η[圈套]質粒文庫如何用于鑒定控制抗生素抗性的順式調節 序列。圖7。被開發以鑒定η[圈套]質粒文庫中順式調節元件的報道構建體。在該圖 中，靶定的來自肉桂鏈霉菌(S. cinnamoneous)產生菌株的肉桂霉素生物合成簇的cin7基 因的啟動子被用于驅動編碼對抗生素卡那霉素的抗性的neo基因的表達。圖8。使用通用報道系統和定制η[圈套]文庫檢測肉桂霉素產生的負順式調節 子。一種簡單的改變使得該報道系統能檢測正調節，即創建由嵌合報道基因組成的盒，其中 摻入葡萄糖激酶基因(glkA)的編碼序列，受靶定的啟動子所驅動。圖9。文庫雜交以鑒定候選克隆。為與能真實地干擾轉錄的η[圈套]質粒區分構 成相當大一部分總信號的‘背景’成員，使用標準方法開發了文庫雜交策略。圖10。使用通用報道系統和定制η[圈套]文庫進行雜交篩選，檢測來自獨立重復 操作的候選物以檢測能調節肉桂霉素產生的順式調節子。在該實例中，用報道菌株測試兩 個獨立的肉桂鏈霉菌文庫，并且使用來自每個文庫的96個最大卡那霉素抗性克隆為每個 克隆(Fl和F2)和兩個探針組(Pl和Ρ2)制備包含η[圈套]質粒的濾膜。所有通過交叉雜交(Fl對P2以及F2對Pl)鑒定的克隆都被認為是有力候選物，并給予在兩次交叉雜交 實驗中所共有的那些(畫紅圈)以優先權。圖11。大腸桿菌(Escherichia coli)K12基因組η[圈套]文庫的限制性消化分 析證實了其具有預期的序列特性。用EcoRI消化此質粒混合物以再生用于創建η[圈套] 文庫的片段，并對這些文庫進行MmeI消化以證實構建已運轉的分子生物學正如所料，插 入片段是大尺寸的且這些插入片段在用MmeI完全消化下瓦解為30bp單體。圖12。在無遺傳網絡先驗知識下n[圈套]文庫用于操縱表型。該過程重復四次 并且每次均測定細胞生存力。圖13。體內T7外切核酸酶/DNA酶I定位操作方案的圖解概要。該足跡法中T7 外切核酸酶和DNA酶I的新組合容許檢測啟動子區中所有DNA-蛋白復合物邊界，而不僅僅 是那些最接近所選擇的限制性位點的邊界。圖14。aCtII-orf4啟動子中候選調節基序的T7外切核酸酶/DNA酶I定位。(A)在可見的放線菌紫素產生之前的時間點(箭頭指示的)，從生長于豐富(R5) 培養基的培養物中收獲天藍色鏈霉菌(S. C0eliC0l0r)M145細胞。(B)如圖13中所描述的， 在兩條鏈上定位了邊界，并且在12%非變性PAGE的大小分析、接著DIG標記產物的化學發 光檢測后確定了它們的位置。(C)顯示推定的順式調節元件位置(相對于在定位方案中使 用的引物)的actII-orf4啟動子的序列。圖15。平板測定法證實了誘餌寡核苷酸能影響天藍色鏈霉菌中抗生素產生。濾紙 片用誘餌溶液或作為對照的緩沖液(如所示的)飽和并施加到覆蓋SNA培養基的天藍色鏈 霉菌M145菌苔上。圖16。誘餌寡核苷酸的攝取和穩定性。用含誘餌溶液轉染活躍生長的細胞并通過 定量實時PCR(qrt-PCR)評價寡核苷酸的攝取及其穩定性。圖17。誘餌介導的在R5液體培養基中培養的培養物中放線菌紫素產生的增加。 在用(A)無誘餌對照或用(B)A24.5誘餌轉染(箭頭指示的)前天藍色鏈霉菌M145培養20 小時。圖18。誘餌介導的在SMM液體培養基中培養的培養物中放線菌紫素產生的增加。 對用㈧模擬轉染的對照和⑶誘餌A24. 5處理的培養物獲得的數據進行比較，揭示了誘 餌寡核苷酸引起放線菌紫素產生顯著增加。圖19。SC05812缺失導致R5瓊脂上放線菌紫素產生不足以及SMMS瓊脂上i^一烷 基靈菌紅素過度產生。M145 (平板左側)和M145 Δ SC05812 (平板右側)在(A) R5瓊脂培養 基或(B)SMMS瓊脂培養基上劃線接種并分別溫育72小時和96小時。圖20。提供了轉錄因子誘餌(TFD)法抗擊抗生素抗性的應用。該示意圖示范了 TFD如何用于對抗致病細菌中已知的抗性機制。對規定的抗生素萬古霉素的抗性用作一個 例子。圖 21。萬古霉素基因的結構。來自 Hong 等 2004Molecular Microbiology52 1107-1121。圖22。寡核苷酸誘餌vanH5環化的證據。將寡核苷酸在lOOpmol/ul終濃度下重 懸于T4DNA連接酶緩沖液(如酶廠商New England Biolabs提供的)和400U T4DNA連接 酶中并在16°C溫育不同時間。
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圖23。顯示了用及不用遞增水平的VanH5誘餌溫育萬古霉素抗性細菌的作用。天 藍色鏈霉菌 M600 株在液體 MMCGT 培養基(Molecular Microbiology52 1107-1121)中培 養，通過記錄培養物在430nm的吸光度(細胞密度)測定該生長并作為溫育時間的函數繪 圖。圖24。顯示了使用SEQ ID NO 24和25中引物和適當的載體底物獲得的擴增產 物(實施例7. 2)。圖25和26。顯示了如實施例8 (a)和8 (b)中所分別描述的，在用VAN轉錄因子誘 餌序列或陰性對照(CON)處理后，在萬古霉素存在下屎腸球菌(E. faecium)生長的生長曲線。圖 27。來自 Poole (2005) J. Antimicrobial Chemother. 56，22-24 的表 1 和 2 的拷 貝，分別列出了由外排介導的對非氟喹啉抗生素和氟喹啉抗生素的抗性。右欄中的參考文 獻編號指在該文獻中所給出的參考文獻編號。序列簡述SEQ ID NO 包含AfsR結合位點的誘餌寡核苷酸(實施例1)。SEQ ID NO :2_連接多核苷酸R-T7，其包含通常所用引物T7的部分互補物(實施 例1)。SEQ ID NO :3_包含AfsR結合位點的寡核苷酸并用于在實施例1中創建環化的誘 餌序列。SEQ ID NO 4和5_雙鏈銜接分子每條鏈的序列(實施例2)SEQ ID NO :6_Bbv互補寡核苷酸(實施例2)。SEQ ID NO :7_包含NotI位點和隨機化核苷酸序列的寡核苷酸，這里每個隨機化 核苷酸都表示為“η” (實施例4)。SEQ ID NO :8_12_ 基于順式調節序列 Α24. 1、Α24· 2、Α24· 3、Α24. 4 和 Α24. 5 分別設 計的誘餌寡核苷酸(實施例5)。SEQ ID NO 13-基于打亂順序的A24. 5序列設計的誘餌寡核苷酸(實施例5)。SEQ ID NO =14-20-如在實施例5中用于定量PCR的PCR引物。SEQ ID NO 21~包含磷酸化VanR結合位點的vanH5誘餌寡核苷酸(實施例6)。SEQ ID NO 22和23-如實施例7. 1中所描述的，用于從pGEMT-Easy載體擴增靶 序列的寡核苷酸引物。SEQ ID NO :24和25-如實施例7. 2中所描述的，在啞鈴狀誘餌生產中用于從 pGEMT-Easy載體擴增靶序列的寡核苷酸引物。SEQ ID NO :26_用于實施例8 (a)和8 (b)中的VAN誘餌序列，其包含控制屎腸球 菌中VanA型抗性誘導的調節元件。發明詳述如在此所更詳細描述的，本發明人已設計了用于鑒定、表征和靶向原核生物和真 核生物中順式調節序列的方法和組合物。順式調節序列或元件通常指其出現在一種或更多種基因的上游(5，)或下游(3’) 及發揮調控一種或更多種基因表達的功能的核苷酸序列。通常，順式調節序列包含調節給 定基因轉錄的蛋白(轉錄因子)的結合位點。該蛋白與序列的結合直接或間接導致對基因表達的調控。例如，結合的蛋白可與另一為恰當(correct)位置中蛋白錨定和轉錄所需的 結合附近區域的蛋白相互作用，或可抑制另一為轉錄所需的蛋白的結合。通常，該順式調節 序列或元件存在于基因的啟動子區中，但并不罕見的是在原核生物中，順式調節序列被定 位在它們所影響的基因的上游或下游好幾百個堿基對的位置處。在真核生物中，順式調節 序列能在遠處作用以影響基因表達，通常大約是l_2kb，但還知道有超過IOOkb至1Mb起作 用的序列。順式調節序列可以是阻遏的(當結合轉錄因子時抑制或減少基因轉錄)或激活的 (當結合轉錄因子時激活或增加基因轉錄)。因此，結合順式調節序列的轉錄因子可以是負 效應子(阻抑蛋白)或正效應子(激活物)。在例如順式調節序列影響分離的基因，其又影響靶向基因的表達的情況下，通過 間接效應還改變了某些基因的表達。這可例如通過如下而發生導致對靶定基因是其一 部分的調節網絡的改變，或由于更全局的影響，例如導致靶定基因表達改變的沖擊-應答 (shock-response)0對順式調節序列處蛋白結合的調控可提供一種調控細胞中基因表達的有用手段。 進行該調控的一種方式是提供誘餌核苷酸序列。誘餌序列包含轉錄因子結合位點，其包含 細胞中的天然或內源順式調節序列或與細胞中的天然或內源順式調節序列競爭關連轉錄 因子結合。通過減少轉錄因子與天然序列的結合，誘餌改變了其表達通常受細胞中的順式 調節序列調節的基因的表達。這樣的改變可提供一種有用的表型如原核細胞代謝物產生或 抗生素抗性改變。如在此所使用的誘餌功能指序列以該方式與順式調節序列競爭關連轉錄 因子結合的能力。本發明人已開發出用于鑒定與細胞轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合、改變細 胞基因表達的序列的新手段，可因此提供新的順式調節序列和誘餌序列。η [圈套]質粒在此所描述的方法是對業已用于調控體內表達的‘誘餌’寡核苷酸技術在真核生 物中的已知應用進行重要的改變。誘餌寡核苷酸的邏輯是簡單的且與所有生物系統相關 宣稱通過干擾轉錄因子與它們的關連位點的結合進行遺傳控制。我們通過提供用于遺傳調 節分析的通用且高通量的工具對該技術加以改進。通過開發一種克隆誘餌序列同聚體以創 建高拷貝‘η[圈套]’質粒的方法，第一種改進涉及進行質粒攜帶方法。這些質粒易于導入 所有細菌中并通過正選擇保持，巧妙避開了誘餌方法的主要缺陷，即寡核苷酸可能難以導 入細胞中并可對外切核酸酶敏感，從而給出相對短的半衰期。用于創建11[圈套]質粒的分子生物學方案概述在圖1中給出。η[圈套]質粒如 何影響基因調節的概述在圖2中給出。η[圈套]質粒功效的示范在圖3中給出，這里其通 過導入來自抗生素合成正多效調節子AfsR的已知順式調節序列，用于除去天藍色鏈霉菌 中抗生素產生。1. η[圈套]質粒的設計創建質粒攜帶形式的誘餌寡核苷酸而非誘餌自身供鑒定順式調節生物活性使用 的優點包括1.制造成本以下描述的分子生物學方案簡單牢靠，并可用于來自不同來源的合 成寡核苷酸或DNA片段。由于質粒自我復制，無需產生大量的質粒。因此與創建大量帶有可能的核苷酸主鏈昂貴修飾的誘餌寡核苷酸的潛在需要比較，這是有利的；2.對降解的抗性與誘餌相比，質粒顯示對核酸酶體內降解很小的敏感性；3.保持質粒濃度由于質粒是自我復制(并可具有控制它們細胞內濃度或拷貝數 的機制)且能視需要進行正選擇，因此η [圈套]質粒的半衰期在理論上是無限期的；4.廣宿主范圍在實施例1中，使用了能容易地在大腸桿菌(為了易于遺傳操作) 和天藍色鏈霉菌中轉化并增殖的‘穿梭質粒’。本領域技術人員已知多種容許廣細菌宿主范 圍轉化的質粒；5.可使用獨特的η[圈套]質粒測試順式調節序列的組合相容的質粒能潛在地 用于測定使用兩種或更多種η[圈套]質粒的同步處理是否具有協同效應。因此，在一方面本發明提供了一種適合于測試已知或推定的順式調節序列的可能 的誘餌功能，或用于篩選新的順式調節序列(其可充當誘餌序列)的質粒。該質粒被稱為 η[圈套]質粒。η[圈套]質粒的使用原理圖解于圖2中。質粒包含“圈套”序列(在該圖中示以 多拷貝)。如果“圈套”包含與細胞的順式調節序列競爭轉錄因子結合的轉錄因子結合位 點，則將該η[圈套]質粒導入細胞中會導致轉錄因子滴定掉細胞的順式調節序列并落在圈 套上。這可作為在細胞中其表達受順式調節序列調節的一種或更多種基因表達的改變或細 胞表型的改變得以檢測。因此，基因表達或表型輸出改變指示了該圈套包含具有誘餌功能 的序列，以及該質粒可用于鑒定或證實順式調節序列的功能。一般而言，η [圈套]質粒包含質粒載體和插入片段序列(該插入片段包含圈套)。 將圈套序列摻入質粒中解決了本領域中誘餌降解的問題，并容許在細胞中穩定保持誘餌 (以及對基因表達的任何影響)。插入片段序列包含一個或更多個拷貝的單體序列(其包含圈套)。因此，插入片 段可包含(例如)1-200條單體序列。通常，存在2或更多個拷貝，例如2-200個拷貝，如至 少 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190個拷貝。 例如，可以是 5-200、5-150、5-100、10-150、10-50、5-50、5-40、10-40、5-30 個拷貝。例如，可 以是30個拷貝的單體序列。質粒通常包含單體的同聚物。通常，它們是多個拷貝的單體， 例如單體序列的多個同向重復。提供多個拷貝的單體(以及如此的圈套)增加誘餌的滴定 效力。單體序列包含圈套序列。圈套包含如在此所描述的要被測試或用作順式調節或誘 餌功能的核苷酸序列。例如，圈套可包含已知或推定的順式調節序列，誘餌序列，要被測試誘餌功能的序 列的片段如基因組片段，例如啟動子片段，或隨機化核苷酸序列，或順式調節序列的組合 (如2、3、4或更多條順式調節序列)。可制備包含來源于基因組或基因組片段的所有序列 (或順式調節序列)并基本上覆蓋該基因組或基因組片段的所有序列(或順式調節序列) 的圈套序列的η[圈套]質粒文庫。還可制備其中圈套序列包含給定長度(長度“η”個核 苷酸)的隨機化核苷酸序列的η[圈套]質粒文庫。優選地，所有或基本上所有可能的長度 η的序列都呈現在文庫中。這些文庫可用于篩選鑒定包含細胞的順式調節序列和/或與該 細胞的順式調節序列競爭轉錄因子結合的序列，以及因此鑒定新的順式調節和誘餌序列。通常，圈套中的轉錄因子結合位點不與基因如圈套或圈套質粒中的基因可操作地連接。在這種意義上，該結合位點分離自其一種或多種關連基因。圈套中的結合位點還可 分離自其關連啟動子中的其它元件。在一種情況下，單體序列不包含基因。除圈套之外單體可包含額外的序列。通常，這樣的額外的序列來源于用于產生圈 套和/或質粒插入片段的方法。例如，單體可包含銜接頭序列，例如當根據在此方法對定制 η[圈套]文庫產生“定制”圈套時通常產生的銜接頭序列。該銜接頭序列可包含例如一種 或更多種限制酶的識別和/或切割位點。單體可包含提供了引物結合位點的核苷酸序列，所述引物例如在單體或包含多個 單體的插入片段生產中使用的引物。例如，當使用在此描述的滾環擴增法制備質粒插入片段時，單體通常包含相應于 用于滾環復制的引物如Τ7引物的結合位點的片段。包含隨機化圈套序列的單體通常還包含一個或多個區的恒定序列。例如，η個核 苷酸的隨機化圈套序列可側接恒定序列區。可選地，恒定序列的中央核心可側接隨機化核 苷酸序列區。單體的長度可以是例如多達1000個核苷酸，例如多達900、800、700、600、500、 400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15或10個核苷酸。通常，單體的長度在例如 10-100、10-50、20-75、30-60、30-50、35-55如35-54個核苷酸范圍內。例如，單體的長度可 以是30、40或50個核苷酸。單體的圈套部分大小范圍通常可為10-30個核苷酸，例如10-25、10-20、15-20個， 如15、16、17、18、19或20個，例如19個核苷酸。銜接頭序列可包含例如5-30個核苷酸，例如5-25、5-20、5_15或5_10個核苷酸， 如10、11、12、13、14或15個核苷酸。通常，η[圈套]質粒中的插入片段包含一個或更多個拷貝的如在此所描述的單 體。當該插入片段包含多個重復的單體時，這些單體可串聯重復。質粒載體中的插入片段可包含，例如約1.5kb，例如l_2kb，例如1. 1、1.2、1.3、 1. 4,1. 5,1. 6、1. 7或1. 8kb。然而，任何容許質粒在合適的宿主細胞中穩定保持并有效用于 本發明方法中的合適的插入片段大小皆可使用。通常，單個質粒中所有單體的序列都是相同的。用于n[圈套]質粒中的質粒載體可適用于原核或真核宿主。例如，載體可適用于 原核宿主例如細菌宿主，如放線菌宿主。例如，質粒載體可適用于鏈霉菌或大腸桿菌菌株， 例如天藍色鏈霉菌如A3(2)(或M145或M600株)、大腸桿菌、淺青紫鏈霉菌(Str印tomyces lividans)或肉桂鏈霉菌的一種或更多種。適合的宿主進一步描述在此。通常，載體是廣宿主范圍載體和/或穿梭載體并因此可在多于一種的宿主中保持 并增殖。質粒可以是一種接合質粒。這容許通過接合容易地從一個細胞轉移到另一個細胞 中。優選地，質粒是自主復制的。通常，質粒是高拷貝數質粒。例如，質粒可保持在例 如20-100個拷貝/細胞，例如20、30、40、50、60、70、80、90或95或100個拷貝/細胞。高 拷貝數增加了圈套中誘餌序列的滴定效力。 通常，n[圈套]質粒包含復制起點。合適的起點是本領域已知的。通常，質粒額 外地包含一種或更多種可檢測的標記基因，例如一種或更多種編碼抗生素抗性的基因，如編碼安普霉素抗性的aac基因。標記基因的表達使得能對質粒在宿主細胞中的保持進行篩 選。合適的質粒載體的實例包括例如pIJ86。合適的載體是本領域已知的。單體或圈套序列可包含在此描述的和/或根據在此描述的方法鑒定的順式調節 序列或誘餌序列。例如，質粒中轉錄因子結合位點可包含調節一種或更多種基因表達的順式調節序 列或與之競爭轉錄因子結合，該一種或更多種基因在代謝物產生中起作用。代謝物可以是 例如抗生素、酶或藥物。抗生素可以是例如放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素或肉桂霉素。例如，圈套可包含AfsR蛋白(天藍色鏈霉菌中抗生素合成的多效調節子)的結合 位點。AfsrR結合位點以粗體示于SEQ ID NO :1中(實施例1)。因此，單體可包含SEQ ID N0:1。因此，如在實施例1中，單體可以是SEQ ID N0:1的雙鏈形式。在一個實例中，可以 有30個重復的單體和/或質粒可包含穿梭載體PIJ86。因此在一方面，本發明涉及根據實 施例1中的方法制備的n[圈套]質粒。在另一個實例中，圈套可包含天藍色鏈霉菌aCtII-orf4啟動子中的順式調節序 列，例如在此所描述的順式調節阻抑序列，或與這樣的序列競爭轉錄因子結合的序列。例 如，順式調節序列可包含在此鑒定的序列A24. 1、A24. 2、A24. 3、A24. 4或A24. 5。在一方面， 單體可包含在此描述的SEQ ID NO :8-12之一或SEQ ID No :13。質粒中的轉錄因子結合位點可包含調節一種或更多種基因表達的順式調節序列 或與之競爭轉錄因子結合，該一種或更多種基因在決定抗生素抗性中起作用，例如任何一 種或更多種在此所列的基因。例如，圈套可包含VanR轉錄因子結合位點，例如位于如屎腸球菌或天藍色鏈霉菌 的vanH啟動子中的VanR結合位點，或與這樣的位點競爭的序列。30bp VanR結合位點的 一個實例示于(用大寫字母表示的)SEQ ID NO :21中，以及另一實例提供于SEQ ID NO 26 中，其包含腸球菌的VanR結合位點。在一個實例中，單體可包含SEQ ID NO :21或SEQ ID NO 26或與目標細胞中天然VanR結合位點競爭VanR轉錄因子結合的它們的變體。例如， 變體可包含另一種或株中的天然VanR結合位點。質粒中的轉錄因子結合位點可包含調節一種或更多種基因表達的順式調節序列 或與之競爭轉錄因子結合，該一種或更多種基因在決定溶劑耐受性如丁醇耐受性中起作用。圈套可包含來源于或分離自基因組或基因組片段的序列。基因組片段可包含編碼 特定目標功能或表型的一種或更多種基因，所述特定目標功能或表型如代謝物例如抗生素 (如肉桂霉素、放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素)的產生、對特定溶劑如丁醇或毒素的耐受 性、對特定抗生素的抗性、或任何其他目標功能或表型。圈套可包含例如來源于或分離自這 樣的基因的啟動子區或周圍序列的序列，該周圍序列例如較啟動子遠離基因的序列，如遠 離多達200bp更多大。如在此所描述的，圈套可包含與該序列競爭轉錄因子結合的序列。例如，圈套可 包含來源于包含肉桂霉素生物合成基因簇的肉桂鏈霉菌基因組片段的順式調節序列或誘 餌序列。制備這樣的圈套的方法描述于此。如在此所描述的，圈套可包含來自肉桂鏈霉菌 cin7啟動子的順式調節序列或與該序列競爭轉錄因子結合的序列。
圈套可包含來源于或分離自展示溶劑耐受性的原核生物如具有丁醇耐受性的大 腸桿菌K12的基因組或基因組片段的序列。特別是，圈套可包含來源于編碼溶劑耐受性或 其表達與溶劑耐受性相關的基因的啟動子的順式調節序列，或與這樣的順式調節序列競爭 轉錄因子結合的序列。用于制備這樣的圈套的方法描述于此。圈套可包含來源于或分離自展示抗生素抗性的原核生物基因組或基因組片段 (通常該片段包含編碼抗性的基因)的序列(如順式調節序列或誘餌序列)。基因組片段 可包含編碼抗生素抗性的一種或更多種基因。圈套可包含來自編碼抗生素抗性的基因啟 動子的順式調節序列，或與這樣的序列競爭轉錄因子結合的誘餌序列。可靶向任何目標抗 生素抗性。例如，針對如下的抗生素抗性已知為如下的抗生素類氨基糖苷類(例如卡那 霉素和慶大霉素(gentamycin))；糖肽類(例如萬古霉素)；β _內酰胺類，其包括青霉素 類(例如氨芐青霉素、羧芐青霉素和青霉素)，β _內酰胺酶抑制劑及組合(例如哌拉西林 (piperacillin)和他唑巴坦(tazobactam))，頭孢菌素類(例如頭孢吡月虧(cefepime)), 碳青霉烯類(例如美羅培南(meropenem))，單菌胺類/單環β-內酰胺類(例如氨曲南 (Aztreonam))；多肽類抗生素(例如多粘菌素B (polymixcinB))；喹啉類(例如左氧氟 沙星(Ievaquin))；氟喹啉類(例如環丙沙星(ciprofloxacin))；磺胺類(例如菌特靈 (Bactrim))；四環素類(例如四環素)；大環內酯類和酮內酯類(ketolides)(例如阿奇霉 素(azithromycin))；噁唑烷酮類(oxazolidinones)(例如利奈唑胺(Iinezolid))；硝基 咪唑類(例如甲硝唑(metronidazole))；硝基呋喃類(例如呋喃妥因(nitrofurantoin))； 鏈陽菌素類(str印togramins)(例如達福普汀(dalfopritsin))；環狀脂肽類(例如達托 霉素(daptomycin))；林可酰胺類(Iincosamides)(例如克林霉素(clindamycin))以及 各種抗生素，氯霉素，利福平(rifampicin)，異煙胼(isoniazid)，乙胺丁醇(ethambutol)， 特拉萬星(telvancin)，替考拉寧(teicoplanin)，奧利萬星(oritavancin)，達巴萬星 (dalbvancin)，甲氧芐啶(trimethoprim) / 磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)，磷霉素 (fosfomycin)，呋喃妥因(nitrofurantoin)和替加環素(tigecycline)以及斯沃(Zyvox)。例如，針對如下的抗生素抗性已知為如下的抗生素類氨基糖苷類(例如卡那霉 素)；碳青霉烯類(例如美羅培南)；頭孢菌素類(例如頭孢吡肟)；糖肽類(例如萬古霉 素)；青霉素類(例如氨芐青霉素、羧芐青霉素和青霉素)；多肽抗生素(例如多粘菌素B)； 喹啉類(例如左氧氟沙星)；磺胺類(例如菌特靈)；四環素類(例如四環素)；以及各種抗 生素，氯霉素、利福平、斯沃和達托霉素。η [圈套]質粒文庫已描述了創建能確定單一順式調節元件功能活性的11[圈套]質粒，我們在此概括 可發現并表征這些序列的方法，包括通過使用η[圈套]質粒文庫的方法，即一種與高通量 篩選相容的方法學。該方法學的總體目標是開發一種新方法以快速鑒定原核和真核基因的順式作用 調節子，在這種情況下創建了能在體內修飾表達的工具。該方法容許剖析大規模調節網絡。 在我們對遺傳調節機制的認識中預期的進展會隨著微陣列轉錄組學分析的突破而并行前 進。該工作以不同于現有技術例如創建基因敲除或插入誘變的方式鑒定了遺傳修飾 基因并確定了途徑。那些方法通常鑒定反式作用調節子(例如轉錄因子)。通過鑒定順式作用因子，該技術巧妙避開了與這些傳統方法相關的問題冗余-由于轉錄調節固有復雜 性所致，意味著可在同一位點上結合多于一個的轉錄因子；極化效應-誘變可影響同一個 轉錄單位中位于突變位點3’的基因表達；高成本和周轉時間-產生并確認單個基因敲除 可能需要數周到數年(取決于物種)，并且進行飽和誘變是一項冗長且昂貴的規程；種特異 性-在此所描述的方法在所有實驗系統中具有潛在效用，預計通用‘誘餌’文庫可應用于定 位大多數物種中的調節。在實施例1中，通過開發一種克隆誘餌序列同聚體以創建高拷貝‘η[圈套]’質粒 的方法，我們證實了對誘餌技術的實質改進，報道了對質粒攜帶法進行的改變。這些質粒易 于導入許多菌種中并通過正選擇保持，巧妙避開了誘餌方法的主要缺陷，即寡核苷酸可能 難以導入細胞中并且對外切核酸酶敏感，從而給出相對短的半衰期。在另一種修改和改進 中，我們創建了由詳述于實施例2中的全基因組的片段或描述于實施例4中的來源于隨機 化寡核苷酸的序列組成的η[圈套]文庫。這些辦法容許全面收集要被并行篩選的調節元 件，其較局限于按序測試規定序列的誘餌用于篩選目的的應用是一種非常強有力的手段。 以下，在實施例3中，利用抗生素產生的調節的報道系統作為模型用于一個示范性的實施 方案中來針對文庫中的正和負調節子進行選擇。圖4是顯示如何構建定制η[圈套]質粒文庫過程的一部分的示意圖。圖5顯示了使用η[圈套]文庫檢測能上調肉桂鏈霉菌抗生素肉桂霉素產生的順 式調節元件的實驗方法。圖6提供了應用η[圈套]以對抗抗生素抗性的更多細節。η[圈套]質粒文庫作為開發工具基因表達以及伴隨的表型效應主要受控于DNA-蛋白相互作用。力圖了解并控制 基因表達通常更強調操縱轉錄機的蛋白組分，即反式作用因子例如轉錄因子，而非它們結 合的DNA序列(順式調節元件)。與反式作用因子相反，靶向順式調節元件具有如下優點 其較對靶定蛋白進行遺傳缺失更易于將寡核苷酸轉染入細胞中；使用寡核苷酸能更適合于 高通量分析；使用順式作用元件巧妙避開了調節網絡冗余的問題，這里通過結合相同順式 調節序列的另一轉錄因子的活性補償了一特定轉錄因子的缺失。然而，誘餌法的潛在瓶頸 在于鑒定候選序列。為了該目的，通過自基因組片段創建文庫并測試以觀察是否所得到的文庫的成員 能施行對通過包含在該片段上的基因合成的產物的控制，從而證實了 η[圈套]載體的效 用。此外，檢測了文庫創建的分子生物學；以證實該文庫是足夠復雜的且具有預期的相同序 列同向重復的分子結構。這些成功之處被進一步開發以創建具有廣泛且通用應用的強有力 篩選方法。因此如上所述，本發明還涉及11[圈套]質粒文庫。根據本發明的方法，該質粒文 庫可用于在原核生物或真核生物中篩選新的順式調節序列和誘餌序列。使用η[圈套]文 庫來篩選容許對多條序列高通量篩選具誘餌功能。文庫中質粒的圈套序列可來源于基因組片段或基因組DNA。因而，該文庫可包含 代表或覆蓋基本上所有基因組片段或基因組序列的圈套序列。該類質粒文庫在此稱為定制 η[圈套]文庫。可選地，文庫中質粒的圈套序列可包含長度“η”個核苷酸的隨機化序列。 因而，該文庫可包含基本上每一條可能的如在此所描述的長度“η”的核苷酸序列。這樣的文庫在此被描述為通用η[圈套]文庫。定制η[圈套]質粒文庫通常，圈套來源于基因組片段或基因組DNA(原核或真核生物的)。例如，原核生物 例如細菌，如鏈霉菌，例如肉桂鏈霉菌、淺青紫鏈霉菌或天藍色鏈霉菌，或者大腸桿菌的基 因組或基因組片段。文庫所來源的基因組或基因組片段可包含編碼特定目標功能或表型例如代謝物 如抗生素(如肉桂霉素、放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素)的產生、對特定溶劑或毒素的耐 受性、對特定抗生素的抗性或任何其他目標功能或表型的一種或更多種基因。圈套可包含 來源于或分離自這樣的基因的啟動子區的序列。與圈套序列相關的合適的基因和功能/表 型業已描述于上。因此，基因組DNA或片段可包含在代謝物產生中起作用的一種或更多種基因，如 在代謝物是抗生素、酶或藥物的情況下，或者在決定抗生素抗性中起作用的一種或更多種 基因，或者在決定溶劑耐受性中起作用的一種或更多種基因。可通過檢測編碼功能或表型的基因的水平轉移入異源細胞，鑒定包含編碼特定功 能或表型的一種或更多種基因的基因組片段。可通過生物信息學分析鑒定包含編碼特定功能或表型的一種或更多種基因的基 因組片段。可選地，其可通過功能篩選這樣的片段的集合而得以鑒定。用于制備定制η[圈套]文庫的方法描述于此。通用文庫在通用文庫中，圈套通常包含長度η個核苷酸的隨機化核苷酸序列。文庫可包含 代表所有或基本上所有長度η個核苷酸序列的排列的圈套。一般而言，η可以是范圍5-50， 例如 10-50，例如 20-40，如 25-35，如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個核苷酸。在這樣的文庫中的單體可額外包含恒定序列。因此，隨機化序列(可變區)可在 一側或兩側側接恒定區。可選地，單體可包含側接可變區的規定的核心序列。核苷酸偏愛 可導入可變區中。例如，在合適的情況下，可變區可包含更高的GC偏愛，如在文庫用于篩選 其中DNA展示高GC偏愛的生物體中順式調節序列的情況下。在一個實例中，圈套包含隨機化的9核苷酸序列(η = 9)。η[圈套]質粒中的單 體可包含SEQ ID NO 7的寡核苷酸序列。用于產生通用η[圈套]文庫的方法描述于此。制備η[圈套]質粒的方法一般而言，如在此所描述的η[圈套]質粒可通過包括如下的方法制備-提供包含一個或更多個拷貝的單體序列的多核苷酸；和-克隆該多核苷酸入合適的質粒載體中。單體的組成如在此關于η[圈套]質粒所描述的。合適的質粒載體也已被描述。包含一個或更多個拷貝的單體序列的多核苷酸可通過包括如下的方法提供(1)提供包含如下的環狀寡核苷酸⑴目標測試序列(圖1中的B)；和(ii)適用于滾環擴增的引物的結合位點(圖1中的A)；其中單體序列包含⑴和(ii)；以及
(2)使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多 核苷酸。該方法的步驟(1)可進一步包含通過PCR擴增滾環擴增產物并分離所需尺寸的多 核苷酸片段，例如，包含30-50個重復的單體序列的片段。這可通過如PAGE分析得以進行。環狀寡核苷酸可通過包括如下的方法制備_提供包含如下的線型單鏈寡核苷酸目標測試序列(i)和適用于滾環擴增的引 物的結合位點(ii)；-通常在通用連接寡核苷酸存在下，如使用Taq連接酶環化該寡核苷酸；-任選地用外切核酸酶消化殘留的線型DNA；和-如使用PAGE回收單體環狀寡核苷酸。適用于滾環擴增的引物是本領域已知的。例如，可使用T7引物。用于進行滾環擴增的方法是本領域已知的。例如，可使用BstI聚合酶。在一個實例中，使用與用于滾環擴增相同的引物如T7引物進行滾環擴增產物的 PCR擴增。一般而言，單體中的測試序列(i)包含如在此所描述的圈套序列。如在此所描述的，圈套序列可分離自基因組DNA，如分離自全基因組，或分離自基 因組片段。圈套序列一旦被分離，就可通過上述方法用于形成η[圈套]質粒。因此，可制 備來源于基因組或基因組片段的η [圈套]質粒文庫(如在此所描述的定制文庫)。一種用于自基因組或基因組片段制備圈套序列的方案圖解于圖4中。通常，一種 方法包括(1)提供雙鏈基因組DNA樣品；(2)片段化基因組DNA;(3)將銜接頭連接到來自(b)的DNA片段的每一末端上，其中每一銜接頭包含(iii)用于固定DNA片段的手段；(iv)在與該識別位點(如下游(3’)的)隔開一段距離切割的第一限制酶的識別 位點；和(ν)第二種酶的識別和切割位點；(4)任選地除去未連接的銜接頭；(5)用第一限制酶消化帶有銜接頭的片段，從而產生兩條銜接片段，其中每條銜接 片段包含(vi)銜接頭；和(vii)包含如下的DNA片段較短的鏈和較長的鏈(如具有3’突出端)，其中較 長的鏈包含圈套序列；(6)固定(5)中產生的銜接片段；(7)變性該片段以提供單鏈片段；(8)通過將互補寡核苷酸連接到銜接頭再建第二限制酶識別位點，并用第二限制 酶消化該銜接片段，從而產生包含如下的銜接頭_圈套片段(viii)銜接頭片段；和(ix)單鏈圈套序列；以及
(9)從固定狀態釋放銜接頭_圈套片段。(8)中產生的銜接頭_圈套片段包含單鏈圈套序列和在用第二限制酶消化后殘留 的銜接頭片段(相應于第二酶識別位點和連接圈套的銜接頭末端之間的銜接頭部分)。最 后的η[圈套]質粒中(和上述測試序列(i))的單體應包含銜接頭-圈套片段。基因組DNA樣品可來源于原核或真核細胞。基因組DNA樣品可包含基因組片段或 全基因組。該樣品可來自于展示特定目標表型如產生特定代謝物、對特定抗生素抗性的細 胞，例如天然株(如病原體)或臨床分離株。例如，該樣品可來自產生肉桂霉素的肉桂鏈霉 菌，來自產生放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素的天藍色鏈霉菌，來自展示對丁醇的耐受性的 大腸桿菌K12，或來自展示對萬古霉素的抗性的屎腸球菌或天藍色鏈霉菌。該樣品可來自細 菌模型，如通過水平基因轉移獲得特定表型或功能的細菌模型。通常，步驟(2)中產生的片段長約500bp，但可在例如IOO-IOOObp范圍內，如 200-900、300-800、400-600bp，如 150、250、350、450、550、650、750、850、950bp。任何合適的
片段化方法皆可用于產生片段。優選地，該方法產生隨機化或無偏愛的片段。例如，可使用
超聲處理。步驟(2)中產生的片段可包含不同類型的末端-例如，平端、或者不同長度的5’或 3’突出端。因此，片段化步驟(k)中產生的片段可被進一步處理以產生一群均一的片段，其 中每條片段都具有相同的3’dNTP突出端一 dA或dT。這可通過如下手段得以實現，例如用 Taq聚合酶和合適dNTP處理以修復片段末端，如有必要，添加3’ dNTP如dA突出端。銜接頭可通過任何合適的手段連接到該片段上。例如，銜接頭可包含與每條片段 的3’dNTP突出端互補的5’dNTP突出端。因此，例如，如果步驟(b)中產生的片段包含3’dA 突出端，則銜接頭可包含5’ dT突出端。在上述所列的方法中，銜接頭包含一種用于固定DNA片段的手段。對于本發明方 法而言，固定不是必需的，但是具有優點在于其降低了實驗背景。銜接頭可包含用于固定片 段的任何合適的手段。例如，銜接頭可包含(通常在遠離DNA片段的末端)一對結合分子 的一個成員，其中配對中的結合分子彼此結合，以及其中配對的另一成員可包含在合適的 固定基質中。例如，配對中的結合分子可以是生物素和鏈霉親合素。可使用生物素化銜接 頭，并且該銜接片段在鏈霉親合素基質上被捕捉。第一限制酶在其識別位點遠處切割。例如，該酶可切割其識別位點的下游(3’)。 其切割的距離決定了圈套序列的長度。對于圈套序列合適的長度描述于此。可被使用的 酶的實例是Mmel。其他實例包括Gsul、BpmI及其同功異源酶(isochizomer)。更多的實 例包括已知為切割它們的識別位點一邊外側的II型限制酶家族成員。在當前描述中，使 用那些在3’側上切割的酶以及優選那些在最大距離處切割的酶，通常15-25nt(評述于 Gene (1991) 100 ； 13-26中)。導入的雙鏈切割的特性并不關鍵，但在于此所描述的方法中使 用了 3’突出端。該方法可適應于使用5’突出端和平端切割。圈套的特性可因此被改變。 例如，如果使用給出具有更長5’突出端的不對稱產物的酶，其應有利于使5’突出端進入圈 套中。還取決于識別位點(其通常是不對稱的)如何放置于銜接頭中，可使用在其識別位 點的5’導入切割的酶。第二限制酶在銜接頭序列中切割。可使用的酶的實例包括Nt. Bbv. Cl。已知其是 一種產生切口的內切核酸酶并在該應用中用作在上鏈(top strand)中導入單鏈切口以容許回收圈套。然而，該方法可適用于大多數通常可獲得的限制酶。可使用的酶的實例包括 那些產生3’或5’突出端或產生平端斷裂的酶。一旦制備，可測試n[圈套]質粒文庫其結構中的偏愛。通常，通過分離質粒，消化 以釋放插入片段，并進一步消化(如用第一限制酶)以分離單體序列來進行這樣的測試。定制η[圈套]質粒文庫的創建描述于本發明的實施例中。在實施例2中，文庫制 備自肉桂鏈霉菌肉桂霉素生物合成基因簇，以及在實施例4中，文庫制備自大腸桿菌Κ12基 因組DNA。本發明涉及如在這些實施例中所制備的文庫。如在此所描述的，圈套序列可包含隨機化核苷酸序列。通常，圈套包含長度“η”個 核苷酸的隨機化(或可變)核苷酸序列。一般而言，η的范圍可以是5-50，例如10-50，例 如 20-40，如 25-35，如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個核苷酸。可制備 其中圈套包含長度η的隨機化序列的質粒文庫。這樣的文庫是一種通用η[圈套]文庫。可使用本領域已知方法合成包含隨機化序列(和任選的如所述的恒定序列)的寡 核苷酸。通常，在制備用于η[圈套]通用文庫的圈套中，制備包含所有或基本上所有可能 的長度η的核苷酸序列的寡核苷酸。可將核苷酸偏愛導入寡核苷酸的隨機化(或可變)區中。例如，如果合適的話，可 導入GC偏愛。上述方法中的單體或目標測試序列(圖1中的B)可包含這樣制備的寡核苷酸。 η[圈套]質粒可因而如所描述的進行制備。實施例4描述了制備其中η = 9的通用η[圈套]文庫。本發明涉及根據實施例 4中的方法制備的文庫。在一方面，本發明涉及一種包含單體和/或圈套的η[圈套]質粒，該單體和/或 圈套包含在此所描述的和/或根據在此所描述的方法鑒定的順式調節序列或誘餌序列，包 括任何在此所描述的和/或根據包括實施例的在此方法所制備的η[圈套]質粒或質粒文庫。宿主細胞本發明還涉及包含如在此所描述的η[圈套]質粒或質粒文庫的一種或多種宿主 細胞。本發明進一步涉及包含如在此所描述的誘餌多核苷酸(誘餌分子)的一種或多種宿 主細胞。特別是，本發明涉及這樣的宿主細胞，由于質粒或誘餌多核苷酸的存在，其顯示改 變的基因表達和/或表型，如與不存在該質粒/誘餌分子的細胞相比，增加的代謝物或發酵 產物如抗生素或酶的產生、增加的對溶劑的耐受性、增加的對一種或更多種抗生素的敏感 性。通常，通過合適的手段例如轉化、轉染或接合將質粒或質粒文庫或多核苷酸導入 細胞中。用于本發明方法的宿主細胞可以是原核或真核的。例如，可使用原核生物如 細菌細胞。宿主可以是例如放線菌類例如鏈霉菌物種，如天藍色鏈霉菌，例如天藍色鏈 霉菌A3 (2)、(Μ145或Μ600株)，淺青紫鏈霉菌，肉桂鏈霉菌或大腸桿菌。其他實例可包 括其他革蘭氏陽性細菌菌種，例如那些來自放線菌群(Actinobacteria)的菌種，例如來 自分枝桿菌屬(Mycobacterium)的細菌，例如致病細菌結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis)、非洲分枝桿菌(M. africanum)和田鼠分枝桿菌(Mmicroti)；麻風分枝桿菌(M. 1印rae)。革蘭氏陽性細菌屬的進一步的實例 是梭菌屬(Clostridium)，其包括致病細菌例如艱難梭菌(Clostridium difficile) (人病原體)、肉毒梭菌(C.botulinum)、產氣莢膜梭菌(C. perfingens)和破傷風梭菌 (C. tetani)，以及潛在工業用途的細菌例如丙酮丁醇梭菌(C. acetylbutylictum)、熱解纖 維梭菌(C. thermocellum)和揚氏梭菌(C. Ijungdahlii)。其他革蘭氏陽性細菌屬可包 括芽孢桿菌屬(Bacillus)、李斯特氏菌屬(Listeria)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、 梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus) 和腸球菌屬(Enterococcus)。宿主細胞還可以是革蘭氏陰性細菌，其包括腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)的屬，包括人病原體，例如沙門氏菌(Salmonella)和大腸桿菌 (Escherichia coli)。革蘭氏陰性細菌屬的其他實例可包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、 鮑特氏菌屬(Bordetella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布魯氏菌屬(Brucella)、彎曲桿菌 屬(Campylobacter)、胃 _ 胃 ft 胃 M (Francisella)、口f in 胃 M (Haemophillus)、胃 雷伯氏菌屬(Klebsiella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、變形桿菌屬(Proteobacteria)、 立克次體屬(Rickettsia)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersina)、莫拉氏菌屬 (Moraxella)、螺桿菌屬(Helicobacter)、寡養單細胞屬(Stenotrophomonas)、蛭弧菌屬 (Bdellovibrio)、醋酸細菌(acetic acidbacteria)、軍團菌屬(Legionella)、藍細菌屬 (cyanobacteria)、電累體屬(spirochaetes)、綠色細菌禾口綠色無lit 細菌(green sulfur and green non-sulfurbacteria)以及許多其他屬。重要的革蘭氏陰性病原體包括引 起性傳播疾病(淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae))、腦膜炎(腦膜炎奈瑟氏菌 (Neisseriameningitidis))和呼吸癥狀(卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))的球 菌菌種。其他醫學相關的革蘭氏陰性細菌包括多種菌種。它們中的某些主要引起呼吸問題 (流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜 月市軍團菌(Legionella pneumophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),主要弓| 起泌尿問題(大腸桿菌、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、粘質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)),以及主要引起腸胃問題(幽門螺 桿菌(Helicobacterpylori)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、傷寒沙門氏菌 (Salmonellatyphi))。宿主細胞還可包括真核生物例如酵母(其實例可包括那些用于工 業生產的酵母例如酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))、裂殖酵母屬 (Schizosacharromyces)(栗酒裂殖酵母(S. pombe))禾口甲醇酵母(methyltrophic yeast) 畢赤酵母屬(Pichia)[例如巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)]和假絲酵母屬(Candida), 以及多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)；致病酵母例如假絲酵母屬[例如白色假 絲酵母(C. albicans)和熱帶假絲酵母(C. tropicalis)]，以及隱球菌屬(Cryptococci) [例如新型隱球菌(C.neoformans)]，真菌(其可包括致病性真菌例如假絲酵母屬、曲 霉屬(Aspergillus)[例如煙曲霉(A. fumigatus)和黃曲霉(A. flavus)]、隱球酵母屬 (Crptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)[例如莢膜組織胞漿菌(H. capsulatum)]、肺 囊蟲屬(Pneumocystis)[例如耶氏肺囊蟲(P. jirovecii)]和葡萄穗霉屬(Stachybotyrus) [例如S. chartarum]；用于工業生產的真菌例如曲霉屬(Aspergi 1 Ius)[特別是黑曲 霉(A.niger)和米曲霉(A. oryzae)])和鏈孢霉屬(Neurospora)的成員，如粗糙鏈孢霉 (N. crassa)，植物細胞和哺乳動物細胞，禽類細胞，或是處于細胞培養物中或是組織的一部分。一般而言，宿主細胞與質粒載體相容。例如，細胞與質粒復制起點相容。該細胞通 常是一種其中質粒可穩定保持并復制的細胞。宿主細胞還通常與質粒中任何可檢測的標記 基因相容，使得該基因能在細胞中表達，并且從而能對質粒成功導入并保持的細胞進行篩 選。宿主細胞可簡單地被預期用于質粒或多核苷酸的操作。優選地，這樣的菌株是一 種能在實驗室條件下容易地操作并保持的實驗室菌株，如大腸桿菌。可選地或另外地，宿主細胞可使用根據本發明的n[圈套]質粒文庫來篩選順式調 節序列，和/或使用如在此所描述的n[圈套]質粒來測試推定順式調節序列的誘餌功能。 宿主細胞還可以是一種其中期望使用如在此所描述的n[圈套]質粒或其他誘餌分子改變 基因表達的宿主細胞。一般而言，宿主細胞包含目標順式調節序列，即被篩選的或導入細胞中的誘餌序 列意在競爭的順式調節序列。通常，在細胞中的順式調節序列可操作地連接一種或更多種 基因，該一種或更多種基因的表達可被直接或間接檢測。通常，細胞包含可操作地連接基因 的含有順式調節序列的啟動子。可操作地連接意思是順式調節序列和/或啟動子以這樣一 種方式連接一種或更多種基因，使得該序列和/或啟動子能發揮(在合適的條件下，如在必 需轉錄因子的存在下)調節基因表達的功能。因此，當結合關連轉錄因子時，該順式調節序 列發揮調節(抑制或激活)一種或更多種基因的表達的功能。啟動子可以是例如調節編碼 目標表型的基因(例如在此描述的任一基因或表型)的一種啟動子。可通過監測所連接基因的表達確定順式調節序列在細胞中的功能。這可通過直接 監測基因表達或通過監測與基因表達相關的特定表型表達來進行。例如，對功能的篩選可 包含對給定代謝物或發酵產物，如抗生素例如肉桂霉素、放線菌紫素和/或十一烷基靈菌 紅素的產生的篩選；對針對特定抗生素如萬古霉素的抗性的篩選；或對針對溶劑例如丁醇 的耐受性的篩選。用于篩選的方法描述在此。在一方面，質粒引起宿主細胞基因表達和/或表型改變，如增加抗生素合成，減少 抗生素抗性，或增加細胞中溶劑耐受性。宿主細胞可包含可操作地連接其天然(關連)基因的順式調節序列(如包含該序 列的啟動子)，即連接至在其天然存在下該序列(或啟動子)調節其表達的一種或更多種 基因。因此，例如在目標順式調節序列(或其天然啟動子)調節編碼代謝物(如抗生素或 酶)產生的基因的情況下，宿主細胞可包含天然生產細胞。在目標順式調節序列(或其天 然啟動子)調節編碼抗生素抗性的一種或更多種基因的情況下，宿主細胞可包含天然的抗 生素抗性株，如病原體或臨床分離株。因此，細胞中的順式調節序列可以可操作地連接一種 或更多種基因，該一種或更多種基因的表達受處于其天然環境中的序列調節。例如，如本發明實施例中所描述的，天藍色鏈霉菌是放線菌紫素和十一烷基靈菌 紅素的一種天然生產者。業已報道這些抗生素的產生需要AsfR蛋白結合asfS基因上游的 結合位點。當對包含AsfR結合位點的序列的存在篩選圈套時(或當導入與這樣的序列競 爭的誘餌序列時)，天藍色鏈霉菌因此可用作宿主細胞。與天然細胞的AsfR結合位點競爭 會導致減少的抗生素產生。還如實施例中所描述的，肉桂鏈霉菌產生肉桂霉素抗生素。肉桂鏈霉菌可用作宿主以針對肉桂鏈霉菌肉桂霉素生物合成簇中基因的啟動子中順式調節序列的存在(或當 導入與這樣的序列競爭的誘餌時)篩選圈套。如在此所描述的通過監測轉化株中肉桂霉素 的產生，可針對與天然順式調節序列的競爭進行篩選。同樣如所描述的，大腸桿菌K12包含編碼丁醇耐受性的基因。大腸桿菌K12細胞 可用于針對編碼耐受性的基因的啟動子中順式調節序列的存在(或當使用與這樣的序列 競爭的誘餌時)篩選圈套。通過在不同濃度的丁醇存在下測定細胞生存力，可針對轉化細 胞中競爭序列的存在進行檢定。可選地，宿主細胞可包含給定細胞表型如代謝物產生或抗生素抗性的模型，如細 菌模型。這樣的模型包含可操作地連接天然基因但處于異源細胞中的目標順式調節序列 (如包含該序列的啟動子)。換言之，順式調節序列(及其天然啟動子)和可操作地連接的 基因并非內源地出現在細胞中。通常，模型宿主細胞包含較天然菌株在實驗室條件下更容易操作的細菌菌種或菌 株，如非致病的或對基因轉移更易感的細菌菌種或菌株。一般而言，在于此所描述的n[圈 套]質粒或誘餌分子不存在下，基因表達受順式調節序列(如在其啟動子中的)調節。因 此，細胞包含對于順式調節序列以正常方式起作用所必需的成分，如結合該序列并抑制或 激活基因表達的轉錄因子。模式宿主細胞可包含已被導入該細胞中的攜帶順式調節序列和基因的質粒，或者 該順式調節序列和基因可整合入宿主基因組中。模式宿主可包含含有順式調節序列和基因 的基因組片段，其中該片段已獲得自天然細胞，如通過水平轉移。模式細胞可具有獲得的賦予給定目標表型的基因，所述目標表型如代謝物產生、 抗生素產生、抗生素抗性、溶劑耐受性，例如，模式菌株可通過編碼表型如抗生素產生和/ 或抗生素抗性的基因水平轉移獲得特定表型。這樣的模式菌株無須該編碼基因的先驗知識 就能制備。其通過將來自天然菌株(展示目標表型)的DNA水平轉移至模式菌株并通過對 表型獲得進行篩選而得以進行。在細胞要成為定制η [圈套]文庫宿主的情況下，該細胞可例如包含來自該文庫所 來源的基因組DNA或基因組片段(內源或通過基因獲得)。合適的宿主細胞是本領域已知的并描述于本文的實施例中。例如，實施例6描述 了天藍色鏈霉菌Μ600株，其是一種萬古霉素抗性細菌模型。報道細胞宿主細胞可包含可操作地連接基因的目標順式調節序列(或包含該順式調節序 列的目標啟動子)，該基因的表達在其天然環境中不受該序列或啟動子調節(非天然基 因)。這樣的基因稱為報道基因。通常，報道基因可操作地連接包含目標順式調節序列的啟 動子序列。可通過測定報道基因的表達從而測定順式調節序列的功能。通常，報道基因是一 種其表達可容易地被檢測并篩選到的基因。例如，報道基因可編碼熒光化合物或抗生素抗 性。報道基因的實例是螢光素酶或編碼卡那霉素抗性的neo基因。在順式調節序列(或啟 動子)天然控制具有不容易評價的表型的基因表達的情況下，這樣的報道細胞是特別有用 的。在一個實施方案中，報道基因受轉錄因子(轉錄阻抑物)與目標順式調節序列結合的負調節。這樣的宿主細胞適用于篩選負調節(阻抑)它們的關連基因表達的順式調節 序列。在一個可選實施方案中，報道基因受轉錄因子(轉錄激活物)與順式調節序列結合 的正調節。這樣的宿主細胞有用于篩選正調節它們的關連基因表達的順式調節序列。任何合適的宿主株都可用于該報道系統中。合適的菌株是本領域已知的并描述于 此。適當時，選擇不包含報道基因的基因組拷貝的菌株。類似地，報道菌株可通過在導入真 實報道基因之前從基因組中靶向缺失用作報道基因的基因而被工程化。報道基因和順式調節序列(如在啟動子中)可以是質粒攜帶的。可選地，報道基 因和順式調節序列(或啟動子)可整合入宿主基因組中。例如，報道系統可于整合質粒如 PSET152之上被導入宿主中。在該系統是質粒攜帶的情況下，質粒通常包含容許在宿主細胞 中對質粒正選擇的可檢測的標記基因。例如，可檢測的標記基因可編碼抗生素抗性，如編碼 對安普霉素的抗性的aac基因。本發明人已經開發出一種通用報道細胞系統，其可用于篩選例如在于此所描述的 n[圈套]質粒文庫或n[圈套]質粒中順式調節序列的存在。該篩選細胞和方法容許在細 胞生存力基礎上篩選順式調節序列的存在。對于在合適的培養條件下細胞生存力或生存而 言，報道基因的表達是決定性的。在測定條件下，宿主細胞只有在與目標順式調節序列(如 在目標啟動子中)競爭轉錄因子結合的序列已被導入細胞中的時候存活。該系統稱為“死 或活”蹄選系統。該系統可以是自動化系統，并具有下列優點即其能用于篩選在液體培養基 中培養的細胞。當目標順式調節序列起作用抑制可操作地連接的基因表達時，報道基因通常編碼 在合適的培養條件下對于細胞存活必需的產物。例如，報道基因可編碼抗生素抗性，使得當 宿主細胞在該抗生素存在下培養時，僅在抑制轉錄因子與連接該報道基因的順式調節序列 結合并容許報道抗生素基因表達的競爭序列存在的情況下有可能細胞存活。合適的抗生素 抗性基因包括例如卡那霉素抗性基因neo。其容許檢測被轉錄阻抑物結合的順式調節序列。 其他合適的基因是本領域已知的。在該情況下，宿主細胞通常包含其他順式調節序列起作用所必需的成分。該細胞 通常包含(如表達)對于與順式調節序列結合所必需的轉錄因子。宿主細胞可早已包含順 式調節序列，如包含該順式調節序列的啟動子。宿主細胞可包含該目標順式調節序列所來 源的基因組片段。當順式調節序列起作用激活可操作地連接的基因的表達時，報道基因編碼在合適 的培養條件下其對于細胞是致死的產物。這樣的基因通常稱為自殺報道基因。細胞僅在抑 制或阻止轉錄因子結合連接報道基因的順式調節序列的競爭序列存在下存活(在合適的 培養條件下)。自殺報道基因的一個實例是例如葡萄糖激酶基因(glkA)。該基因將代謝物 (2脫氧葡萄糖(DOG))轉變為毒素。因此，當在DOG存在下培養時，glkA基因的表達對細胞 是致死的。這容許檢測被轉錄激活物結合的順式調節序列。其他合適的基因是本領域已知 的。通常，在該系統中宿主并不另外表達報道基因，但是包含順式調節序列起作用所 必需的成分。該細胞通常包含如表達與順式調節序列結合所必需的轉錄因子。在這樣的系 統中，在順式調節序列處的任何活性應歸因于來源于宿主細胞基因組的正轉錄因子(激活 物)。通過在該背景中搜尋，有可能從宿主染色體中發現異源表達的正調節子。通過滴定這些激活物離開連接報道基因并結合誘餌序列如n[圈套]質粒，阻止了報道基因如glkA的 表達，并且細胞存活，甚至當在DOG代謝物存在下生長時。該死或活報道系統可適用于任何合適的順式調節序列，例如那些在此描述和/或 鑒定的任一順式調節序列。例如，如實施例3中所描述的，可使用來源于肉桂鏈霉菌中肉桂 霉素生物合成簇的cin7啟動子。如實施例中所描述的，cin7啟動子能可操作地連接編碼 卡那霉素抗性的neo基因。其可包含于整合質粒例如在實施例中使用的PSET152骨架中。 質粒還攜帶合適的標記基因(編碼安普霉素抗性的aac基因)。可將質粒導入或整合入額 外攜帶肉桂霉素生物合成途徑的淺青紫鏈霉菌宿主株(1326)中。這樣的報道細胞適合于 篩選例如來源于包含如在此所描述的肉桂霉素生物合成簇的肉桂鏈霉菌基因組或基因組 片段的η[圈套]質粒文庫。可選地，cin7啟動子能可操作地連接glkA報道基因，以及以相同的方式整合入 整合質粒中。在這種情況下，合適的宿主株應當是缺少肉桂霉素生物合成簇和而且還缺少 glkA基因的淺青紫鏈霉菌TK24株。在一方面，本發明涉及根據本發明實施例描述并制備的報道細胞。鑒定和表征順 式調節序列的方法使用本發明n[圈套]質粒的原理闡明于圖2中。如果質粒中的圈套序列包含轉 錄因子結合位點，該轉錄因子結合位點含有該質粒被導入的細胞中的順式調節序列和/或 與之競爭轉錄因子結合，則其可作為受該細胞中的順式調節序列調節的基因表達的改變而 被檢測。因此，η[圈套]質粒可用于鑒定順式調節和誘餌序列。質粒還可與包含已知誘餌 序列的圈套一起使用以破壞細胞中基因表達。因此，對于多種不同的目的，本發明的η[圈套]質粒可以多個使用。如上，使用定 制η[圈套]文庫，η[圈套]質粒文庫可用于對如在基因組DNA片段中的推定的順式調節 序列進行篩選。η[圈套]質粒可用于對特定序列測試誘餌功能。在任一這些方法中，如果 η[圈套]質粒中的圈套能從宿主中存在的順式調節序列中滴定掉轉錄因子(如通過基因表 達或宿主細胞表型改變所確定的)，則圈套序列被鑒定為包含順式調節序列或與順式調節 序列競爭轉錄因子結合的序列。因此，使用該方法鑒定的序列還可用作誘餌序列，以及在一 方面，該方法可被認為是鑒定誘餌序列和分子的方法。包含誘餌序列的η[圈套]質粒可用 于調控宿主細胞中基因表達和/或表型。因此，在一方面本發明提供了用于鑒定和/或表征順式調節和誘餌序列的方法。 一般而言，這樣的方法包括1.提供如在此所描述的η [圈套]質粒或η[圈套]質粒文庫；2.將該η[圈套]質粒或質粒文庫導入宿主細胞中，其中該宿主細胞包含可操作地 連接一種或更多種基因的目標順式調節序列，該一種或更多種基因的表達可直接或間接測 定；和3.在11[圈套]質粒或質粒文庫存在和不存在下，測定該一種基因(或多種基因) 的表達或表型改變。用于該方法中的η[圈套]質粒或η[圈套]質粒文庫可以是如在此所描述的。每 個質粒中的圈套都包含要被測試競爭功能的序列。一般而言，宿主細胞包含可操作地連接一種或更多種基因的目標順式調節元件(如包含順式調節元件的啟動子)，所述基因的表達可直接或間接監測或測定。例如，可通 過測定特定的一種或更多種基因的表達或通過監測所述一種或更多種基因編碼的特定表 型來監測該表達。在此已描述了適用于本發明方法的宿主細胞并包括，例如天然株、臨床分離株、實 驗室模型和報道細胞。可使用在此描述的“死或活”報道篩選系統。在本文的實施例1和2中，證實了誘餌-寡核苷酸法可適用于質粒形式，包括證實 了使用文庫來鑒定規定序列的順式調節子是可行的。該基于η[圈套]文庫的方法的反復 操作的一個可能的局限在于其可能不被最優化適合于錯綜或復雜表型改變的調節子。在多 數情況下，表型改變可能不是容易可檢測的，并且可能需要復雜的打分系統，例如通過層析 分析定量代謝物產生。在表型打分標準化的情況下，這對于創建報道系統而言應當是明顯 的優勢，使得η[圈套]文庫篩選得以加速，以至其能以高通量實施。實施例2中采用的方法，即針對表型改變篩選所有文庫成員的一個可能的技術局 限是需要實際鋪板或培養全文庫的所有成員，因此留下了一個對可篩選多少的集落以及如 此可調查的DNA的量的實踐上的限制。調查會產生具有> 100 000個成員的文庫的基因組 大片段(其相當于大約25kb序列)并不可行。如下所述，在本發明人開發的系統中所使用 的兩種報道基因都賦予了具有包含候選順式調節元件的η[圈套]質粒的細胞以生存力。因 此，簡單地通過讓大多數不包含候選質粒的細胞死亡，通過生存力選擇容許在液體培養物 中快速富集候選序列。因此，本發明人已通過開發基于通用報道基因的測試系統，使在此描述的η[圈 套]文庫法適用于解決這些問題。在這種反復操作中，負和正調節子通過它們對編碼抗生 素抗性(圖7)或如圖8中所示的代謝物敏感性(自殺報道基因)的報道基因的作用而得 以檢測。將靶啟動子導入報道基因盒(reportercassettes)中以容許檢測負調節(轉錄阻 抑物)或正調節(轉錄激活物)。該方法解決了需要可評價的表型的問題，由于在正常的情 況下每個報道基因都會導致細胞死亡，因此只有當來自該文庫的η [圈套]質粒通過滴定掉 轉錄因子來解除該細胞死亡，才使得細胞能生長。因此，對兩種報道基因的選擇都依賴于細 胞存活，其大大加速了篩選進程。該系統的另一個特征是這樣的死或活篩選能容易地自動 化進行，從而作為快速、綜合性或高通量篩選的基礎。還有可能鑒定控制在它們的天然環境 中不具有易于可評價的表型的啟動子的調節序列。通過任何合適的手段在本發明方法中將質粒或質粒文庫導入宿主細胞。該合適的 手段是本領域已知的。如果η[圈套]質粒是接合的，則該質粒可通過接合導入。還可使用 其他手段例如轉染/轉化。通常，之后如在此所描述的通過選擇質粒上可檢測的標記基因如抗生素抗性基因 的表達，對宿主細胞監測質粒的穩定增殖。在選擇表達特定標記的細胞的條件下，如在抗生 素存在的情況下培養細胞。優選地，該方法包括使用一種或更多種合適的對照。例如，這樣的對照包括未用質 粒處理的宿主細胞、已導入空質粒載體的宿主細胞和已導入包含打亂順序的推定的順式調 節序列的11[圈套]質粒的宿主細胞。一旦將質粒導入細胞中，就針對可操作地連接目標順式調節序列(或啟動子)的 一種或更多種基因的表達篩選細胞。將在圈套序列(在η[圈套]質粒中)存在下的表達與該圈套不存在下的表達相比。產生測試基因表達改變(如細胞表型改變)的克隆被選作 可能包含順式調節序列。分離來自這些克隆的DNA，并分離推定的順式調節序列(或誘餌序 列)。可通過任何合適的方法進行對基因表達改變的篩選。篩選可包含檢測或測量基因 的表達產物，如通過分析基因產物的功能，或可包含測定與基因表達相關的宿主細胞表型 的改變。例如，可通過測定給定代謝物的表達，如該代謝物的量(或存在或不存在)或代謝 物的功能，監測編碼代謝物如抗生素產生的基因表達的改變。例如，放線菌紫素和十一烷基靈菌紅素是有色抗生素。放線菌紫素是藍色的以及 十一烷基靈菌紅素是紅色的。因此，這些抗生素的表達可容易地通過比色技術進行監測。可通過使用指示細菌菌株和合適的平板測定法監測某些代謝物或抗生素的產生。 例如，可通過使用指示菌株枯草芽孢桿菌以及合適的培養基如固體R2YE瓊脂的平板測定 法檢測肉桂霉素的產生。細胞通常在已接種指示菌株的瓊脂平板上培養。通過反應程度例 如殺死指示菌株，如通過瓊脂平板上暈圈的直徑，測定抗生素的表達。抗生素抗性基因或表型如萬古霉素抗性、卡那霉素抗性的表達可通過在抗生素存 在下培養宿主細胞并測定對抗生素的敏感性而得以測定。通常，還在抗生素不存在下培養 細胞作為對照。類似地，編碼溶劑耐受性如丁醇耐受性的基因可通過在溶劑存在下培養細胞而得 以監測(還通常在溶劑不存在下培養細胞作為對照)。在某些情況下，對相關基因表達的篩選包含在合適的培養條件下測定宿主細胞生 存力。例如，當一種或更多種基因編碼抗生素抗性時，篩選可包含在抗生素存在下培養細胞 并測定細胞是否存活。在包含“死或活”報道宿主細胞的篩選中，在給定的培養條件下，細 胞只有在導入細胞中的11[圈套]質粒包含能與目標順式調節序列競爭的序列時才能存活 的。因此，篩選細胞包含了在其中報道基因(可操作地連接目標順式調節序列的基因)的 表達對宿主細胞生存力起決定作用條件下培養細胞，并分離活細胞。本發明方法可包含在如在此所描述的液體培養基中培養宿主細胞，例如如果待測 定的細胞表型是細胞生存力的話。其可具有如下優勢，即僅少量細胞留待分析。篩選可包含使用在此所述的DNA扣除技術。在相關基因表達影響細胞生存力(在 合適的培養條件下)的情況下，其可能是特別有用的。通常，DNA扣除步驟包含從具有給定表型的細胞和不具有該表型的細胞中扣除一 群 DNA。例如，在某些情況下，導入包含競爭順式調節序列的序列會導致宿主細胞變得在 合適的培養條件下不能生存。這可能是這樣的情況，即如果例如目標順式調節序列激活抗 生素抗性基因表達或抑制致死基因(在特定培養條件下表達產物致死)表達。當競爭順式 調節序列被導入細胞中時，如處于n[圈套]質粒的圈套中，該競爭序列滴定轉錄因子并導 致抗生素抗性基因表達減少或致死基因表達。通常(a)在其中具有順式調節序列破壞表達的細胞無法存活的條件下；和(b)在 其中細胞會存活的條件下培養轉化細胞。從這兩種培養物中分離DNA群(通常在導入DNA 如η [圈套]質粒或質粒插入片段的分離和/或擴增后)，并進行扣除(如通過雜交)。則有可能測定培養物(a)中細胞缺少并包含可能的競爭順式調節序列的DNA。例如，如果研究中的表型是抗生素抗性，則導入宿主細胞中的目標順式調節序列， 如處于n[圈套]質粒的圈套中的目標順式調節序列，可恢復對抗生素的抗性。(a)在抗生 素存在下；和(b)在抗生素不存在下培養轉化細胞。在抗生素存在下，包含目標順式調節序 列的細胞會死亡。從兩種培養物中分離DNA，并例如通過PCR擴增分離包含圈套序列的核 酸。通過扣除圈套序列群，有可能分離那些抗生素處理的樣品缺少的。在一方面，富集的圈套序列群可然后再克隆并重復選擇過程。一旦已分離展示改變基因表達或表型的細胞，則分離來自這些細胞的DNA。通常， 分離被導入細胞中的DNA，如η[圈套]質粒DNA和/或質粒插入片段。然后可測定導致改 變的表達并包含可能的順式調節(或誘餌)序列的圈套。這可通過例如PCR擴增得以進行。當本發明的方法包含使用η[圈套]質粒文庫時，該方法可額外包含一個或更多個 進一步的步驟。 例如，該方法可包含文庫雜交步驟。由于這些富集分選操作中使用的文庫的復雜 性，罕有完全由期望序列組成的樣品產生。一般而言，在富集的樣品中存在的假陰性背景需 舍棄并不轉入進一步分析。文庫雜交策略被設計成能通過檢測為篩選過程的所有獨立重復 所共有的11[圈套]質粒，從而做這樣的工作，邏輯性在于如果在上述背景存在下于獨立重 復中檢測到攜帶相同序列的質粒，則那些質粒應當是轉入進一步分析的質粒。圖9中給出 了該方法的概要。通常，當使用文庫雜交策略時，進行χ次獨立重復的上述篩選方法(包括步驟(1)、 (2)和⑶)。例如，χ可以是2、3、4、5、6、7或8。在每次重復中，如所描述的選擇產生基因表達/表型改變的克隆。自克隆分離質 粒DNA并標記以創建合并的探針樣品(P)。例如，可通過隨機引發PCR標記質粒DNA，如使 用本發明實施例中的DIG-標記的dUTP分子。還將克隆以容許各集落相區分的濃度置于合適的培養基上。通常，在該階段，采集 每個集落的樣品并進一步培養以提供質粒DNA源，如果在稍后階段需要的話。從每個集落中提取總DNA并例如通過雜交固定在合適的基質如尼龍膜上。將來自 每個集落的DNA放在基質上可編址位置處。然后將每一基質分別與每一探針組雜交。通常 選擇共有多于一個重復的樣品用于進一步分析。因此，例如如果χ = 4，則制備4個探針組和4個基質如4張尼龍膜。將這4個探 針組P1、P2、P3和P4的每一個與4張濾膜F1、F2、F3和F4的每一張雜交。Pl與Fl的雜交 產生了每個樣品均得到檢測的色譜圖。與Pl雜交的F2、F3或F4樣品應是用于進一步分析 的潛在候選物。集落雜交的探針樣品越多，則該克隆就越可能作為候選物。自雜交(如Pl與Fl)還可用于檢測篩選中假陽性。本發明的方法可進一步包括重復選擇過程一次或更多次，使得選擇得以反復。因 此，選自第一次篩選的克隆可用于再次轉化宿主細胞并重復篩選。在此所描述的n[圈套]文庫法可用于鑒定具有重要醫學結果的影響細菌表型的 順式調節序列，這樣的重要醫學結果的一個實例是阻止感染人的致病細菌中抗生素抗性機 制的誘導(圖6)。該圖中的示意圖顯示當不知道關于該機制遺傳途徑的情況時，n[圈套] 質粒文庫如何用于鑒定控制抗生素抗性的順式調節序列。在該實例中，通過水平基因轉移將賦予抗生素抗性的基因遷移至便利的細菌宿主例如天藍色鏈霉菌或大腸桿菌中，以創建 便利的細菌模型。這無需通過針對抗生素抗性獲取篩選何種基因的先驗知識就可做到。類 似的機制會將相同的抗性基因遷移至臨床檢測到的致病菌株中。η[圈套]質粒文庫創建自 攜帶抗性基因的基因組片段、天然抗性株或臨床分離株的全基因組、或來自隨機寡核苷酸 以創建可想象地包含每條可能的順式調節序列的通用文庫。將這樣的文庫導入細菌模型中 并針對增加的對靶定抗生素的敏感性篩選轉化體。這通過表型直接打分或通過使用已建立 的DNA-扣除技術來完成。取決于系統的復雜性，該過程單次或反復進行以鑒定單一順式調 節序列或這樣的序列的混合物，然后用于合成或制備相應的TFD。接著，于進入合適的動物 模型例如小鼠模型之前，在抗性株或臨床分離株上驗證這些TFD，這里通過處理感染對僅用 抗生素處理具抗性的致病菌株的動物測試誘餌的有效性。如上所述，基因組生物學、基因表達樣式以及復制時機主要受控于DNA-蛋白相互 作用，并且定位這些相互作用可能是試圖控制基因的先決條件。微陣列分析可產生全基因 組概觀以鑒定哪些基因被表達，但迄今未有在類似規模上鑒定決定表達樣式的蛋白(反式 調節子)和它們的關連結合位點(順式調節元件)的技術。本文實施例4和這里描述的本 發明的實施方案解決了該不足并開發了我們現在的技術以形成一種能快速鑒定整個基因 組中順式調節元件以描繪遺傳網絡并主張對它們的控制的通用工具。根據本發明該方面的 方法，鑒定了整個基因組中控制靶定基因表達的調節元件。作為快速且通用的描繪調節網 絡的系統，該工具具有產生黃金標準數據以支持驅向系統生物學的潛力，以及在界定基于 知識的遺傳工程的區域及加速病因遺傳變異的定位中的效用。在某些情況下，存在支撐靶定表型的遺傳機制先驗知識，如肉桂霉素簇中已知的 啟動子。更普遍的是，知道很少關于遺傳網絡以及支撐靶定表型的它們的調節的信息。例 如，在臨床出現的病原感染中的許多抗生素抗性機制在遺傳水平上未被了解，該事實成為 了開發解決該問題的處理方案的嚴重障礙。同樣地，在工業生物技術范圍內，能有利地改變 細菌復雜特性而無需遺傳決定子先驗知識的技術應當是有價值的。該技術的一個實例是在 生物燃料生產過程中工程化細菌為溶劑耐受的以改善其在發酵糖類中的效率。在此給出了 本發明技術臨床和工業應用的實例。為證實該方法在無遺傳途徑先驗知識下檢測順式調節元件的功效，本發明人使用 η[圈套]文庫來增加大腸桿菌中的丁醇耐受性(實施例4)。文庫之一是使用如實施例2 中所描述的類似技術來源于大腸桿菌全基因組的。另一種文庫是可想象地由每種可能的9 個核苷酸序列或任何這樣的期望長度的同向(direct)拷貝組成的‘通用n[圈套]’文庫。 使用類似于實施例2中所描述的方法制備通用η[圈套]文庫用于創建單AfsR η[圈套] 質粒，例外的是取代所具有的含帶有規定順式調節序列的中心區段的寡核苷酸序列，改為 插入隨機序列(以及在該階段，序列長度可控)。在通過測量針對增加濃度的溶劑的生存力 給靶定表型打分的意義上，使用這樣的η [圈套]文庫來檢測丁醇耐受性的新順式調節子的 方法類似于實施例3中所描述的。通過針對與一種或更多種轉錄因子的結合直接篩選文庫，如在此所描述的和/或 根據本文方法制備的η[圈套]質粒文庫還可用于鑒定順式調節序列。本發明鑒定并表征順式調節元件的方法可進一步包括使用定位法，該方法使用了 如在此所描述的足跡法和外切核酸酶的組合。
定位順式調節序列邊界的方法在一方面，本發明提供了一種定位DNA中蛋白結合位點的邊界的方法。該方法可 用于更精確地定位上述結合位點的邊界。該方法可用于定位順式調節序列的邊界。該方法可與在此描述用于鑒定并表征順 式調節序列的方法如使用如在此所描述的n[圈套]質粒或質粒文庫的方法相結合。通過 提供更精確的關于順式調節元件以及因此的蛋白調節子例如轉錄因子結合位點的序列信 息，該方法對于設計誘餌寡核苷酸是有用的，當該誘餌寡核苷酸被導入合適的細胞中時，會 與細胞中的順式調節序列競爭蛋白調節子結合。本發明的方法在改良的足跡法中使用了具有非特異性DNA切口能力的酶或化學 試劑(如DNA酶I)與5，-3，外切核酸酶(如T7外切核酸酶)的組合。DNA酶I的代用品 應包括用高錳酸鉀或羥化物類產生的自由基對細胞的處理。可被使用的合適的外切核酸酶 的另一個實例應是λ外切核酸酶。該方案被設計成能定位每條DNA鏈上的蛋白-DNA復合 物的5’邊界，并因此限定了復合物中包含順式調節元件的受保護的DNA區。DNA酶I將切 口導入復合物周圍的DNA中。這些用作5’ -3’外切核酸酶的5’ -3’外切核酸酶活性底物。 這兩種酶的聯合作用標定了每條DNA鏈上蛋白-DNA復合物的5’邊界。因此，本發明的方 法具有如下優點，即其能檢測給定區域如啟動子區中DNA-蛋白復合物的所有邊界，而不僅 僅是那些最接近限制性位點的邊界。本發明定位方法的原理圖解于圖13中。該方法通常包括1.提供蛋白-DNA復合物；2.使用如下的進行消化a.具有非特異性DNA切口能力的酶，如DNA酶I ；b. 5’ -3’外切核酸酶(T7外切核酸酶)；c.任選地，切割DNA-蛋白復合物的可能位置的短距離上游的限制酶；在aCtIIorf4基因的情況下，其被確定為SacI ；和3.相對于DNA鏈上已知固定點，測定(2)中的每條DNA鏈中產生的5，缺失的位置。蛋白-DNA復合物可以是任何目標復合物。在一個實例中，該方法用于定位DNA啟 動子區中蛋白-DNA復合物的邊界，如在順式調節序列處蛋白-DNA復合物的邊界。在一個 實例中，蛋白-DNA復合物可以是調節原核生物或真核生物中一種或更多種抗生素抗性基 因表達的轉錄因子-DNA復合物。在另一個實例中，該方法可用于定位本發明實施例中的天 藍色鏈霉菌actII-orf4啟動子中蛋白-DNA結合位點。可在目標轉錄狀態過程中進行定位，例如如果目標順式調節元件涉及抑制，即結 合轉錄阻抑物，則在抑制過程中進行定位，或如果目標順式調節序列結合轉錄激活物，則在 啟動子激活表達過程中進行定位。因此，例如，在一方面，在當細胞中基因表達已知被抑制或激活時的階段，定位可 在體內進行(如使用新鮮收獲的細胞)。通常，培養細胞并在適當的轉錄階段分離。細胞可 用去污劑進行透化處理，其容許酶進入細胞。因此，如果要被定位的蛋白-DNA復合物起抑 制給定基因或表型表達的功能，則在當基因表達或表型被抑制時這一刻測試蛋白-DNA復 合物。相反地，如果要被定位的蛋白-DNA復合物起激活給定基因或表型表達的功能，則在當基因表達或表型被激活時這一刻測試蛋白-DNA復合物。通常，可對細胞監測給定基因或 表型的表達，并在適當階段分離。例如，如果目標順式調節序列(在蛋白-DNA復合物中)在抑制抗生素產生中起作 用，以及該抗生素產生已知出現在細胞生長晚期，則培養該生產細胞并在該生長晚期前收
-M-犾。細胞可以是原核或真核細胞。在一個實例中，細胞是原核細胞，如細菌細胞。例如， 可使用放線菌例如鏈霉菌物種，如天藍色鏈霉菌，例如天藍色鏈霉菌A3 (2)、(M145或M600 株)，淺青紫鏈霉菌，肉桂鏈霉菌或大腸桿菌。通常，如本發明實施例中在此所描述的，以經驗為主確定在該方法中要被使用的 非特異性酶(DNA酶I)和外切核酸酶(如T7)的量。對于所有復合物，使用在DNA-蛋白復合物的可能位置的上游限制性位點處切割 的限制酶(c)產生了寡核苷酸可在隨后的捕捉和擴增步驟中退火至其上的標準的5’末端。一旦完成(2)中的消化，就回收被消化的核酸。消化在每條DNA鏈產生了 5’缺 失。通過確定每條鏈上這些5’缺失的位置，如相對于鏈上已知固定點，則有可能精確定位 DNA上的蛋白結合位點。一種確定每條鏈上5’缺失的位置的方法如下。一旦回收，通過加熱或用堿溶液如 IM NaOH處理對該消化的DNA進行變性，并與包含目標結合位點的互補DNA鏈雜交。例如， 互補DNA可包含啟動子片段(包含目標順式調節序列)。可使用啟動子的PCR片段。一般 而言，互補DNA鏈在一末端包含接頭。然后可使用結合啟動子或接頭的標記的引物進行擴 增反應，如PCR。然后，例如通過PAGE或其他方法如毛細管電泳確定標記的擴增產物的大小。一般 而言，盡管未知蛋白-DNA復合物的精確邊界，但是可從該數據中確定大概位置，并因此確 定包含目標蛋白結合位點的DNA區的序列。例如，由于啟動子區的序列將會知道，因此將標 記片段的大小以及引物結合位點的位置與包含蛋白結合位點的DNA區的序列比較，就有可 能確定蛋白-DNA結合復合物的5，邊界在DNA序列中的精確位置。以相同方式，但使用在相反末端處帶有接頭的DNA鏈定位相反DNA鏈上的邊界。通常，互補DNA鏈被固定。例如，接頭可提供在固體基質上固定。例如，接頭可被 生物素化用于固定到鏈霉親合素基質。固定化的優點在于能從總的消化的DNA樣品中容易 地分離消化的目標DNA鏈。在一方面，本發明涉及一種鑒定原核或真核基因的基因表達的順式作用調節子的 方法，其包含如下任一或兩者(a)進行受保護核酸序列的定位；(b)提供n[圈套]分子文庫，其中所述文庫包含代表來自所述原核生物或所述真 核生物基因組的所有可能的調節序列的序列，以及(i)鑒定結合所述文庫的因子或(ii)將 所述η[圈套]分子文庫導入生物體中，其能指示與當所述η[圈套]分子不導入時相比的 差異的靶基因激活或抑制。該方法可在體內進行。在該方法是體內方法的情況下，其可用 細菌來進行并可包含將該細菌與有效量的DNA酶1及Τ7外切核酸酶接觸，使得為轉錄因子 所保護的調節序列保持完整，而所述細菌基因組的其余部分被破壞。一旦根據本文的方法進行鑒定，順式調節序列就可用于篩選測定法以鑒定轉錄因子。調控基因表達和/或表表型的方法在此的n[圈套]質粒和方法可用于鑒定并表征與細胞中給定順式調節序列競爭 關連轉錄因子結合的序列。這樣的序列可用于制備誘餌序列。誘餌序列模擬了調節蛋白(如轉錄因子)的天 然結合位點(順式調節序列)。當導入包含順式調節序列的合適的宿主細胞(通過在此所 描述的方法或其他方法)時，誘餌序列與細胞中的順式調節序列競爭關連轉錄因子結合。當這樣的競爭發生時，伴隨的是其表達受該順式調節序列調節的基因的表達的改 變。這可導致對細胞表型例如在此所描述的抗生素產生、抗生素抗性、溶劑耐受性的調控。應當理解根據在此所描述的方法導致基因表達或表型改變的η[圈套]質粒可在 本發明方法中用作誘餌分子。根據在此所描述的方法鑒定為與順式調節序列競爭轉錄因子 結合的圈套序列可用作誘餌序列。因此，在一方面，本發明涉及用于調控細胞中基因表達和/或表型的方法，包括使 用誘餌序列。一般而言，一種根據本發明用于調控一種或更多種基因表達的方法包括(a)提供包含轉錄因子結合位點(誘餌序列)的多核苷酸；和(b)將該多核苷酸導入細胞中，其中細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種 或更多種基因，該順式調節序列包含轉錄因子結合位點或與該轉錄因子結合位點競爭轉錄 因子結合。一般而言，多核苷酸中誘餌序列(轉錄因子結合位點)不與基因可操作地連接。轉 錄因子結合位點可以自關連啟動子的任何其它元件分離。包含誘餌序列的多核苷酸可被稱為誘餌多核苷酸。誘餌多核苷酸可包含質粒載體。例如，誘餌多核苷酸可包含如在此所描述的和/ 或根據在此所描述的方法制備的η[圈套]質粒。誘餌多核苷酸可包含多于一個拷貝的誘餌序列。該多核苷酸可包含含有多個拷貝 的誘餌序列多聚體分子。例如，1-1000個拷貝。通常，存在2個或更多個拷貝，例如2-1000 個拷貝，如至少 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800 或 900 個拷貝。例如，可以是 10-200、10-150、20-120、20-100、30-100、30-80、30-50、30-40 個拷
貝。例如，可存在30個拷貝的誘餌序列。通常，存在多個拷貝的誘餌，例如多個同向重復的 誘餌序列。誘餌多核苷酸可包含附加到誘餌序列上的額外的序列。通常，該額外的序列導致 增加的由于外切和/或內切核酸酶作用而對誘餌序列降解的抗性。誘餌多核苷酸可包含至 少一個二級結構元件。通常，該二級結構導致增加的由于外切和/或內切核酸酶作用而對 誘餌序列降解的抗性。誘餌多核苷酸可包含修飾的堿基或糖以賦予更大的核酸酶抗性。誘 餌多核苷酸可包含在該多核苷酸末端的2’ OH核苷酸或胺，以減少或抑制外切核酸酶活性。 在一方面，誘餌多核苷酸可包含線型寡核苷酸。誘餌多核苷酸可包含環狀雙鏈DNA(所謂的 現鈴狀結構)。在一方面，誘餌多核苷酸可包含在分子一個或每一個5’末端的膽固醇修飾。誘餌多核苷酸可包含以任何合適組合存在的任一或更多的上述特征。當導入合適的宿主細胞中時，誘餌多核苷酸中的誘餌序列能與細胞中的順式調節序列競爭轉錄因子結合，該轉錄因子結合內源順式調節序列。可通過在此所描述的方法針 對該功能篩選序列。誘餌序列與之競爭的順式調節序列可以是任何在此描述和/或根據于 此方法鑒定的順式調節序列。例如，順式調節序列可以是一種調節對代謝物產生起作用的一種或更多種基因表 達的序列，如在代謝物是抗生素(如放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素或肉桂霉素)、酶或藥 物的情況下。在細胞中代謝物產生可增加。順式調節序列可以是一種調節在決定抗生素抗性中起作用的一種或更多種基因 表達的序列。細胞中的抗生素抗性可減少。順式調節序列可以是一種調節在決定溶劑(如 丁醇)耐受性中起作用的一種或更多種基因表達的序列。細胞中的溶劑耐受性可增加。例如，該順式調節序列可包含編碼AfsR蛋白(天藍色鏈霉菌中抗生素合成的多效 調節子)結合位點的序列。AfsrR結合位點以粗體示于SEQ ID NO :1中(實施例1)。在另一個實例中，順式調節序列可以是天藍色鏈霉菌aCtII-orf4啟動子中的一 種順式調節序列，例如順式調節阻抑序列。例如，順式調節序列可包含在此鑒定的序列 A24. 1、Α24· 2、Α24· 3、Α24· 4 或 Α24. 5。在一個進一步的實例中，順式調節序列可包含VanR轉錄因子結合位點，例如，位 于如屎腸球菌或天藍色鏈霉菌的vanH啟動子中的VanR結合位點。30bp VanR結合位點的 一個實例示于SEQ ID NO :21，以及另外一個實例示于SEQ ID NO :26。順式調節序列可以是一種起作用調節編碼特定目標功能或表型的一種或更多種 基因表達的序列，所述特定目標功能或表型例如代謝物例如抗生素(如肉桂霉素、放線菌 紫素、十一烷基靈菌紅素)產生、對特定溶劑或毒素耐受性、對特定抗生素抗性或任何其它 目標功能或表型。通常，該序列會位于這樣的基因的啟動子區。例如，順式調節序列可調節肉桂鏈霉菌中肉桂霉素生物合成基因的表達，如來自 cin7啟動子的順式調節序列。順式調節序列可調節編碼溶劑耐受性基因的表達，例如在原核生物中，如大腸桿 菌K12中的丁醇耐受性。順式調節序列可以是一種調節原核抗生素抗性基因表達的順式調節序列，通常是 來自編碼抗生素抗性的基因的啟動子的順式調節序列。可靶向任何目標抗生素抗性。例如， 針對如下的抗生素抗性已知為如下的抗生素類氨基糖苷類(例如卡那霉素)；碳青霉烯 類(例如美羅培南)；頭孢菌素類(例如頭孢吡肟)；糖肽類(例如萬古霉素和達托霉素)； 青霉素類(例如氨芐青霉素、羧芐青霉素和青霉素)；多肽類抗生素(例如多粘菌素B)；喹 啉類(例如左氧氟沙星)；磺胺類(例如菌特靈)；四環素類(例如四環素)；以及各種抗生 素，氯霉素、利福平和斯沃。在一方面，編碼對抗生素抗性的一種或更多種基因編碼提供對特定抗生素抗性的 蛋白，或在某些情況下，編碼提供對一類抗生素抗性的蛋白，例如以上所列的抗生素及抗生 素類。這樣的抗生素抗性基因可編碼靶向特定機制或結構的抗生素或抗生素類的蛋白。通 常這樣的抗性基因是通過細菌在暴露于抗生素后所獲取的。在一方面，抗生素抗性基因可包括一種或更多種下列基因或基因類型受VanR轉錄因子調節的vanHAX操縱子基因，其在多種細菌中存在，包括腸 球菌(Enterococcus)(如糞腸球菌(E. faecalis)、屎腸球菌(E. faecium))、葡萄球菌
40(Staphylococcus)(如金黃色葡萄球菌(S. aureus)) (Courvalin(2006)Clin. Infect. Dis. 42，S25)，并已報道在其他致病細菌中罕見(Werner (2008) FutureMicrobiol. 3，547)。 這些基因在表達時提供了對抗生素萬古霉素的VanA型抗性。靶向vanHAX基因的誘餌序列 包含天然VanR結合位點(例如SEQ ID NO 21或SEQ ID NO 26中的天然VanR結合位點) 或天然位點變體，其與目標細胞中的天然位點競爭VanR結合。那些編碼內酰胺酶的基因導致對內酰胺類抗生素(具體是青霉素類、 頭孢菌素類、頭霉素類和碳青霉烯類)抗性。這些基因在包含已知為廣譜內酰胺酶 (ESBL)的內酰胺酶亞類的革蘭氏陰性感染中是醫學上特別重要的，該廣譜內酰胺 酶(ESBL)出現在包括弗氏檸檬酸桿菌(C. freundi)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的細菌 中，以及越來越多地出現在肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)、大腸桿菌(E. coli)和沙門氏 菌(Salmonella spp.)中。對于目前所發現的β -內酰胺酶的綜述可見于Paterson(2005) Clin. Microbiol. Rev. 18，657 中。主要類型的β -內酰胺酶、生物體的實例和它們所影響的抗生素以及負責的基 因如下ΤΕΜ β-內酰胺酶，最通常為TEM-I基因編碼，在大多數革蘭氏陰性細菌包括大 腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌中影響氨芐青霉素抗性，盡管 業已鑒定了 大量的 140 種 TEM 型酶(George (2005) N. Eng. J. Med. 352，380) ； SHV β -內 酰胺酶，最通常為SHV-5和SHV-12編碼，其引起例如在肺炎克雷伯氏菌中的氨芐青霉 素抗'性(Paterson (2003) Antimicrob. Agents Chemother. 47 3554) ；CTX-M β _ 內酷胺 酶，引起例如在大腸桿菌和腸道沙門氏菌(S.enterica)中的對頭孢氨噻肟和其他肟基 (οχγ πι ηο)-β-內酰胺酶(例如頭孢他啶、頭孢曲松或頭孢吡肟)的抗性，已描述了 40種 CTX-M 酶(Canton (2008) Clin. Microbiol. Inf. 14 134) ；OXA β -內酰胺酶，引起例如在腸 桿菌如大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌以及銅綠假單胞菌中的對苯唑西林和氯唑西林的抗性； 抑制劑抗性β -內酰胺酶，例如見于如大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌中的ΤΕΜ-β -內酰胺酶 的變體，其對calvulinic酸和其他抑制劑具抗性；見于包括腸桿菌屬菌種的許多革蘭氏陰 性細菌中的AmpC-β -內酰胺酶，給予對頭孢菌素類的廣譜抗性；編碼對頭霉素類、頭孢菌 素類和碳青霉烯類抗性的碳青霉烯酶類，該類型的內酰胺酶可分成IMP-型(存在于革 蘭氏陰性細菌，特別是假單胞菌屬和不動桿菌屬中)、VIM(—個實例是主要見于銅綠假單 胞菌中并編碼對除單菌胺類之外的所有β “內酰胺類抗性的VIM-2顯性變體)和KPC(編 碼肺炎克雷伯氏菌中碳青霉烯抗性)。在那些編碼積極從細菌中外排抗生素的外排泵的基因中存在5個主要的超家 族(Poole (2007) Ann. Med. 39 162)主要易化子(MFS)、ATP 結合盒(ABC)、小多藥抗藥 性(SMR)、抗性結節(RND)和多藥及毒物外排(MATE)。那些受這些外排系統每一種所影 響的抗生素、負責的基因以及它們最通常出現的生物體在Poole (2005) J. Antimicrobial Chemother. 56,20的表1中給出并示于圖27。醫學上重要的抗性基因包括通常為 Mef(A)基因所編碼的大環內酯抗性，例如在鏈球菌(Pozzi (2004) Curr. Drug Targets Infect. Disord. 4，203)和革蘭氏陰性細菌中；MsrD編碼的酮內酯抗性，例如在肺炎鏈球 菌(Daly (2004) J. Clin. Microbiol. 42 3570)中；例如為如在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏 菌和腸道沙門氏菌中描述的Cml/CmlAB外排系統編碼的氯霉素抗性(Schwarz (2004) FEMS Microbiol. Rev. 28 519)；為假單胞菌中MexCD-OprJ所編碼的紅霉素抗性(Tauch (2003)Mol. Genet. Genomics 268，570)；為革蘭氏陰性細菌中的Tet家族-通常是TetA、 TetB、TetC、TetD、TetE、Tet30 禾口 Tet39 (Roberts (1996) FEMS Microbiol. Lett. 19 1 和 Butaye (2003) Int. J. Antimicrob. Agents 22 205)以及革蘭氏陽性細菌中的 TetK 和 TetL (Butaye (2003) Int. J. Antimicrob. Agents 22 205)所編碼的四環素抗性；為 AcrAB-TolC所編碼的流感嗜血桿菌中的β -內酰胺和氨基糖苷類抗性(Rosenberg(2000) J. Bac. 182 :1754)。來自MATE超家族的外排泵賦予了對氟喹啉類等的抗性，以及那些 ^WWSS^lkBi^JSff (NorE, Morita[1998]Antimicrob. Agents Chemother. 42 1178)、淋病奈瑟氏菌(NorM，Roquette-Loughlin[2003]J. Bac 185 :1101)、流感嗜血 桿菌(HmrM，Xu [2003]Microbiol. Immunol. 47 937)、銅綠假單胞菌(PmpM，He [2004] J. Bac. 186 :262)、艱難梭菌(CdeA, Kaatz [2005] Antimicrob. Agents Ther. 49 :1857)、金黃 色葡萄球菌(MepA, Kaatz [2005] Antimicrob. Agents Ther. 49 1857)禾口大腸桿菌(AcrAB, Nishino[2001] J. Bac. 183 5803)中得到鑒定。那些基因編碼對氨基糖苷類(例如鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星)的 抗性。抗性通常為產生修飾抗生素的酶的基因所編碼，該修飾最通常為N-乙酰化(氨 基糖苷乙酰基轉移酶，AAC)、腺苷酰化(氨基糖苷核苷酸轉移酶，ANT)或0-磷酸化(氨 基糖苷磷酸轉移酶，ΑΡΗ) (Shakil [2008] J. Biomedical Sci. 15 :5)。這樣的基因的實例 見于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌中AAC(6’ )-Ie APH(2”)-Ia賦予腸球菌和葡萄球 菌中廣譜氨基糖苷抗性(Hedge[2001]J. Biol. Chem. 276 45876) ；AAC(3)家族是最大的 (Sunada[2003] J. Antibiot. (Tokyo) 52 809)以及，例如賦予腸球菌中廣譜氨基糖苷類抗 性(Draker [2004] Biochem. 43 446) ； ant (2 “)和ant(4”)基因編碼革蘭氏陰性細菌中對 慶大霉素和妥布霉素的抗性，同時ant (4’ )和ant (6)和ant (9)在革蘭氏陽性細菌中也如 此(Jana[2006]Appl. Microbiol. Biotechnol. 70 140)；在革蘭氏陽性生物體中，aph(3，) 基因廣泛分布并賦予對廣譜氨基糖苷類的抗性，尤其在葡萄球菌和腸球菌中(McKay[1996] Antimicrob. Agents. Chemother. 40 2648)。此外，ermB基因牽涉確定對紅霉素類，例如希舒美/阿奇霉素的抗性，特別是在鏈 球菌感染中(Richter [2005]Clin. Infect. Dis. 41 599)。在一方面，本發明方法可用于靶向調節任何一種或更多種上述抗性基因或基因類 型的表達，如編碼內酰胺酶的基因、編碼氨基糖苷修飾酶的基因的表達，以從而改變對 相應抗生素的抗性，如在上列的菌株中。可如在此所描述的鑒定并測試用于靶向調節基因 的誘餌序列。誘餌序列可包含順式調節序列自身或，例如保留必要的競爭功能的其變體或片 段。順式調節序列可包含任一在此所描述和/或根據任一在此所描述的方法所鑒定的那些 順式調節序列。誘餌序列可包含如在此所描述的和/或如在此所鑒定的圈套序列，或其保 留必要的競爭功能的變體或片段。可基于細胞中天然轉錄因子結合位點制備用于靶向特定基因集合如抗生素抗性 基因的誘餌序列。例如，序列可獲得自發表的文獻。在一方面，測試誘餌序列可包含內源結 合位點或天然位點的共有序列或變體或片段。然后，可對測試誘餌序列評估誘餌功能。通常，如在此所描述的，誘餌序列被制備 為誘餌多核苷酸。將誘餌多核苷酸導入包含給定轉錄因子結合位點的宿主細胞中，該給定轉錄因子結合位點可操作地連接其表達可直接或間接檢測的一種或更多種基因。例如，篩 選可包含直接測試受調節基因的表達，或測試與該基因表達相因果聯系的表型。導致一種 或更多種基因表達改變的誘餌序列被認為具有誘餌功能。在此描述了用于測試誘餌功能，如使用n[圈套]質粒、報道系統的合適的方法。還可通過使用η[圈套]質粒文庫的在此所描述的方法和/或用于鑒定蛋白結合 位點的邊界的方法確定測試誘餌序列。這些方法可用于研究細胞中表型的遺傳基礎。例如， 研究臨床分離株中抗生素抗性的遺傳基礎。誘餌多核苷酸可包含任一在此描述的誘餌序列以及還可包含如所描述的額外的 序列。誘餌多核苷酸可包含任一在實施例中描述的誘餌序列和/或誘餌多核苷酸。因 此，例如，包含AfsR結合位點的誘餌多核苷酸可包含實施例1的11[圈套]質粒或包含于其 中的圈套，或形成環狀誘餌 鈴狀誘餌結構的SEQ ID No. 3的寡核苷酸。誘餌多核苷酸可 包含如實施例2或3中導致肉桂霉素產生上調所鑒定的η[圈套]質粒或包含于其中的圈 套。誘餌多核苷酸可包含如實施例4中導致丁醇耐受性增加所鑒定的η[圈套]質粒或包含 于其中的圈套。誘餌多核苷酸可包含任一在實施例5中所描述的SEQ ID Νο.8、9、10、11或 12。誘餌多核苷酸可包含形成環狀啞鈴狀誘餌的SEQ ID No. 21的寡核苷酸，或SEQID NO 26，或VanR結合位點的物種變體。可通過任何合適的方法制備誘餌多核苷酸。例如，可如實施例7. 2中所描述的，使 用合適的引物通過PCR制備啞鈴狀誘餌。每條引物通常包含會形成啞鈴狀結構的莖環的一 部分。這樣的引物的實例在SEQ ID NO :24和25中給出。使用引物的PCR擴增通常繼之以 擴增產物的限制性消化以及連接形成閉環啞鈴狀體。可選地，可如實施例7. 3中所描述的，通過限制性消化質粒制備啞鈴狀體。消化后 進行連接以形成閉環啞鈴狀結構。本發明方法可用于改變原核或真核細胞中的基因表達。在一方面，當該方法應用 于真核細胞時，誘餌多核苷酸包含如在此所描述的η [圈套]質粒和/或該誘餌序列與根據 在此所述的方法鑒定的順式調節序列競爭和/或該誘餌序列包含根據在此所述的方法鑒 定的順式調節序列或其變體或片段。可通過任何合適的手段將誘餌多核苷酸導入宿主細胞。例如，轉化、轉染、接合。例 如，在多核苷酸包含接合質粒的情況下，可通過接合導入。誘餌多核苷酸如環狀啞鈴狀結構 可通過轉染導入細胞。細胞可存在于液體培養物中并將誘餌添加到液體中。可選地，細胞 可在固體培養基上培養并由浸透誘餌且覆蓋在培養基上的吸水紙片轉染誘餌。通常，將誘 餌多核苷酸添加至培養基并為細胞所吸收。在細胞于固體培養基上培養的情況下，可將誘 餌多核苷酸添加至濾紙片上并自該濾紙片為細胞所吸收。滲透性緩沖液可用于幫助轉染。在一方面，誘餌多核苷酸的轉染可包含使用膽固醇。特別是，該方法可使用在一個 或兩個5’末端處帶有膽固醇修飾的線型誘餌多核苷酸。該修飾據信利于細胞攝取。誘餌可額外地被標記，如用可檢測的標記例如熒光染料，如Cy5在5’末端進行標 記。這將利于監測細胞中的攝取和保持。如實施例7. 1中所描述的，可使用膽固醇和/或可檢測地標記的引物制備膽固醇 和/或可檢測地標記的誘餌。
將誘餌多核苷酸轉染入細胞中可包含使用R9-膽固醇，其由附在9個D-精氨酸的 線型鏈上的膽固醇分子組成(Kim W. J.等，Mol. Ther 200614:343-350)。一般而言，監測誘餌多核苷酸在細胞中的攝取和/或保持。例如，質粒誘餌可包 含可檢測的標記如編碼抗生素抗性的標記，其容許對質粒的存在進行正選擇并監測質粒增 殖。也可通過qrt-PCR監測誘餌多核苷酸的存在。一般而言，導入誘餌的細胞是那些包含該誘餌競爭轉錄因子結合的可操作地連接 其表達要被調控的基因的順式調節序列(通常為包含該序列的啟動子)的細胞。合適的宿 主細胞描述于此。通常，在該方法用于改變細胞表型的情況下，宿主細胞在誘餌不存在下展 示表型。可在一系列的細胞中篩選用于改變醫學或治療相關表型如用于增加抗生素敏感性 的誘餌。例如，可首先在表型的細菌模型如抗生素抗性模型中測試誘餌，然后在例如病原體 或臨床分離株中進一步驗證。如在此所描述的，可在動物模型中進一步驗證誘餌。—旦誘餌多核苷酸導入細胞中，通常針對基因表達的調控篩選細胞。可直接或間 接進行篩選。針對細胞中基因表達和/或表型的調控的篩選方法描述于此，與用于鑒定順 式調節序列的方法相關。在一個進一步的方面，可將多于一條的誘餌多核苷酸導入細胞中以改變表型。例 如，可使用n[圈套]質粒的組合，如果質粒是相容的話。在一方面，在此描述的方法是體外方法。在此所描述的用于調控表型的方法具有多種應用，例如在工業中和在治療學中。該方法可用于改變工業中重要的細胞的表型，例如增加有用代謝物的產生。因此， 在一方面本發明提供了一種調控(增加或減少)細胞中代謝物產生的方法，包括在此所描 述的方法。通常，在該方法中目標順式調節序列調節編碼代謝物產生所必需的蛋白的基因 的表達。在一方面，順式調節序列包含任一在此鑒定的A24. 1、A24. 2、A24. 3、A24. 4或 A24.5。本發明涉及一種調控抗生素產生的方法，包括使用任一在此鑒定的A24. 1、A24. 2、 A24. 3、A24. 4或A24. 5，如A24. 1、Α24· 3、Α24· 5，例如Α24. 5，或使用與上述任一競爭轉錄因 子結合的誘餌分子。本發明進一步涉及一種調控抗生素產生的方法，包括使用任一的SEQ ID NO 8-12。該方法還可用于使細胞如細菌細胞對抗生素更敏感。因此，本發明進一步提供了 一種調控(增加或減少)細胞如細菌細胞的抗生素敏感性的方法，包括在此描述的方法。通 常，在該方法中，目標順式調節序列調節編碼抗生素抗性必需蛋白的基因的表達。因此，在一方面，本發明提供了誘餌多核苷酸用于調控細胞抗生素抗性的應用。一 般而言，該調控由細胞中一種或更多種抗生素抗性基因表達的改變引起。該作用可特異于 特定的抗生素或在某些情況下特異于抗生素類。—般地，細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節 序列包含轉錄因子結合位點，以及誘餌多核苷酸包含具有相同的結合位點的誘餌序列或與 細胞結合位點競爭轉錄因子結合的位點。將該多核苷酸導入細胞中減少了轉錄因子與細胞 中的順式調節序列的結合并導致細胞中一種或更多種基因表達的改變，從而調控細胞的抗 生素抗性。通常，細胞中靶定的順式調節序列調節如在此所描述的一種或更多種抗生素抗性基因的表達。誘餌破壞了基因表達的調節，從而導致細胞中抗生素抗性的改變(如減少)。細胞可以是抗性實驗室模型或天然抗性株，如病原體或臨床分離株。合適的細胞 描述于此。在一方面，本發明可涉及一種用于改變除藍細菌中CO2應答基因的表達水平之外 的原核生物表型的方法，其包括提供包含過量編碼原核轉錄因子所結合序列的核酸的誘 餌，其中根據在此所描述的方法鑒定所述序列，使得所述誘餌剛一接觸所述原核生物，轉錄 因子就被競爭性抑制與所述原核生物基因組中其關連結合位點的結合。本發明還可涉及一種用于改變除藍細菌中CO2應答基因的表達水平之外的原核生 物表型的方法，其包含提供一種包含過量編碼結合原核轉錄因子的序列的核酸的誘餌，使 得所述誘餌剛一接觸所述原核生物，轉錄因子就被競爭性抑制與所述原核生物基因組中其 關連結合位點的結合。誘餌可包含原核基因啟動子的一部分。誘餌可包含來自原核基因如 抗生素合成或調節基因啟動子的轉錄因子結合位點。誘餌與轉錄因子的結合可引起原核生 物對該原核生物在其他情況中有抗性的抗生素的敏感性。例如，原核生物在正常情況中可 對抗生素萬古霉素具有抗性，但是在所述誘餌存在下，該原核生物不再具有抗性。原核生物 可以是病原體。可選地，誘餌與轉錄因子的結合導致增加的原核生物抗生素產生。在一種情況下，當根據本發明方法要被改變的表型是抗生素抗性時，首先在實驗 室模型細胞或如在此所描述的報道細胞中測試推定的誘餌序列。然后通常在天然抗性細胞 如病原體細胞或臨床分離株中測試候選的誘餌序列。一般而言，該方法額外包含在合適的 動物模型中測試候選的誘餌序列。例如，可使用小鼠模型。一般而言，用對僅采用抗生素治 療具抗性的致病菌株感染動物模型。有時，當針對一組臨床分離株測試誘餌序列(基于模式細菌菌種中的結合位點序 列)時，可發現某些分離株屈折于該處理。在這樣的情況下，可鑒定那些分離株并進行序列 分析以確定在TFD所模擬的調節序列中是否存在任何變化。如果這樣的話，可評估那些改 變的出現并且創建包含大致與臨床中它們的發生率成比例的模型和變體序列的TFD混合 物(cocktail)。本發明的誘餌多核苷酸具有多種應用，包括醫學和獸醫應用以及體外應用。例如，增加對一種或更多種抗生素細胞敏感性的誘餌多核苷酸可用于治療人或動 物細菌感染，或在離體方法中用于殺死或抑制原核生物，如用于抗細菌清潔組合物。通常在使用中，誘餌應與抗生素組合使用，使細胞對該抗生素更敏感。抗生素可與 誘餌同時、或前后施用。抗生素和誘餌可在相同的或分開的組合物中施用。因此，例如，靶向vanHAX操縱子的VanR調節以降低對萬古霉素抗性的誘餌應通常 與萬古霉素抗生素組合使用。誘餌用于治療的特定感染或相關病癥通常取決于誘餌所靶向的致病細胞。例如，萬古霉素抗性腸球菌(VRE)如屎腸球菌和糞腸球菌與腹部感染、皮膚感染、 尿路感染、血液感染相關。因此，靶向VRE中萬古霉素抗性基因的VanR調節的誘餌通常與 萬古霉素結合可用于治療這樣的感染。例如，攜帶編碼廣譜β -內酰胺酶的基因的革蘭氏陰性感染(例如大腸桿菌和肺 炎克雷伯氏菌)顯示了與泌尿道和腸嚴重感染相關的對青霉素的廣譜抗性。在一方面，用 設計成阻止或下調那些編碼β -內酰胺酶的基因(例如CTM-X家族基因)表達的誘餌結合青霉素處理可用于治療這樣的感染。在一方面，金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌或肺炎衣原體(C. pneumoniae)中mefA或 ermB基因表達引起的并且明顯可見耳喉感染的希舒美抗性可通過施用靶向在這樣的生物 體中mefA和ermB調節的誘餌，通常結合抗生素得以治療。在一方面，氟喹諾酮抗性感染例如引起肺炎的肺炎鏈球菌感染可通過靶向 norA(編碼外排泵的基因)調節的誘餌并結合施用抗生素得以治療。在一方面，大環內酯抗性，例如在引起肺炎的肺炎衣原體感染中克拉霉素(如 Biaxin)抗性可通過施用靶向抗性基因ermB調節的誘餌結合抗生素得以治療。在一方面，靶向編碼對β -內酰胺(例如青霉素，如力百汀(Augmentin))抗性的 ampC基因的誘餌可用作一種針對由在醫院注射抗生素引起的多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性醫源性感染的療法。在一方面，本發明涉及一種包含誘餌多核苷酸和生理學上可接受的載體或賦形劑 的藥物組合物。該組合物可額外包含一種或更多種如所描述的抗生素。用于治療應用的可接受的載體或稀釋劑是藥學領域熟知的，并描述于例如 Remington'Pharmaceutical SciencesiMack Publishing Co. (A. R. Gennaro 編· 1985)中。 可基于預期的給藥途徑以及標準的制藥實踐進行藥學載體、賦形劑或稀釋劑的選擇。藥物 組合物可包含載體、賦形劑或稀釋劑，或除此之外的任何合適的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、涂 層劑、增溶劑。誘餌可通過任何合適的手段施用，例如通過靜脈內注射、表面施用或口服遞藥。如 上，可與合適劑量的抗生素一起施用，該抗生素與誘餌同時或分別施用。增加抗生素抗性的誘餌多核苷酸還可用于清潔組合物如消毒劑中，此外通常與使 細胞對之更敏感的抗生素相結合和/或與一種或更多種抗細菌劑相結合。在一方面，本發 明涉及這樣的清潔組合物。本發明進一步提供了一種包含如在此所描述的誘餌多核苷酸和一種或更多種抗 生素或抗細菌劑的試劑盒，其中該誘餌和抗生素或抗細菌劑被組合用于殺死或抑制原核生 物如細菌。因此，在一方面本發明進一步涉及如在此所描述的和/或鑒定的誘餌多核苷酸在 制備用于治療受試者細菌感染的藥物中的應用。本發明進一步涉及誘餌多核苷酸用于細菌 感染治療以及一種治療受試者細菌感染的方法，包括施用如在此所描述的誘餌多核苷酸。本發明進一步涉及包含如在此所描述和/或鑒定的誘餌多核苷酸的組合物和藥 物。更進一步的方面包括聯合療法，其中將如在此鑒定和/或所述的誘餌多核苷酸與一種 或更多種抗生素或其它抗細菌療法相結合施用于受試者。在更進一步的方面中，本發明涉及根據在此所描述的方法鑒定的順式調節序列以 及它們的應用，如在誘餌序列中的應用。特別是，本發明涉及在本發明實施例中鑒定的順式 調節序列，如包含在此鑒定的A24. 1、A24. 2、A24. 3、A24. 4或A24. 5的順式調節序列和包含 它們的誘餌多核苷酸。本發明進一步涉及如在此所述和/或如在此所述的誘餌多核苷酸， 如 SEQ ID NO :3、8-12 和 21。本發明進一步涉及在此描述的和/或根據在此描述的方法制備的任一 n[圈套] 質粒或質粒文庫，包括那些在本發明實施例中制備的。
本發明進一步涉及包含如在此所描述的η [圈套]質粒和/或誘餌多核苷酸的宿 主細胞。特別是，本發明涉及這樣的宿主，其展示改變的基因表達和/或表型。例如，本發 明涉及展示增加的給定代謝物如抗生素產生、增加的對抗生素敏感性或增加的對給定溶劑 耐受性的宿主細胞，包括那些在本發明實施例中所制備的宿主細胞。因此，在一方面，本發明涉及包含如在此所描述的誘餌多核苷酸的宿主細胞(例 如那些在此描述的)，該誘餌多核苷酸包括如在此所描述的η [圈套]質粒或質粒文庫。特 別包括的是那些具有改變的對抗生素敏感性(如增加的敏感性)的以及根據本文方法制備 的細胞。因此，在一方面，本發明涉及業已使用如在此所描述的誘餌多核苷酸使之對抗生素 更加敏感的病原體或臨床分離株。本發明特定實施方案的進一步描述在根據本發明的第一實施方案中，我們提供了一種用于鑒定順式調節元件的通用 方法。如同大多數好的科學一樣，基因組測序計劃較之所回答的提出了更多的問題。本質 上其所傳遞的是生物體中所有基因的列表(基因組)，但是這卻提出了在哪一時刻以及什 么情況下這些基因哪些被使用(表達)的問題。這是一項重要的考慮，因為表達樣式提供 了基因功能以及鑒定那些負責重要特性(表型)的基因的線索。考慮到人細胞均包含相 同的基因，但表達樣式則取決于(以及可能決定于)細胞是否來自肝或腦(組織特異性調 節)。已開發出能描述基因表達樣式以及能例如鑒定造成醫學上重要的表型如對疾病的抗 性的多組基因的新技術(微陣列技術)。基因組測序計劃的承諾之一是這樣的知識會幫助 加速設計用于治療疾病的新藥物和策略。然而，需要新工具來識別該潛力。由于我們現在具有鑒定決定表型的基因的能力，因此接下來的挑戰就變成去獲取 對這些基因的控制，以及通過這樣做，獲取對表型表達的控制。對于我們的生物學認識(一 般而言，鑒定用于藥物的新靶標)這應當是十分重要的，并且還容許我們改善來自工業細 菌的醫學及商業上重要化合物(如所謂的發酵產物)的生產。發酵產物遍及食品、藥品以 及日益增加的工業用酶和燃料。與依賴于傳統且環境昂貴的(石油)化學制造方法不同， 從可持續來源(細菌)中獲得這些產物是可取的目標。基因通過專門蛋白即轉錄因子開關。這些轉錄因子具有雙重功能它們結合特定 的DNA序列(調節元件)，通常接近于靶基因，并且它們改變了基因表達的可能性。較早的 嘗試聚焦于改變轉錄因子自身的性質或豐度。我們的方法在于靶向轉錄因子所結合的調節 元件。我們所開發的一種策略是導入過量的這些調節元件(稱為‘誘餌’)，使得競爭性阻 止轉錄因子結合基因組形式，如此阻斷了對下游基因的任何影響(參見下述與根據本發明 的第二和第三實施方案有關的討論)。在本發明的該實施方案中，我們構建了能快速測試鑒 定具有期望效果的調節元件集合的誘餌文庫(包含來自一個物種的所有調節元件，或具有 所有可能的調節元件的通用版本)。該方法的關鍵部分在于構建通用‘報道系統’，使得不 用在復雜現象中尋找改變，例如工業細菌增加的產量，而是通過導入的報道基因表達的改 變監測成功的修飾，該報道基因表達賦予對抗生素的抗性且易于檢測。該系統如此設計以 至于篩選可在高通量下進行。因此，本發明的該方面代表了一種源于基因組時代的技術，其 必須做到迅速地產生高質量數據且與全基因組相關。預計通用誘餌文庫和通用報道系統的 混合物迅速改善了生物技術制品的交付并且是一種無價的研究工具。更具體地說，根據本發明的該實施方案，我們已修改該‘誘餌’寡核苷酸方法以控制原核生物中的遺傳調節并有效控制天藍色鏈霉菌中抗生素產生。然而，誘餌對降解敏感， 而且該方法不適應高通量檢驗。我們在根據本發明的方法(參見實施例1-4)中解決了這 兩個問題。一般而言，利用DNA擴增的滾環機制，將寡核苷酸轉變為一系列(約30個)的 雙鏈同向重復。將這些重復克隆入高拷貝穿梭載體(能在大腸桿菌和鏈霉菌中增殖)中并 通過接合導入天藍色鏈霉菌中。通過抗生素選擇保持質粒。我們發現該系統較誘餌進行得 更好更大抑制了抗生素產生并且持續整個實驗期間。業已修改了該構建文庫的方法，使 得通用文庫能自合成的隨機寡核苷酸制成，或種特異性文庫自全基因組片段制成。為創建 通用篩選系統，在異源表達常用宿主淺青紫鏈霉菌中創建了用于負選擇和正選擇的報道基 因。將靶定的啟動子克隆到決定對代謝物2-脫氧葡萄糖(DOG)的敏感性的卡那霉素抗性 基因或glkA上游。在文庫轉化后，在液體培養物中針對增加的卡那霉素耐受性(檢測負調 節)或增加的對DOG敏感性(檢測正調節)篩選轉化體。由于選擇在液體培養物中進行， 因此大多數克隆丟失，僅留下少且易處理數目的克隆進行分析。開發了驗證系統，其中來自 獨立篩選的克隆集合被測試以了解什么與其他集合成員交叉雜交。以這種方法有可能鑒定 在文庫中重現并且是序列分析的良好候選物的克隆。在根據本發明的第二個實施方案中(參見實施例5)，我們使用誘餌寡核苷酸來研 究天藍色鏈霉菌A3 (2)中藍色-有色抗生素放線菌紫素的調節。該生物體包含(對于原核 生物)相對大的基因組(8. 7Mb)，具有復雜且適應性的基因調節樣式，特別是與控制抗生素 產生的發育和環境信號相關(Bibb (2005) Curr. Opin. Microbiol. 8 :205_215)。天藍色鏈霉 菌還是用于放線菌類的模式生物體，增加對該菌株中抗生素產生調節的了解程度可獲悉用 于實現增加這些生物體所產生的多種次生代謝物的新策略。許多這些化合物在醫學中具 有重要應用，例如作為抗生素，以及在農業中具有重要應用(Berdy (2005) J. Antibiot. 58 1-26)，并且放線菌類依舊是新藥物和酶的有利來源(Ward (2006) Curr. Opin. Microbiol. 9 279-286)。可能作為抗生素產生的復雜調節的結果，許多通過遺傳篩選鑒定的多效突變 體是條件性的；例如，relA無效突變體的不產生抗生素的表型是高度培養基依賴的 (Chakraburtty (1997) J. Bacteriol. 179 =5854-5861)。營養條件性表型的出現暗示著遺傳 篩選可能低估了影響抗生素產生的調節因子數目。如果在所使用的條件下靶基因的激活可 通過替代的轉錄因子或調節途徑介導，則會錯過真實轉錄因子的失活。誘餌的一個優點是 它們鑒定并操縱控制基因表達的DNA-蛋白相互作用的序列成分，潛在地阻斷了眾多轉錄 因子與單一位點的相互作用。在根據本發明的該實施方案中(參見實施例5)，我們證實了 以一種與常規遺傳篩選相互補的方式，相對容易靶向調節序列并且具有快速鑒定新調節基 因的能力。在根據本發明的第三個實施方案(參見實施例6)中，我們證實了誘餌寡脫氧核苷 酸賦予在其他情況中對抗生素具抗性的細菌以對抗生素的敏感性的效用。本領域技術人員 應當理解本發明該方面在所謂的包括在我們的醫院中到處發現的“超級細菌(superbugs)，， 時代是極具重要性的。常常歸因于濫用抗生素，這些所謂的超級細菌的發展具有產生世界 性傳染的可能性。然而，借助于本發明的該方面，本領域技術人員應當理解通過正確理解病 原體取得對特定抗生素抗性的機制，就可在特定抗生素給藥之前和/或同時使用根據本發 明方法鑒定的誘餌寡核苷酸。
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許多基因在多重水平上受控于調節因子與順式調節位點的相互作用。所形成的核 蛋白復合物可以組織特異性、發育階段特異性或依賴于刺激物的方式如此作用。簡言之，體 內DNA-蛋白相互作用受生理決定，并代表了在兩種動態成分之間的相互作用構成反式作 用環境的DNA-結合蛋白，以及順式調節序列。雖然近年來我們的基因表達樣式知識已有充 分增加，但是這樣的增加并沒有與我們的控制影響特定細胞進程的特定基因的調節因子知 識的相應增加相并頭齊進。我們預計本文技術的應用可能給出對原核基因調節復雜性的新 鮮見解并使它們被承認為是一種補充常規遺傳分析的方法。所有在此引用的文獻均特此并入作為參考。
實施例已一般地描述了本發明，包括其優選的實施方案和最佳方式，提供下列特定實施 例結合進一步的描述以全面實現并延伸本發明的書面描述。然而，本領域技術人員應當理 解本發明不應解釋受限于特定的實施例。相反地，為了理解本發明范圍的目的，應當參考附 加于公開內容的權利要求書，包括其等價方案。盡管大體上在此提及的大多數技術是本領域所熟知的，但是可特別參考Sambrook 1989, Molecular Cloning -.a laboratory manual。實施例1賄■態_碰■賊_龍施門&·表舯為完成該工作，首先需要的是開發能創建n[圈套]質粒的分子生物學方案。這 樣的質粒載體的一種期望的特征是其應當包含由相同的DNA片段的同向拷貝組成的區段。 通常這些拷貝數為30，但可在1-1000的范圍內變化，以及該重復序列的長度在35-54bp范 圍內，但可以更長，如多達lOOObp。在以下給出的構建實例中，在該重復序列中，存在所有 n[圈套]質粒所共有并且是制備方法結果的片段(27bp)。還在該實施例中的是選擇質粒 載體(i)以容許大腸桿菌和天藍色鏈霉菌的轉化和增殖；(ii)以包含編碼對抗生素安普 霉素抗性的可選擇的標記基因；和(iii)以保持細胞中的高拷貝數，通常接近100個拷貝/ 細胞。創建含AfsR結合位點的η [圈套]質粒的方法該方法的概要在圖1中給出。合成具有如下嵌合結構的單鏈寡核苷酸(A)用于Τ7引物的退火位點，和⑶包含順式調節序列或推定的順式調節序列的 區域。在通用連接寡核苷酸存在下，通過Taq連接酶作用環化寡核苷酸。在用外切核酸酶 消化線型DNA后，從制備性丙烯酰胺凝膠中回收單體環。這些單體環隨后在使用Bst聚合酶 和Τ7引物的滾環機制擴增反應中用作模板。在PCR反應中再次使用相同的引物并在瓊脂 糖凝膠上分離產物。分離通常包含30-50個重復的高分子量片段并克隆入PCR載體，之后 亞克隆入高拷貝穿梭載體形成η[圈套]質粒。為測定功能，將η[圈套]質粒轉化入天然 菌株或通用報道菌株中。該方案還可用于產生自隨機寡核苷酸制成的‘通用’ η[圈套]文 庫或自片段化的基因組制成的種特異性文庫。η[圈套]質粒如何影響靶定基因表達的圖解 在圖2中給出。在該圖的左上，由于阻抑性轉錄因子(圈“B”)結合基因啟動子中的順式調 節序列(水平條“C”)，因此該基因(水平條“Α”代表的)轉錄失活。可通過多種技術確定 構成轉錄因子結合位點的順式調節序列的序列，所述技術包括生物信息學分析、啟動子‘足跡法’或各種在此所描述的η[圈套]方法。將該序列摻入誘餌寡核苷酸中以影響基因表 達，但在此顯示以大量(通常30個)同向重復克隆入可選擇的質粒中來創建η [圈套]質 粒。質粒通常是一種‘穿梭’質粒，意味著其在大腸桿菌(用以易于遺傳操作)以及所靶定 的生物體中都能增殖；此外，質粒通常是‘高拷貝’，通常意味著在宿主細胞中其會產生接近 100個自身的拷貝。通過標準手段將η[圈套]質粒導入所靶定的原核生物中，并通過針對 其標記進行選擇確保其穩定增殖，所述標記通常是編碼對抗生素抗性的基因。因此當導入 細胞時，η[圈套]質粒通過從基因組啟動子上滴定掉轉錄因子“B”以解除下游基因(如水 平框“D”所顯示的，右上)的轉錄阻抑，從而能影響靶向基因的表達。合成包含AfsR結合位點的誘餌寡核苷酸。其具有如下序列5，-磷酸酉旨-aat acg act cac tat agg g gc gtt gag cga acg ttt ttc rcr rcc gc-3’ SEQ. ID. 1這里AfsR結合位點以粗體示于序列中，用于NotI的限制性位點加下劃線。合成 在5’末端帶有磷酸酯基團的寡核苷酸。還合成了 ‘連接’核苷酸R-T7，如此稱謂，原因在于其包含通常所用引物T7的部分 互補物5，-CCC tat agt gag tcg tat tgc gg_3，SEQ. ID.2將兩種引物都以250pmol/ μ 1的終濃度重懸于由Ix Taq連接酶緩沖液(如廠商 New England Biolabs所提供的)和50U Taq連接酶組成的反應緩沖液中。將混合物加熱 至95°C，持續10分鐘，之后讓其冷卻至45°C，接著向該反應補充4U/ml Taq連接酶，并在 45°C將該反應物溫育過夜。1 μ 1的反應物被用作模板在溫育混合物中用于滾環擴增(RCA)，該溫育混合物由 補充 0. 2mM dNTPs、70nM T7 引物(互補于 R-T7)和 120U/y 1 Bst 聚合酶(New England Biolabs)的Ix Thermopol反應緩沖液(如廠商New EnglandBiolabs所提供的)組成。在 60°C溫育混合物過夜。在于市售柱系統(Qiagen PCR純化試劑盒)上清潔步驟后回收擴增的DNA，并 將1 μ 1該DNA用于標準的PCR反應，該PCR反應由補充0. 2mMdNTPs,5% DMS0、25pmol T7 引物和0.5U Taq聚合酶(Roche Diagnostics)的Ix Taq聚合酶緩沖液(如廠商Roche Diagnostics提供的)組成。使用如下循環參數進行PCR :95°C，持續5min，然后25個如下 順序的重復93°C持續15s、55°C持續15s、72°C持續2min，接著72°C持續2min。反應產物通過1 %瓊脂糖/TBE凝膠電泳分析并通過透射溴化乙錠染色凝膠顯影。成功的制備表現為具有大約50bp重復長度的序列‘梯’以及足夠量的具有1. 5kb 表觀大小遷移的物質以容許純化(相當于大約30個重復的50bp單體)。一般而言，當進行該操作時，如果產物的尺寸主要是小的(小于500bp大小)，則 首先重復擴增，改變PCR反應中所使用的模板量以及所采用的擴增循環數。結果無法產生 期望大小的產物，一種代替的策略如下對Bst擴增產物進行NotI部分消化，對片段進行大 小分級以分離連接NotI相容的接頭的1. 5kb模板，以便容許在標準的連接介導的PCR反應 (LM-PCR)中進有效擴增。將1. 5kb片段亞克隆入來自Promega的市售pGEMT-Easy載體，該載體配上3’T突 出端用于有效克隆PCR產物。使用標準的分子生物學技術，在分離自pGEMT-Easy文庫整分試樣的DNA的EcoRI消化并經凝膠純化后回收片段。然后，將收集的EcoRI片段亞克隆入在 大腸桿菌和天藍色鏈霉菌中都能復制的穿梭載體(在我們的例子中是PIJ86)中類似的限 制性位點上。然后，使用標準方法通過接合將PIJ86-攜帶的η[圈套]片段導入天藍色鏈 霉菌中(Kieser 等(2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation·)。使用afsRn[圈套]質粒以改變天藍色鏈霉菌中抗生素產生表型AfsR是天藍色鏈霉菌中抗生素產生的一種多效調節子，該基因的工程化缺失已 表明其對天藍色鏈霉菌中兩種有色抗生素，放線菌紫素(其是藍色的)和十一烷基靈菌紅 素(其是紅色的)的產生必不可少(Hong等(1991) J. Bacteriology 173:2311-2318)。在 afsS基因上游發現了充當AfsR結合位點的關鍵順式調節序列(Lee等(2002)Molecular Microbiology 43 1413-1430)，其就是用于測試η[圈套]質粒的序列。這就是為什么誘餌 (為了比較而平行制備的)或包含該位點的η[圈套]質粒通過滴定掉啟動子活化性AfsR蛋 白會預期抑制afsS表達，結果減少了兩種有色抗生素的產生的原因。因此，對用作對照的 未處理的天藍色鏈霉菌、用包含AfsR位點的環化TFD(如上所述并示以粗體，使用了寡核苷 酸5，_ 磷酸酉旨-ata gcg ttg age gaa cgt ttt tc gCg tttt CgC ga aaaacg ttc get caa cgc tat ag tttt ct-3’ SEQ ID. 3)處理的培養物以及用AfsR η[圈套]質粒轉化的菌株 監測三條生長曲線(圖3)。在該圖中，afsS的野生型啟動子示于左上“Α”，AfsR(橢圓形 “B”)結合其關連位點(長方形“C”)激活調節基因的表達。右上的圖“I”顯示了培養物的 生長曲線以及兩種有色抗生素，放線菌紫素(Act)和十一烷基靈菌紅素(Red)的產生；(左 縱坐標=抗生素產量，右縱坐標=細菌生長，實線顯示了細菌干重測量值，菱形代表了放線 菌紫素(Act)產量以及正方形代表了十一烷基靈菌紅(Red)產量)。圖“II”顯示了導入 環狀啞鈴狀誘餌(+誘餌；左中)，其提供了對AfsR結合的競爭，抑制了 afsS編碼的調節基 因的表達，伴隨著減少抗生素產生(右中圖II)。包含順式調節序列“C”同聚重復的η[圈 套]質粒(左下)證實在抑制抗生素產生(η [圈套])中更有效，可能是因為對質粒的正選 擇，并且在整個實驗過程中觀察到了阻抑效應(圖III，右下)。η[圈套]質粒能以伴有表 型改變的可預測的方式調節基因表達的控制。這些質粒較誘餌生產更便宜且更易于導入細 胞中，提供了更持久的效果，并且至關重要的是它們使文庫法能發現關鍵調節元件。因此，所總結的是，與對照培養物相比(圖3，頂行)，在誘餌和η [圈套]處理的培 養物中抗生素產生被抑制。然而，用誘餌處理，效果主要是暫時的，在48小時后恢復抗生 素產生，而用η[圈套]處理，抑制效果則持續到實驗過程之外。使用或以誘餌形式或摻入 η[圈套]質粒中的打亂順序形式的AfsR結合序列的對照實驗未能明顯抑制抗生素產生。 這些觀察結果支持了 η[圈套]質粒能用于鑒定并表征順式調節序列，以及在某些方面(穩 定性以及表型被修飾的程度)中，它們較現存誘餌寡核苷酸技術更好的猜測。實施例2一禾中#用ηΓ 1 t庫鑒定順式i周節元件的方法IU及因此用于gt變原核勿或 真核生物中表型的誘餌在該實施例中，η[圈套]文庫由分離自17. 083kb肉桂霉素生物合成簇(Widdick 和 Bibb (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :4316_4321)的短 DNA 片段制成，并將文庫再 導入肉桂鏈霉菌生產株中。使用平板測定法進行抗生素的檢測，這里讓生產株的菌落在覆 蓋接種報道菌株枯草芽孢桿菌接種物的軟營養瓊脂的瓊脂平板上生長。在抗生素已殺死了指示菌株的地方，透明營養瓊脂的暈圈看起來圍繞著生產菌落，在其他地方由于菌株持 續生長，因此營養瓊脂看起來混濁。暈圈直徑是所產生的肉桂霉素量的指示劑，以及在導入 η[圈套]文庫后，可用作針對過量產生的接合后體菌落的便利篩選。這樣，就有可能確定是 否文庫成員能上調節抗生素產生，并作為發現工具針對能摻入TFD中的候選順式調節元件 掃描廣大基因組片段，從而證實了該方法的效用。可延伸該方法的邏輯性以開發用于η[圈 套]文庫檢測非常大量調查(包括全基因組)中候選序列的策略，這些方法的示范和它們 潛在的應用討論于隨后的實施例中。然而，本領域技術人員應當理解該方法不限于該例證 的具體說明，使用該方法學可類似地探明其他原核或真核表型以達到基本上任何目標性狀 的表型改變。1.構建定制η [圈套]文庫產生這些片段方法的示意圖示于圖4中。以DNA中每條順式調節序列都應呈現在 文庫中的這樣一種方式，由大片DNA創建η[圈套]質粒文庫。在該圖中顯示基因組DNA或 基因組片段如生物合成簇通過超聲處理得以片段化，并通過用Taq聚合酶和dNTPs處理修 復游離末端以產生在DNA的3’末端帶有單dA突出端的末端。向這些末端連接生物素化接 頭，其包含用于附.81^(1(暗框)、1^1(亮框)的限制性位點以及互補的5，dT突出端。從 連接混合物中除去未連接的銜接頭后，用MmeI消化修飾片段，MmeI是一種切割其識別位點 下游第20/18個核苷酸、使將dT導入突出端的酶；所得到的分子由完整的生物素化銜接頭 加基因組DNA的19/17個核苷酸段組成，我們稱為‘圈套’。在鏈霉親合素包被的基質上捕 捉這些分子并變性以使上鏈(包含19nt段)附著于珠子上。現將更多的寡核苷酸退火用于 再創建Nt. BbvCI位點，以及隨后用酶消化以釋放由銜接頭的一部分加圈套序列組成的DNA 單鏈碎片。其用于隨后的步驟中來創建n[圈套]文庫。1. 1制備DNA片段從之前其業已克隆入的粘粒中分離含大約17kb的肉桂霉素生物合成簇的DNA片 段。對片段進行凝膠純化并超聲處理至500bp的平均長度(如通過在TBE/瓊脂糖凝膠上電 泳分析DNA整分試樣所判斷的)。在發生雙鏈斷裂的情況下，超聲處理產生了端接不同長度 的3，和5，突出端的DNA和平端DNA的非均一群體。為了將這些DNA轉變為由帶有3，dA 突出端的末端組成的均一群體，用Taq聚合酶處理DNA。1.2由基因組片段創建18個核苷酸長度的‘圈套’術語‘圈套’用于指來源于用于創建n[圈套]質粒的基因組序列片段的DNA的短 單鏈部分。使用標準方法，制備下列序列的生物素化銜接頭(這里P代表磷酸酯)并連接至 已處理過的DNA片段Nt. BbvCIMmeI5，-生物素-ggt ccg ggc cac ggt ggt cta cga gcctcagcc aggtcc gact-3'SEQ ID. 43' -agt egg tcc agg ctg-P-5' SEQ ID. 5然后使用Qiagen PCR純化試劑盒將DNA片段與未摻入的接頭相分離并重懸于 30μ1洗脫緩沖液(IOmM Tris. HCl ρΗ8)中。接著，將已改變的DNA片段在37°C于200 μ 1 體積的包含20單位MmeI限制酶(New England Biolabs)的反應緩沖液(補充50 μ M S-腺苷甲硫氨酸的Ix緩沖液4[New England Biolabs])中消化16小時。消化后，沉淀片段及在 12%非變性丙烯酰胺凝膠上分離并分析條帶。游離的銜接頭明顯可見，原因在于通過IIS 型限制酶MmeI的基因組片段的不對稱消化產生了銜接頭加19/16nt突出端的更慢遷移物 質。從凝膠上切下該條帶并使用標準技術回收片段。在上鏈上的19nt是摻入作為候選物 用于誘餌序列的n[圈套]質粒的遺傳物質一部分。由于這些片段是生物素化的，因此它們 被捕捉于包被有鏈霉親合素的順磁基質例如來自Dynal的M-280珠上。在0. 5M NaOH中然 后加熱至80°C變性這些珠上的DNA，并在Ix緩沖液4 (New England Biolabs)中洗滌所得 到的單鏈DNA。將IOOpmol如下序列的Bbv互補寡核苷酸(包含Nt. BbvCI位點，其帶下劃 線)5，_gga cct ggc tga ggc tcg tag acc acc gtg gcc egg acc_3，SEQ. ID. 6 退火 至被捕捉的單鏈DNA，以便制備用于Nt. BbvCI的限制性位點。在消化前，充分洗滌珠子以除 去任何未能連接的寡核苷酸。現在向混合物補充25U酶并在37°C溫育反應4小時，之后將 混合物加熱至60°C持續15分鐘變性帶切口 DNA。‘圈套’部分從珠上釋放而其余部分保留 (圖4)。在于磁力架上捕捉珠子后，回收來自上清液的DNA并如之前所描述的使用類似的 方法用于創建η[圈套]質粒。2.使用η[圈套]質粒文庫在抗生素肉桂霉素天然宿主中上調抗生素肉桂霉素產 生通過接合將創建自肉桂霉素生物合成簇的η[圈套]文庫導入肉桂鏈霉菌生產 株中，并在 R2YE 瓊脂上鋪板(Kieser 等(2000)Practical StreptomycesGenetics. John Innes Foundation)，并讓其生長3天。在肉桂鏈霉菌未進行處理或用包含空載體(不包含 同向重復)的供體菌株進行接合的情況下，進行平行對照實驗。這些對照容許估計‘暈圈’ 大小的平均尺寸和分布，使得η[圈套]處理的樣品中暈圈大小的測量值被用于確定統計學 顯著的過量生產株。在η[圈套]接合后體中暈圈大小增加的一個實例示于圖5。當在固 體R2YE培養基上鋪板時，肉桂鏈霉菌分泌抗生素肉桂霉素到瓊脂中，當生產菌落覆蓋(指 示)菌株培養物時，能殺死枯草芽孢桿菌細胞(左側)。該暈圈直徑用作所產生的肉桂霉 素量的度量。通過導入含來源于17. 083kb肉桂霉素生物合成簇的片段的η[圈套]文庫增 加了(肉桂霉素)產生。在通過接合導入文庫成員后，基于增加的肉桂霉素產生選擇克隆 (右)。使用該方法，有可能鑒定能上調抗生素產生的η[圈套]質粒，以及通過延伸發現 控制產生的肉桂霉素生物合成簇中關鍵順式調節序列。在一種應用中，在η[圈套]質粒中 或摻入TFD中的這樣的序列能用于操縱抗生素和其他工業上有價值的生物產品的產生。使 用該方法，我們已能增加之前鑒定的放線菌來源的化合物的產生水平(圖5)。這通常是天 然產物商業開發的主要障礙，并且該技術通過激活或大大增加所謂的“隱藏的”次生代謝基 因簇的表達(Zazopoulos (2003)Nat. Biotech. 21 :187_190)，從而適合于開發出放線菌類 的全部商業潛力，或一般而言對于工業生物技術增加產率。因此，預計該平臺技術有益于人 和動物衛生保健，并且其示范了基因組測序和基因組學開發的合作利用。實施例3一禾中#用ηΓ 1 t庫鑒定順式i周節元件的方法IU及因此#用工稈化的報道系 統用于修飾表型的誘餌
1.用η [圈套]文庫和cin7報道菌株鑒定肉桂霉素產生的調節子之前業已描述了肉桂霉素生物合成簇(Widdick和Bibb (2003)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :4316-4321)，并通過生物信息和遺傳分析證實了某些鑒定的基因的作用。已 知cin7基因之前加上控制編碼短蛋白(cinA)的cinMXTH操縱子轉錄的啟動子，該短蛋白 (cinA)經酶轉變產生肉桂霉素抗生素(SeanO’ Rourke和Mervyn Bibb，未發表的數據)。 我們創建了一種cin7啟動子驅動的報道系統，并將該構建體導入攜帶整個肉桂霉素生物 合成途徑的淺青紫鏈霉菌菌株(1326株)中。為了示范該方法，通過接合將肉桂霉素定制 η[圈套]文庫(實施例2中描述的)導入菌株中，并針對在正常致死濃度的卡那霉素中的 存活篩選接合后體。2.用η [圈套]文庫和基于報道基因的系統檢測負調節的方法如圖7中所示，靶定基因(cin7)的啟動子被置于賦予卡那霉素抗性的基因neo的 上游。在該圖中，來自肉桂鏈霉菌生產株的肉桂霉素生物合成簇的cin7基因的靶定啟動子 被用于驅動編碼對抗生素卡那霉素抗性的neo基因的表達。cin7啟動子中的順式調節序 列示為條“A”，轉錄阻抑物(橢圓形“B”)與其結合，使得下游neo基因無活性，從而該菌株 對卡那霉素敏感。通常，通過利用整合載體將該嵌合基因導入生產株的基因組中。將在這 種情況下創建自肉桂鏈霉菌基因組報道菌株分級DNA的定制η [圈套]文庫導入，并針對對 增加濃度的卡那霉素的抗性篩選轉化體/接合后體。將那些更具抗性的細胞轉入進一步分 析。因此，當在異源生產株淺青紫鏈霉菌1326的肉桂霉素生物合成簇中沒有或很少 轉錄時，cin7啟動子是轉錄惰性的且宿主細胞對卡那霉素選擇敏感，在低于5 μ g/ml的濃 度下，細胞死亡出現在包含具有無啟動子的編碼對卡那霉素抗性的neo基因的質粒的菌 株(Labes 等(1997)Microbiology 143:1503-1512)。cin7_neo 嵌合基因攜帶于整合質粒 上(基于 pSET152 骨架 Kieser 等(2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation)，該質粒還攜帶編碼對抗生素安普霉素抗性的aacC基因。我們通過本領域熟 知方法將盒導入淺青紫鏈霉菌1326株(包含肉桂霉素生物合成簇)中以創建帶有穩定整 合入基因組中的嵌合基因的新菌株(MM14)。通過標準方法將如實施例2中所描述的制備的 肉桂霉素-定制η[圈套]文庫導入MM14中以產生該文庫的孢子懸液。固定量孢子用于接 種 R3 液體培養基(Shirahama 等(1981) Agric. Biol. Chem. 45 :1271_1273)并監測在增加濃 度的卡那霉素存在下的生長。通過從培養物中取出相同體積的整分試樣并將這些整分試樣 涂布在瓊脂平板(DNA瓊脂)上以測定菌落形成單位/ml培養物以及來自其的活細胞百分 數，從而測定每一濃度下細胞生存力。這些數據顯示在該實驗中，在650 μ g/ml卡那霉素下 生存力低于0. 01%，其被估計折合為在50ml培養物中的1200個菌落形成單位。這被認為 是卡那霉素的最適濃度，因為對于那些具有增加的對抗生素抗性的細胞其大大富集了，產 生易管理的細胞數目。在150 μ g/ml處的生存力為85%，建立了 cin7-neo構建體的基線活 性。進行文庫雜交步驟。在該實施例中，在四個獨立的重復中，MM14株接合肉桂霉素定 制文庫。以經驗為主確定卡那霉素對于每一重復的最適濃度。最后，將來自在最適濃度下存 活的每一重復的96個克隆在R3培養基中培養，接著分成兩份整分試樣。從其中一份，使用 標準方法自細胞提取質粒，務必要防止RNA或基因組DNA污染。然后，根據標準方法(Roche手冊)使用DIG標記的dUTP分子通過隨機引發PCR標記質粒DNA，以創建探針(Probe)樣 品。稀釋另一份整分試樣并以單個菌落能清楚可見的濃度涂布在DNA瓊脂平板上。平板在 30°C溫育16小時，之后菌落仍保持蠟狀稠度并尚未變硬。用牙簽弄碎96個這樣的菌落，首 先用于制備在第二 DNA平板(補充50 μ g/ml安普霉素)上的劃線，然后在25 μ 1 二甲亞砜 (DMSO)中混合，加熱至95°C，持續10分鐘，接著冷卻以產生來源于克隆的總DNA溶液。對 劃線和DNA溶液編號，使得如果隨后發現DNA樣品含有候選n[圈套]質粒，則可容易回收 能活的接合后體(MM14株加n[圈套]質粒)。為鑒定真正能干擾轉錄的n[圈套]質粒(為將形成相當大部分的總信號的‘背 景’成員與真正能干擾轉錄的n[圈套]質粒相區分)，開發了文庫雜交策略。在該實施例 中，使用標準方法，對來自每一重復的96個克隆的DNA樣品進行處理并與尼龍膜雜交，各自 具有可編址的位置。該推行策略示于圖9中。對于每一重復，制備四張這樣的濾膜(F1、F2、 F3和F4，分別來源于每一重復)，然后分別與不同的探針雜交，使得最終所有的探針組都與 每張濾膜雜交。Pl和Fl的雜交檢測了每個樣品都得到檢測的色譜圖。由于在文庫中多次 出現的η[圈套]序列相應地更亮，因此檢測不被預期為同質的。在該實施例中，Pl和Ρ2與 F3和F4的雜交檢測了所有文庫所共有的樣品。這些樣品應被認為是用于繼續研究的有力 候選物。這樣的篩選的示范性數據示于圖10中。在該實施例中，用報道菌株測試兩個獨 立重復的肉桂霉素文庫，并且來自每一重復的96個最大卡那霉素抗性克隆用于制備包含 每一重復(Fl和F2)中的η[圈套]質粒的濾膜，及兩個相應的探針組(Pl和Ρ2)。所有通 過交叉雜交(Fl對Ρ2以及F2對Pl)鑒定的克隆被認為是有力候選物，并給予在兩次交叉 雜交實驗中所共有的那些(紅圈)以優先權。所研究的6個克隆中3個克隆的序列鑒別了 cin7啟動子的一部分以及另兩個圍繞來自肉桂霉素簇中另一基因cinR(已被提議具有簇 調節作用)的潛在順式調節子周圍。最后一個克隆序列未被鑒定并推測來源于淺青紫鏈霉 菌染色體或是人工制造的。在某些情況下，Pl與Fl雜交以及其它的自雜交實驗能夠檢測由于例如真核文庫 中重復序列的富集所引起的假陽性克隆。由于這些假陽性克隆在文庫中的豐度，因此它們 會產生很強的信號，即大于可預期在文庫中出現不止一次但并不是如重復DNA(該類型可 占人基因組10%質量)一樣出現許多次的真陽性。3.使報道基因適合于檢測正調節通過創建由摻入受靶定啟動子驅動的葡萄糖激酶基因(glkA)編碼序列的嵌合報 道基因組成的盒，一種簡單的改變用于使報道系統能檢測正調節。該酶將代謝物2-脫氧葡 萄糖(DOG)轉變為有毒的、磷酸化形式的化合物。因此，通過制備由連接glkA基因的cin7 啟動子組成的嵌合報道基因并將其穩定地整合入含glkA-缺失的淺青紫鏈霉菌菌株中，就 提供了這樣的報道系統(圖8)。在該實驗環境中，使用淺青紫鏈霉菌TK24株。其不含有肉桂霉素生物合成簇(用 于檢測控制產生的負順式調節元件的菌株也如此)，因而cin7啟動子的任何活性均應歸因 于來源于淺青紫鏈霉菌基因組的正調節子。因此，通過在該背景中搜尋正順式調節序列，應 會從淺青紫鏈霉菌宿主的染色體中發現異源表達的上調節子。滴定這些正調節子離開cin7 啟動子并落在η[圈套]質粒上，阻止了 glkA表達，從而細胞在DOG存在下生長。迄今已經做了相當多的工作，使用常規遺傳篩選來檢測這樣的異源產生通用調節子，該異源產生可 由轉錄機某些成分例如ο因子和翻譯機成分的過量表達引起。此外，已知為SARP的一類 轉錄因子(Butler 等(2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 61 :512_516)已被鑒定，并且這 些轉錄因子結合的順式調節元件是用于該篩選的潛在靶標。以與之前所描述的相同的方式 進行篩選，具有類似的優點與高通量處理相容、標準化方法以及易于可評價的表型。實施例4一種使用n「圈套1文庫鑒定順式調節元件的方法以及因此用于在不定的遺傳系 統中改變表型的誘餌1.創建基因組η [圈套]文庫超聲處理純化的大腸桿菌Κ12株基因組DNA以給出500bp的平均尺寸。然后如實 施例2中所描述的處理該片段配上包含適宜的限制性位點的生物素化接頭，消化以產生 銜接頭加19/17個核苷酸突出端，在鏈霉親合素基質上被捕捉，之后限制酶切和變性以釋 放包含銜接頭一部分加19個核苷酸突出端的單鏈DNA片段。然后，使用如實施例2中所描 述的技術，將這些類型的分子用于創建n[圈套]質粒文庫。考慮到用于構建11[圈套]文庫的基因組和片段的大小，一種版本的大腸桿菌K12 基因組η [圈套]文庫(以下稱為‘Κ12文庫’)估計具有1，560，000個成員，使用標準分析 相應于高達99. 8%的全基因組覆蓋。因此如果在創建文庫中不存在序列偏愛，則三個獨立 版本的Κ12文庫就應當提供對基因組的完全覆蓋。為了評估在文庫中是否存在任何偏愛， 從所述在液體培養中生長的整分試樣中分離質粒。用EcoRI消化該質粒混合物以再生用于 創建η[圈套]文庫的片段，并對這些片段進行MmeI消化來證實已運轉的構建分子生物學 正如所料，插入片段是大尺寸的且這些插入片段在MmeI完全消化下瓦解為30bp單體(圖 11)，而部分消化則產生具有30bp重復的多聚體大小的中間產物。質粒集合的測序清楚地 證實了來源于銜接頭的‘間隔’元件的序列以及該間隔在超過至少10個拷貝上保持得很 好。正如所料，質粒集合的‘圈套’部分實質上是在19個位置的任何一個位置上具有很小 核苷酸偏愛的隨機序列。2.創建通用η [圈套]文庫合成具有如下序列的寡核苷酸5，_ 粦酸酉旨_aat acg act cac tat agg gnn nnn nnn ngc ggc cgc~3'SEQ. ID. 7 這里針對NotI的限制性位點顯示帶下劃線，以及隨機化核苷酸為‘η’所代表。在該實施例 中，隨機化核苷酸的數目為9，但該數目可以改變。還可以改變為可變區所編碼的序列的類 型，例如通過在該序列中包含恒定區(即側接可變序列的規定的核心序列)，或通過向可變 區中導入核苷酸偏愛(即通過規定60%的機會‘η’應當是dGTP或dCTP以創建具有更高 GC含量的隨機序列)。用該包含隨機化序列的寡核苷酸創建11[圈套]質粒的方案，以及因 此的通用η [圈套]文庫都與實施例2中給出的相同。我們在此將這些來源于隨機化寡核 苷酸的η[圈套]文庫稱為通用文庫。發現一種版本的文庫的滴度超過2百萬。使用標準分析，這樣滴度的文庫會包含 所有可能的9bp序列組合的置信度應為7. 5xl05。然而，感覺到不見得這樣的文庫會一直是 真正通用的，因為由于許多原因某些序列會從文庫中耗盡，例如集合中包含MmeI或NotI位 點的那些序列或具有大量二級結構的序列及富GC序列的PCR偏愛。然而，應當理解所業已創建的具有可能性成為真正且全面的潛在的順式調節序列集合以用于n[圈套]文庫方法 中。3.使用n[圈套]文庫檢測具有未明確遺傳網絡的表型的順式調節子的方法用基因組11[圈套]文庫或一種版本的通用文庫轉化大腸桿菌K12株并以液體培 養物生長。當如通過讀取培養物吸光度(0.4的々_讀數)所估計的生長達到對數中期時， 將整分試樣用于接種沒有補充溶劑或補充0. 5% -5%不同濃度的丁醇的培養基。將該培養 物進一步溫育1小時，然后測定菌落形成單位以便計算細胞生存力。從其中生存力已減少 10，000倍(至0.01%或更小)的培養物中分離細胞并在不含溶劑的培養基中洗滌，然后用 于再接種無溶劑的新鮮培養基。重復該實驗循環；該培養物生長至0. 4的密度并用于接種 補充增加濃度的丁醇的培養基。該過程重復4次，每次均測量細胞生存力(圖12)。選擇 過程的反復操作(意味著在經丁醇一次傳代后來自現有成員的文庫被提取并用于轉化大 腸桿菌K12)增加了作為選擇過程重復次數函數的生存力計數。沒用K12n[圈套]文庫處 理的大腸桿菌被指定為‘0’ (為實心菱形所代表)，那些具有1次處理的為實心正方形所代 表，那些具有2次處理的則為實心三角形所代表，那些具有3次處理的為空心圓形所代表以 及那些具有4次處理的為星號所代表。變得明顯可見的是，當在高濃度丁醇存在下培養時， 與由不帶有η[圈套]插入片段的質粒骨架組成的對照轉化或未轉化的相比，用任何η[圈 套]文庫轉化的細菌給出了基本上更高的細胞生存力計數。此外，變得明顯可見的是該選 擇過程的反復操作增加了作為選擇過程重復次數函數的生存力計數。大腸桿菌Κ12常規文庫較通用η [圈套]文庫執行得更好，與該文庫對該菌株基因 組更具代表性相一致。實施例5用 秀餌;Kt亥苷Ilt藥縱并T解天藍代鋪glfA3 (2) Φ抗生素產牛關于這一點業已描述的是一套鑒定牽涉表型控制的關鍵順式調節序列的革新方 法。該技術可普遍適用于所有生物體。接下來證實這些序列的知識可用于創建能體內修飾 基因表達的工具。這些工具再次在所有生物體中起作用，但是下列實施例的焦點在于在原 核生物中使用。調整轉錄因子誘餌法用于原核生物，并顯示是一種動用η[圈套]方案產生 的信息來開發能修飾基因表達的系統的有效方法。這兩種方法的組合在此稱為“調節工程 化”。在下文實施例中，通過新定位方法確定影響天藍色鏈霉菌中抗生素產生的順式調 節序列，并將這些序列用于設計誘餌寡核苷酸。通過導入天藍色鏈霉菌中并監測它們的攝 取、穩定性和抗生素產生效果，從而測試誘餌。所使用的方法的完整描述在實施例7中給
出ο1.定位actII-orf4啟動子中的調節元件通過體內DNA酶I/T7外切核酸酶定位研究控制actII-orf4表達的DNA-蛋白相 互作用。該方法被開發來鑒定順式作用調節元件的邊界，使得推斷的序列能用于設計誘餌 寡核苷酸用于功能研究。該方法的圖解概述在圖13中給出。為定位DNA-蛋白復合物在天 藍色鏈霉菌基因組中特定位置處的體內邊界，將高濃度的DNA酶I和T7外切核酸酶添加到 新鮮收獲的細胞。DNA酶I將‘切口 ’導入復合物周圍的DNA中，然后用作T7外切核酸酶的 5’ _3’外切核酸酶活性的底物。因此，酶的聯合作用標定了復合物的5’邊界。從處理的細
57胞中回收DNA，并通過與摻入生物素化接頭的啟動子PCR片段的固定鏈雜交捕捉來自靶定 啟動子(aCtII-orf4)的片段。使用與生物素化接頭雜交的第二 DIG非放射性標記的引物 (摻入地高辛，DIG[Roche])，通過進行PCR反應定位這群被捕捉的片段中邊界的位置。通 過PAGE和化學發光檢測測定標記產物的大小。使用在相反末端帶有生物素化接頭的PCR 產物，以類似方式定位了相反鏈上的邊界。在12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后對標記的PCR片 段進行大小分級，并在化學發光檢測后確定片段的存在和它們的大小。足跡法中T7外切核 酸酶和DNA酶I的新組合容許檢測啟動子區中DNA-蛋白復合物的所有邊界，而不僅僅是那 些最接近所選擇的限制性位點的邊界。由于我們的目標在于發現涉及aCtII-0rf4表達抑制的調節元件，因此我們定位 了在豐富液體培養基(R5)中轉錄下調的啟動子。在這些條件下，阻抑物可占用啟動子并 阻止表達。通過測定細胞密度(培養物的A4J導出生長曲線，并測定兩種有色抗生素(藍 色的放線菌紫素和紅色的i^一烷基靈菌紅素[Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation]產量和actII_orf4的轉錄活性。后者已知在生長晚 期被誘導，因此在放線菌紫素產生的視覺上可檢測到的開始(圖14A中箭頭所指示的)之 前收獲用于定位的樣品。在可見的放線菌紫素產生之前的時間點(箭頭指示的)，從生長 于豐富(R5)培養基的培養物中收獲天藍色鏈霉菌M145細胞。自始至終監測細胞生長(菱 形)以及放線菌紫素(三角形)和十一烷基靈菌紅素(圓形)產生。以經驗為主確定消化 所需的酶量，需要仔細優化DNA酶I濃度。例如，過量的DNA酶I導致信號透明度損失，原 因在于在DNA-蛋白復合物中切割，而太少的酶對于定位是無效的。在大多數情況下每次反 應250U T7外切核酸酶運作良好；如果酶不是高加工活性(processive)，也不是在最適緩 沖液中進行消化，則必需添加過量的酶。如圖13中所描述的，在兩條鏈上定位邊界，并在 通過12%非變性PAGE的大小分析，繼之以DIG標記產物的化學發光檢測后確定它們的位 置(圖14B)，以及通過與標準尺寸梯比較，有可能確定轉錄沉默的aCtII-0rf4啟動子區中 DNA-蛋白復合物的邊界(圖14C)。該aCtII-orf4啟動子的序列顯示了推定的順式調節元 件的位置(相對于在定位方案中所使用的引物方案)。加框區指示上游基因(aCtII-orf3) 和actII-0rf4自身的編碼序列。用大寫字母表示的序列標記了候選調節元件，上方顯示它 們的名字。加下劃線序列指示對于aCtII-0rf4啟動子的-35和-10框，星號顯示轉錄起始 位點位置，以及會聚箭頭指示存在于A24. 4中的反向重復。我們將通過這些區所界定的序列稱為調節元件，總共看到了五個調節元件。該調 節元件是標記為A24. 1-A24. 5 (朝向轉錄起始位點)并且這些序列被用于設計在隨后功能 研究中使用的誘餌寡核苷酸。2.在瓊脂平板上快速篩選誘餌功能我們開發了一種快速的基于瓊脂平板的測定法來測試誘餌是否對抗生素產生具 有任何作用。使用R2YE瓊脂，原因在于其促進了兩種有色抗生素在肉眼容易可檢測到的水 平上的產生。用稀釋的孢子懸液接種平板并在30°C溫育24小時，使得形成鋪滿的天藍色 鏈霉菌菌苔。在該階段，十一烷基靈菌紅素(其是紅色)開始產生而放線菌紫素(其是藍 色)則沒有產生。用處于0.5%瓊脂糖中的薄層SNA覆蓋平板，并在該放置前，如圖15中 所示的將小片Whatman紙(抗生素測定片)放在培養基上并用15 μ 1 IOpmol/μ 1誘餌寡 核苷酸溶液或對照溶液飽和。濾紙片用誘餌溶液或作為對照的緩沖液(如所示的)飽和并施加到覆蓋SNA培養基(軟營養瓊脂0. 5% Difco瓊脂w/v)的天藍色鏈霉菌M145菌苔 上。由于細菌持續生長，因此增加的抗生素產生的出現可通過片中和周圍早期積累的有色 抗生素識別(在添加誘餌后48小時明顯可見)。陰性對照(僅緩沖液或‘打亂順序’形式 的誘餌A24.5)并不顯示過早的產生。所有樣品均在包含0.5% (ν/ν)的發現改善轉染效 率的兩種非離子型去污劑ΝΡ-40和Triton X_100的緩沖液中制備。對照由單獨的緩沖液 或A24. 5誘餌序列被隨機化的打亂順序的誘餌寡核苷酸組成。平板進一步在30°C溫育并 定期檢查以確定是否對抗生素產生的量或時機有任何影響。在浸透A24. 5的片周圍看見紫 色/紅色暈圈，而A24. 3和誘餌A24. 1-A24. 4混合物程度較低(圖15，48小時；盡管暈圈在 分泌的十一烷基靈菌紅素的背景上清楚可見，由于該分子用作PH指示劑，因此在較早時間 點放線菌紫素呈紅色)。為證實放線菌紫素合成已開始，在48小時處回收片，提取色素并 用分光光度計定量；誘餌A24. 5強烈激活了早期放線菌紫素產生，而A24. 3和誘餌混合物則 程度較低(數據未顯示)。在對照片周圍沒有看到早期放線菌紫素產生。到96小時，全部 的天藍色鏈霉菌M145菌苔都產生大量的這兩種抗生素(未顯示)，在任一片周圍無明顯的 生長帶抑制。在早期時間點某些誘餌增加放線菌紫素產生的能力(可能是通過干擾阻抑物 與actII-0rf4啟動子區中它們的識別位點的結合)證實了該方法的有效性并激勵我們通 過將誘餌導入在液體培養中生長的細胞中去進行更徹底的功能研究。3.在液體培養中誘餌的攝取和穩定性下一個要解決的問題是在液體培養物中誘餌是否能有效地導入菌絲體中，以及如 果可以的話，其能堅持多久？在SMM培養基(Kieser等(2000) Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation)中建立天藍色鏈霉菌M145的六份液體培養物并培養 至指數中期。通過輕度離心收集細胞并重懸于1/10原始體積的滲透性緩沖液(包含與平 板測定法中所使用的相同濃度的去污劑)中，之后用不同量的誘餌A24. l(0mM、5mM、10mM、 20mM、50mM和IOOmM)轉染。在短暫的溫育后，將細胞重懸于保留的培養基中并繼續溫育。使 用設計成能擴增跨過在 鈴狀誘餌形成中導入的連接部分的小片段(40bp)的引物，通過 qrt-PCR測定誘餌寡核苷酸的攝取。參考標準曲線用于計算存在于細胞中的誘餌拷貝的絕 對數目(在離心和兩個洗滌步驟后)，并通過參考基因組對照校正該數目。為評價穩定性， 在不同的時間點(0-72小時)提取整分試樣。濃度超過20mM攝取率飽和。用20mM轉染2 小時達到最佳攝取，此后45%的誘餌進入細胞(圖16)。用包含誘餌的溶液轉染活躍生長 的細胞，并通過定量實時PCR(qrt-PCR)估計寡核苷酸的攝取及其穩定性。在用20mM A24. 1 轉染后，收獲并洗滌細胞，之后使用qrt-PCR來評估保留在細胞中的誘餌拷貝，作為時間的 函數。數據代表三次獨立的測定值。在添加后72小時，可在細胞內檢測到誘餌，36小時后 22% (相當于一半進入了細胞)保留。由于當接近靜止期時轉染培養物，因此與由于稀釋 而損失相反，設想誘餌為內源核酸酶所緩慢降解。因此，誘餌能進入菌絲體并持續一段長時 間，暗示該方法能用于改變液體培養物中的基因表達。4.使用誘餌寡核苷酸控制抗生素產生將相應于所鑒定的調節元件的五種誘餌用于轉染在R5或SMM液體培養基中生長 的天藍色鏈霉菌M145液體培養物。轉染時間安排在aCtII-0rf4表達之前，這樣誘餌具有 與它們的關連轉錄因子相互作用并潛在影響放線菌紫素產生的機會。對照實驗類似于那些 在平板測定法中所使用的，并由假轉染操作或導入三種打亂順序的誘餌(基于誘餌A24. 1、A24. 3和A24. 5的序列)組成。在每次實驗中，在轉染后固定間隔測定培養物的生長以及有 色抗生素的產量和aCtII-0rf4的表達。沒有一種誘餌改變細胞的生長，但某些對放線菌紫 素的產生具有影響，以及在某些情況下，對十一烷基靈菌紅素具有影響。在R5培養基中，在 抗生素產量相對高的情況下，誘餌A24. 5上調放線菌紫素產量，在96小時時間點增加產率 95% (圖17A和B)。在用㈧無誘餌對照或用(B) A24. 5誘餌轉染(箭頭指示的)前天藍 色鏈霉菌M145生長20小時。在兩種培養物中細胞生長(菱形)和所產生的十一烷基靈菌 紅素的量(圓形)相似，所看到的唯一不同之處在于放線菌紫素的積累(三角形)，在用誘 餌A24. 5處理后刺激該積累。數據代表三次獨立測定的平均值以及長條顯示了標準誤差。 誘餌A24. 1和A24. 3具有較溫和的作用，導致兩種有色抗生素上調。在所有放線菌紫素產 生存在增加的處理中，actII-orf4表達的絕對水平也相應增加(通過qrt-PCR測定的；數 據未顯示)。因此，該結果很大程度與那些在平板上所看到的相一致，暗示誘餌的作用是特 異且可預測的。還在SMM培養基(一種較R5支持較少抗生素產生的基本培養基)中測試 誘餌。用誘餌A24. 5轉染導致放線菌紫素產生加倍(圖18A和B)。比較用(A)假轉染的對 照和(B)誘餌A24. 5處理的培養物獲得的數據，揭示了誘餌寡核苷酸導致顯著增加的放線 菌紫素產生。該數據呈現于圖17中并且是三次獨立測定的平均值；長條顯示了標準誤差。 在該培養基中，對于誘餌A24.1和A24. 3也看到了放線菌紫素產生增加(數據未顯示)。因 此，誘餌充當便利工具以驗證對actll-0rf4啟動子中順式作用調節元件的鑒別，容許我們 影響抗生素產生的開始。如上所指出的，一些誘餌還上調節了十一烷基靈菌紅素產生，下文 解決這種共調節的可能原因。5.發現放線菌紫素產生的新修飾物新定位技術和誘餌寡核苷酸的組合業已用于驗證三種控制放線菌紫素調節基因 actII-orf4表達的調節元件。我們接下來要問是否這些調節基序存在于任何其他基因的 啟動子區中；這樣的基因是否還可能涉及抗生素產生的調節。用所有5條誘餌序列進行 BLAST搜索鑒定了一條這樣的基因。SC05812包含與A24. 1( —次運行14個中有10個)和 A24.3( —次運行18個中有11個)的強匹配。該基因自身是一種可能的核糖核酸酶HII同源 物，因而可具有與之前所鑒定的在抗生素產生中的多效突變體absB(SC05572 ；Adamidis和 Champness (1992) J. Bacteriol. 174 4622-4628)類似的功能，該多效突變體 absB 是 RNA 酶 III的同源物并被認為涉及轉錄物加工(Chang等(2005) J. Biol. Chem. 280 :33213_33219)。 為確定SC05812在抗生素產生中的該作用，如果有的話，我們從M145中缺失該基因并在R5 和SMMS培養基上與親本菌株比較(抗生素)產生(圖19)。在該圖中，M145(平板左側) 和M145ASC05812(平板右側)在(A) R5瓊脂培養基或(B) SMMS瓊脂培養基上劃線并分別 溫育72小時和96小時。雖然SC05812缺失戲劇性地減少了 R5瓊脂上放線菌紫素產生，但 是其增加了 SMMS上十一烷基靈菌紅素產生。有趣的是注意到用A24. 1或A24. 3轉染的細 胞顯示輕微的上調十一烷基靈菌紅素產生，暗示結合這些位點的轉錄因子可能影響這兩種 抗生素生物合成基因簇的表達。所測試的誘餌之一，A24. 4，其包含6bp反向重復(圖14)， 被發現在redD (十一烷基靈菌紅素生物合成簇的途徑特異性激活基因)(Takano等(1992) Mol. Microbiol. 6 =2797-2804)的啟動子區中具匹配(12個中有8個)。該基序被預測為擬 核蛋白IHF結合位點(基于與之前鑒定的位點的序列同源性)，提升了該位點在核蛋白復合 物中具有結構作用而非直接影響轉錄的可能性。
6.總結我們已使用新的技術來鑒定并驗證了針對天藍色鏈霉菌中抗生素產生阻抑物的 結合位點。用誘餌寡核苷酸進行驗證這些調節元件拷貝的轉染導致靶定基因去阻遏并增 加了放線菌紫素產生。我們工作的意圖在于證明誘餌寡核苷酸可以是一種在原核生物中快 速描繪遺傳網絡的有價值的工具。其已成功了嗎？在兩重意義上其已成功了。所測試的五 種誘餌中的三種顯示預期的活性。近來，具有最強效應的誘餌A24. 5已顯示當啟動子有活 性時與 TetR 樣轉錄調節子 AtrA 結合(Uguru 等(2005) Mol. Microbiol. 58 131-150)。使用 親和純化來鑒定aCtII-orf4阻抑物的我們自己的工作已同樣地鑒定了結合該位點的TetR 樣轉錄因子；我們的設想是由于誘餌A24. 5在actII-orf4轉錄前添加，因此容許通過減少 這些推定的阻抑物的結合而表達。7.材料和方法7. 1菌株和生長條件涉及鏈霉菌處理常規技術的標準文獻是Kieser等(2000) PracticalStreptomyces Genetics. John Innes Foundation。通過熱處理并于 30°C在 SMM 或R5培養基中生長，帶以連續搖動，讓天藍色鏈霉菌A3 (2) M145株孢子同步萌發。如之前 所描述的測定培養物的生長和放線菌紫素產生。R2YE和SNA用于誘餌誘導的抗生素產生 的瓊脂平板測定法。通過PCR尋靶實現SC05812的缺失(Gust等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100 1541-1546)。7. 2體內T7外切核酸酶作圖在用足跡法試劑處理前，向天藍色鏈霉菌菌絲體片段培養物補充0. 5mMCaC12和 50單位DNA酶I (以除去胞外DNA)并在30°C進一步溫育15分鐘。通過低速離心收獲菌絲 體并在補充5mM EDTA的TES緩沖液(13)中充分洗滌。對于DNA酶I足跡法，細胞在補充 0. 5% (v/v)NP-40 和 0. 5% (v/v)Triton X-100 的 TES 中洗滌，并在 30°C溫育 15 分鐘。然 后，在預熱至30°C的DNA酶I消化緩沖液(DDB)中洗滌細胞，并用不同量的DNA酶I消化 5分鐘。通過添加等體積的終止緩沖液(50mM Tris. HCl, 5mM EDTA,0. 2% (w/v) SDS, IOmg/ ml蛋白酶K，pH8)并在55°C溫育過夜終止反應。在兩輪苯酚-氯仿提取后，乙醇沉淀核酸。 用RNA酶A消化樣品，之后再沉淀和定量。7. 3誘餌寡核苷酸研究所使用的所有寡核苷酸的序列均列在表1中。合成誘餌寡核苷酸(Invitrogen) 并用 CircLigase(Epicentre)連接以創建啞鈴狀體(Mann 和 Dzau(2000) J. Clin. Investigation 106:1071-1075)。在 20 μ 1 反應體積的補充 50 μ ΜΑΤΡ，2. 5mM MnC12，500U CircLigase的Ix CircLigase緩沖液中混合IOOpmol每種誘餌寡核苷酸，并在60°C溫育1 小時。用過量的外切核酸酶I處理混合物以除去線型DNA，并沉淀殘留的共價環。通過12% 非變性凝膠電泳分析每一制備物來檢查大多數產物是單價共價環。將樣品以200ρπιΟ1/μ 1 重懸于TE(10mM Tris-HCl,ρΗ 8. 0，ImM EDTA)緩沖液中，10 μ 1每種誘餌點在3mm抗生素測 定片上，然后將片輕輕地壓入已傾注24小時齡的在R2YE瓊脂平板上生長的天藍色鏈霉菌 M145的匯合菌苔的SNA瓊脂薄層中。抗生素產生的誘導會導致片周圍著色局部增加。可選 地，啞鈴狀誘餌寡核苷酸用于轉染來自天藍色鏈霉菌M145的指數生長的培養物的菌絲體。 轉染包括在等體積的補充0. 5% (v/v)NP-40和0. 5% (v/v)Triton X-100的TES緩沖液中洗滌細胞，然后將它們重懸于1/10它們原始體積的TES加去污劑中，并補充誘餌寡核苷酸。 細胞在30°C溫育15分鐘帶以輕柔混合，在保留的培養基中稀釋并繼續溫育。在該處理后生 長速率暫時減慢但不久后恢復。其后采集樣品來評估兩種有色抗生素即放線菌紫素和十一 烷基靈菌紅素(13)產生的量。同時提取樣品用于RNA分析。7. 4基因表達和誘餌拷貝數分析通過定量實時PCR (qrt-PCR)進行表達分析。如之前所述的進行cDNA的制備 (Ryding 等(2002) J. Bacteriol. 184 794-805)。簡言之，熱變性 1 μ gRNA(在 70 °C 溫 育10分鐘，然后置于冰上)并與處于20 μ 1廠商推薦的緩沖液中的0. 5U AVM逆轉錄酶 (Amersham),ImM dNTPs、25pmol定制引物混合。反應在三個相繼的溫度——45°C、50°C和 55°C下溫育各自30分鐘。在20 μ Iqrt-PCR反應物中4 μ 1該反應物用作模板，該qrt_PCR 反應物是在補充10% (v/v)DMSO ^P 25pmol用于靶基因(actII-orf4)的定制正向和反 向引物以及內標(SC04742，一種保守的假定蛋白，在微陣列分析后發現其表達顯示很小 ^ ^ [http://www. biomedcentral. com/1471-2164/8/261/abstract])的 Invitrogen 的 SYBRGreener反應混合物中制備的(表1)。在BioRad Chromo4機器上進行擴增和分析。使 用SYBR-綠檢測類似地進行誘餌拷貝數測定。引物被設計(表1)成能檢測環化誘餌寡核 苷酸，并通過超聲處理菌絲體并與已知量的外切核酸酶處理的誘餌進行比較從而測定它們 的拷貝數；通過參考存在的SC04742拷貝數，針對樣品中基因組數校正這些值。7. 5表1:寡核苷酸引物每條誘餌寡核苷酸中的順式調節序列皆帶下劃線。
q4742r5'- gccggtacttgtcgctctc- 3'20實施例6證實誘餌寡脫氧核苷酸可用于治療環境中以克服病原體中抗牛素抗件圖20中呈現了采用來鑒定能改變對萬古霉素敏感性或實際上在遺傳水平上業已 表征的其他抗生素抗性機制的誘餌的大體方法。該示意圖示范了 TFD如何用于對抗致病細 菌中的已知抗性機制。對規定的抗生素萬古霉素的抗性用作例子。這出現在屎腸球菌(一 種人病原體)和天藍色鏈霉菌菌株中。在這兩種細菌中，抗性為VanR蛋白所誘導的vanHAX 操縱子編碼。通過設計誘餌去干擾VanR與基因組中其關連位點的結合，有可能阻止vanHAX 的誘導，如此使得細菌對萬古霉素敏感。在該實施例中，在包含類似于病原體的抗性機制或 通過水平基因轉移移入模型中的真實機制的細菌(非病原體的)模型中，于功能上驗證了 誘餌。隨后，在致病模型如臨床分離株上測試誘餌并最終移入動物模型，例如感染萬古霉素 抗性腸球菌(VRE)或萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌的小鼠。應當理解該方法能應用于廣范 圍的為這樣的遺傳開關所控制的細菌表型。這些應用包括但不應限于發現其他能使細菌對 其他抗生素如青霉素、氯霉素、四環素、達托霉素等敏感的誘餌或誘餌組合。天藍色鏈霉菌中萬古霉素抗性操縱子的結構示于圖21 (來自Hong等 2004Molecular Microbiology 52:1107—1121)中。該萬古霉素操縱子由箭頭所示的四個 操縱子組成。vanRS操縱子編碼起感受萬古霉素存在(直接或間接地)并誘導編碼萬古霉 素抗性機制的vanHAX操縱子表達作用的二元調節系統。在檢測到萬古霉素時，vanHAX操 縱子為在其啟動子中結合的VanR的磷酸化形式所誘導，VanS又成為磷酸化VanR的激酶。 我們預計我們的誘餌破壞磷酸化VanR與vanH啟動子中位點的結合。應當指出導致臨床所見的某些萬古霉素抗性感染的糞腸球菌中抗性基因的進化 源被認為是產生萬古霉素的放線菌。所使用的VanH5誘餌的序列示于如下，磷酸化VanR的結合位點以大寫字母表示5， -P-ata tctatatgaa gcgacgtggt cgatgagccg cagcg tttt cgctg CGG CTC ATCGAC CAC GTC GCT TCA TAT AGA tatag tttt ct_3，SEQ ID. NO. 21將寡核苷酸制備為如圖22中所示的環狀 鈴狀誘餌。將該寡核苷酸在IOOpmol/ ul終濃度下重懸于T4DNA連接酶緩沖液(如酶廠商New EnglandBiolabs所提供的)和400U T4DNA連接酶中，并在16°C溫育不同時間。在溫育期間，由于連接酶活性而形成莖-環結構 的寡核苷酸可變成共價連接的單鏈‘環狀’ DNA分子。該環化程度取決于與連接酶的溫育 時間；最久的溫育(16小時)導致近乎完全的轉變。因此，在寡核苷酸與T4DNA連接酶溫育 0、1、2、4、6和16小時后(分別為a_f)，從每個反應中取出整分試樣，熱處理以滅活酶并通 過乙醇沉淀回收DNA，之后6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和用溴化乙錠染色顯影。泳道a-f 顯示了緩慢遷移的線型單鏈DNA分子到更高速遷移的環狀啞鈴狀閉環雙鏈體的轉變(泳道 f)。誘餌以‘環狀暖鈴狀，構型(AhnJD, Kim CD, Magae J, Kim YH, Kim HJ, Park KK, Hong S, Park K G, Lee IK, Chang YC(2003)Biochemical BiophysicalRes Comm 310 1048-1053)存在，盡管并不是必需的。可使用其他形式的寡脫氧核苷酸，包括但不限于例
63如(a)包含該序列的較長的雙鏈寡脫氧核苷酸，使得在損失誘餌功能前外切核酸酶需要充 分減少該寡核苷酸長度；(b)包含修飾的堿基或糖以賦予更大的核酸酶抗性的寡脫氧核苷 酸；(C)附著于寡核苷酸末端的2' -OH核苷酸或胺，其會阻斷外切核酸酶活性(其是所有 啞鈴狀體所做的)；(d)小的環狀雙鏈DNA分子；或(e)包含多拷貝活性誘餌序列的多聚體 分子。實質上，所需要的是所使用的ODN具有為小莖環結構或其它序列所框入的摻入 vanH啟動子中靶定序列的雙鏈區。對于環狀 鈴狀結構，將分子合成為線型寡核苷酸并通 過與T4DNA連接酶溫育環化。顯示將稱為VanH5的誘餌導入天藍色鏈霉菌M600株的液體培養物中的線圖在 圖23中給出。天藍色鏈霉菌M600株在液體MMCGT培養基(MolecularMicrobiology 52: 1107-1121)上生長，通過記錄430nm處培養物吸光度(細胞密度)測定生長，并作為溫育時 間的函數進行作圖。監測四種培養物的生長⑴什么都沒有添加的培養基(菱形‘M600’)； (2)在O小時培養基補充亞致死濃度的20 μ g/ml抗生素萬古霉素(正方形‘加20 μ g/ml VAN’ )；與(2)中一樣，但在溫育20小時后誘餌寡核苷酸H5添加至64pM終濃度(三角形 ‘VAN加64pM H5，)；與⑵中一樣，但在溫育20小時后誘餌寡核苷酸H5添加至256pM終 濃度(圓形‘VAN加256pM H5’ )。根據該數據，很明顯在20ug/ml萬古霉素存在或不存在(在培養過程開始時添加 或未添加的)下，M600可比較好的生長，證實了該菌株具有對萬古霉素的抗性。在20ug/ ml萬古霉素存在下，添加環化誘餌vanH5至64pM終濃度，具有幾乎不可檢測的效果，而添加 至256pM則導致細胞在大約18小時的一段時間內停止生長。這段時間可通俗地稱為“治療 窗”，在此誘餌進入細胞，干擾vanR調節子與vanH啟動子的結合，從而阻止抗性機制誘導。 在18小時后，我們從其它系統得到的證據暗示發生了誘餌降解(通過細胞中內切核酸酶)， 其可以影響它們的功效。至于為什么vanH誘餌看上去具有抑制細菌效應，我們認為這歸因于改變細菌細 胞壁阻止萬古霉素作用的抗性機制。當萬古霉素添加到培養物時，就是實驗開始時。在20 小時添加誘餌。在這一點上，細菌將生長出改變的細胞壁。在添加誘餌時，從該點直至誘餌 耗盡，改變細菌細胞壁的能力被阻斷。結果，盡管較老的細胞能堅持，但是致使任何新的細 菌生長都對萬古霉素敏感。在耗盡誘餌時，具有殘留萬古霉素抗性的堅持細胞能再次增殖。 在萬古霉素前添加誘餌效果會很小，因為抗性操縱子未開啟。然而，我們預期同時施用誘餌 ODN誘導殺細菌效應。因此，該實施例證實了在TFD存在而非它們不存在的情況下天藍色鏈霉菌對萬古 霉素的敏感性。這會為本領域技術人員接受為用于證實病原體如糞腸球菌中該作用的可接 受的替代物。屎腸球菌van操縱子受相同機制(vanR結合vanH)誘導，即使兩個系統之間 在序列水平上同源性不非常高。本領域技術人員應當能容易地改變誘餌序列以用于該病原 體中。VanH5誘餌是一種能結合原核轉錄因子、使得該轉錄因子與原核生物基因組中其 關連靶標結合減少或消除的寡脫氧核苷酸的實例。2.設計TFD對抗病原體中的抗生素抗性以上已討論了 TFD如何能用于恢復萬古霉素敏感性的原理。對于負責基因未知的情況，使用本發明提供的通用n[圈套]文庫或創建自病原體基因組DNA的定制文庫。如圖 6中所示，文庫或可在實驗室條件下導入致病細菌中，或可將決定抗性的遺傳元件克隆并導 入非致病實驗室菌株中用作模式系統，然后其可被轉化。接著該細胞在所選擇的抗生素不 存在下培養和通過轉化將文庫導入細胞中，當以液體培養物存在時，立刻平分樣品并添加 抗生素到一半的樣品中，繼續溫育。回收細胞群并通過PCR從質粒中擴增連環化的TFD。 這兩個群被相扣除以分離在抗生素處理的樣品中缺少的TFD，以及因此那些賦予敏感性的 TFD。再克隆該富集的TFD群并重復選擇過程直至其足夠富集能使細胞抗生素敏感的TFD。這樣的方法的潛在目標包括調查對許多臨床處方的抗生素抗性的機制，以及未來 的目標在于什么樣的抗生素抗性開始限制它們的功效。會被考慮使用η[圈套]方法學調 查并隨后用TFD處理以失效抗生素抗性的現用抗生素的實例包括那些來自已知為如下的 抗生素類氨基糖苷類(例如卡那霉素)；碳青霉烯類(例如美羅培南)；頭孢菌素類(例 如頭孢吡肟)；糖肽類(例如萬古霉素和達托霉素)；青霉素類(例如氨芐青霉素、羧芐青霉 素和青霉素)；多肽類抗生素(例如多粘菌素B)；喹啉類(例如左氧氟沙星)；磺胺類(例 如菌特靈)；四環素類(例如四環素)；以及各種抗生素，氯霉素、利福平、斯沃。實施例77. 1在鏈球菌溶血素-0存在下膽固醇標記TFD使用寡核苷酸引物，其中一種具有5’膽固醇修飾以及另一種在其5’末端或其他 地方具有類似修飾(例如熒光染料如Cy5，使得TFD的攝取能容易地測量)，通過PCR制備 TFD。如果TFD之前已被克隆入載體(pGEMT-Easy)中，則引物被設計成能退火至立刻側接 插入片段的載體序列，例如SEQ ID NO 22 Chol_TEf :5'Cholesterol-TEG-ggc cgc cat ggc ggc cgc gggaat tcSEQ ID NO :23Cy5_TEr :5，Cy5_AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAGTG.如果要被用于TFD的序列還未克隆，則其可直接合成(如果足夠短的話)并退火 形成TFD，或使用設計成能在TFD內退火的引物直接從基因組DNA擴增。乙醇沉淀PCR產物并以500-1000ng/ μ 1濃度重懸于TE緩沖液中。通常，使用96 孔板進行抗生素敏感性測定，每個孔包含200ml肉湯。例如，在屎腸球菌情況下，該肉湯是 補充0. 2U/ml鏈球菌溶血素-O(Sigma)和5 μ g/ml萬古霉素抗生素并接種屎腸球菌的萬古 霉素抗性株的BHI培養基(來自BectonDickinson)。7. 2通過PCR制備啞鈴狀體現鈴狀誘餌是共價閉合的單鏈DNA，特征在于包含靶定因子的結合位點的雙鏈中 心，側接莖-環結構。莖-環通過阻止了否則會降解誘餌多核苷酸的外切核酸酶起作用穩 定了誘餌。因此，由于它們的特征形狀如此稱呼啞鈴狀誘餌(DB)。如7. 1中所述，使用包含靶定結合位點的pGEMTEasy來源的質粒作為模板，通過 PCR制備DB。用于擴增的引物是(SEQ ID NO :24)DBTEf :5，P_CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC ccg ccatgg egg ccg egg gaa ttc(SEQ ID NO 25)DBTEr :P_CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGCGGC CGC GAA TTC ACT AGT GA.
引物會形成莖_環的部分加下劃線。用合適的載體進行擴增給出了圖24中所示 的DNA產物，其中DB中會結合轉錄因子的部分由‘NNN NNN'給出。該序列以粗體表示產生 切口的限制酶Nt. BspQl的結合位點。在圖24的第二部分中，顯示了用Nt. BspQl消化PCR 產物的結果；其將莖-環結構暴露為單鏈區，該單鏈區會形成莖-環并可隨后通過用T4DNA 連接酶處理進行連接以形成共價閉環和DB。7. 3通過限制性消化質粒制備啞鈴狀寡核苷酸可選地，可通過將圖24中所示的平端PCR產物克隆入合適的PCR克隆載體例如 pGEMTEasy中，證實其身份和制備質粒而得以制造DB。然后消化質粒以釋放插入物，該插入 物額外用Nt. BspQl消化以釋放圖24中第二部分所示的片段。這可類似地用T4DNA連接酶 處理以便共價閉合DNA分子并形成DB。該方法的優點在于當DB大量需要時在實踐和經濟上更能按比例放大。7. 4用R9-膽固醇劑轉染R9-膽固醇已被描述了其在真核細胞中幫助SiRNA(或其他基于核酸的療法)分子 等轉染的特性(美國專利20070207966)。在此，我們描述其在用TFD轉染不同細菌中的效用。如之前所描述的合成R9-膽固醇，其由附著于9個D-精氨酸的線型鏈上的膽固醇 分子組成(Kim W. J.等，Mol. Ther 200614 343-350)。將TFD與處于補充5%葡萄糖的基 于TE的緩沖液中的增加量的R9-膽固醇混合。在室溫下溫育該混合物1小時，然后用于在 轉染中直接使用或通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。通常，使用使得含DNA的復合物不在凝 膠上跑的最少量的R9-膽固醇；即核酸主鏈的電荷已通過與聚精氨酸結合而被中和。膽固 醇分子幫助TFD與細菌膜締合并因此進入細胞。在96孔板中，TFD/R9-膽固醇綴合物以不同濃度混合于200 μ 1培養物中。例如， 在屎腸球菌的情況下，該肉湯是補充0. 2U/ml鏈球菌溶血素-O(Sigma)和5 μ g/ml萬古霉 素抗生素并接種屎腸球菌的萬古霉素抗性株的BHI培養基(來自Becton Dickinson)。實施例8使用Van誘餌序列使屎腸球菌對萬古霉素致敏8 (a)在鏈球菌溶血素-0存在下使用膽固醇標記的TFD如實施例7. 1中制備膽固醇/Cy5標記的誘餌多核苷酸。該測定法使用96孔板來 進行，每個孔含200ml由補充0. 2U/ml鏈球菌溶血素-O(Sigma)和5 μ g/ml萬古霉素抗生素 并接種屎腸球菌的萬古霉素抗性株的BHI培養基(來自Becton Dickinson)組成的肉湯。將1μ 1不同濃度的膽固醇/Cy5標記的誘餌添加到每個孔中，并在溫育期間通過 不時測量肉湯的吸光度監測它們對屎腸球菌的細菌生長的影響。平板在37°C溫育帶以搖 動，并使用讀板儀采集吸光度讀數(在450nM處)。測試兩種誘餌VAN包含控制VanA型 抗生素抗性誘導的調節元件；CON是不存在于屎腸球菌基因組中并用作陰性對照的誘餌序 列。VAN誘餌序列的序列(克隆入pGEMT-Easy載體以創建用于使用Chol_TEf和Cy5_TEr 引物的PCR擴增步驟的質粒的部分)是VAN TFD 5，AAA AAA GAA TCA TCA TCT TAA GAA ATT CTT AGT CATTTA 3，(SEQ ID NO 26)所得到的生長曲線示于圖25中。所有的數據點都重復進行三次。顯然在低至40nM的濃度下用VAN TFD處理使得屎腸球菌菌株對萬古霉素再敏化，而CON陰性對照則無作用。 用qPCR和熒光顯微鏡檢術確認TFD的攝取。8 (b)用R9-膽固醇劑轉染該陣列使用96孔板，每個孔包含200ml培養物，由補充0. 2U/ml鏈球菌溶血 素-O(Sigma)和5 μ g/ml萬古霉素抗生素并接種屎腸球菌的萬古霉素抗性株的BHI培養基 (來自 Becton Dickinson)組成。將1 μ 1不同濃度的TFD/R9-膽固醇綴合物添加到每個孔中，并在溫育期間通過不 時測量肉湯的吸光度監測它們對細菌生長的影響。平板在37°C溫育帶以搖動，并使用讀板 儀采集吸光度讀數(在595nM處)。測試兩種啞鈴狀TFD =VAN包含控制VanA型抗生素抗 性誘導的調節元件(包含與Seq. 26相同的序列)；CON是不存在于屎腸球菌基因組中并用 作陰性對照的誘餌序列(包含與實施例8 (a)中CON相同的序列)。所得到的生長曲線示于圖26中。所有的數據點都重復進行三次。顯然在低至40nM 的濃度下用VAN TFD處理使得屎腸球菌菌株對萬古霉素再敏化，而陰性對照則對細胞生長 無負影響。
權利要求
誘餌多核苷酸在調控細胞抗生素抗性的方法中的應用，該方法包括(a)提供包含轉錄因子結合位點(誘餌序列)的誘餌多核苷酸；并(b)將該多核苷酸導入細胞中，其中細胞包含可操作地連接包含轉錄因子結合位點的順式調節序列的一種或更多種基因；其中多核苷酸的導入減少了細胞中轉錄因子與順式調節序列的結合并導致細胞中可操作地連接的一種或更多種基因表達的改變，從而調控細胞的抗生素抗性。
2.根據權利要求1的應用，其中細胞中可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基 因編碼對抗生素的抗性。
3.根據權利要求1或2的應用，用于調控對選自如下的一種或更多種的抗生素的抗 性氨基糖苷類；碳青霉烯類；頭孢菌素類；糖肽類；青霉素類；多肽類抗生素；喹啉類；磺 胺類；或四環素類。
4.根據權利要求3的應用，其中抗生素選自如下的一種或更多種卡那霉素、美羅培 南、頭孢吡肟、萬古霉素、達托霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、多粘菌素B、左氧氟沙 星、菌特靈(Bactrim)、四環素、氯霉素、利福平和斯沃(Zyvox)。
5.根據前述權利要求任一項的應用，其中可操作地連接順式調節序列的一種或更多種 基因編碼對萬古霉素的抗性。
6.根據權利要求5的應用，其中轉錄因子是VanR轉錄因子。
7.根據前述權利要求任一項的應用，其中細胞是(a)抗生素抗性的非致病模型；或(b)病原體。
8.根據前述權利要求任一項的應用，其中細胞是(a)選自如下的屬的革蘭氏陽性細菌放線菌屬；鏈霉菌屬；分枝桿菌屬；梭菌屬；芽 孢桿菌屬；李斯特氏菌屬；葡萄球菌屬；鏈球菌屬；腸球菌屬；或(b)選自如下的屬的革蘭氏陰性細菌腸桿菌科；假單胞菌屬；莫拉氏菌屬；螺桿菌屬； 寡養單胞菌屬；蛭弧菌屬；醋酸細菌；軍團菌屬；藍細菌屬；螺體屬；綠色硫細菌；和綠色無 硫細菌。
9.根據前述權利要求任一項的應用，其中細胞是選自如下的病原體結核分枝桿菌； 牛分枝桿菌；非洲分枝桿菌；田鼠分枝桿菌；麻風分枝桿菌；艱難梭菌；肉毒梭菌；產氣莢 膜梭菌；破傷風梭菌；沙門氏菌；大腸桿菌；屎腸球菌；糞腸球菌；淋病奈瑟氏菌；腦膜炎奈 瑟氏菌；卡他莫拉氏菌；流感嗜血桿菌；肺炎克雷伯氏菌；嗜肺軍團菌；銅綠假單胞菌；奇 異變形桿菌；陰溝腸桿菌；粘質沙雷氏桿菌；幽門螺桿菌；腸炎沙門氏菌；和傷寒沙門氏菌。
10.根據前述權利要求任一項的應用，其中細胞是萬古霉素抗性病原體或萬古霉素抗 性的非致病模型。
11.根據前述權利要求任一項的應用，其中誘餌多核苷酸中的轉錄因子結合位點不與 基因可操作地連接。
12.根據前述權利要求任一項的應用，其中誘餌多核苷酸包含環狀雙鏈DNA或線型寡 核苷酸；和/或至少一個二級結構元件；和/或多于一個拷貝的轉錄因子結合位點；和/或 附加到結合位點上的額外的序列；和/或增加多核苷酸核酸酶抗性的修飾的堿基或糖；和/ 或質粒或質粒文庫。
13.根據權利要求12的應用，其中誘餌多核苷酸包含環狀 鈴狀體。
14.根據權利要求12的應用，其中誘餌多核苷酸包含多個同向重復的結合位點。
15.根據權利要求12的應用，其中誘餌多核苷酸包含具有至少一個5’膽固醇修飾的線 型寡核苷酸。
16.根據權利要求12的應用，其中誘餌多核苷酸包含質粒以及其中該質粒具有一個或 更多個拷貝的包含圈套序列的單體序列，該圈套序列包含轉錄因子結合位點，其中結合位 點不與基因可操作地連接。
17.根據權利要求16的應用，其中質粒包含(a)2個或更多個或至少10、20或30個拷貝的單體序列；和/或(b)串聯重復的單體序列。
18.根據權利要求16或17的應用，其中單體額外包含(a)引物結合位點，其中該引物適用于滾環擴增；和/或(b)一種或更多種限制酶的識別和/或切割位點。
19.根據權利要求16-18任一項的應用，其中單體包含10-1000個或10-500個核苷酸。
20.根據權利要求16-19任一項的應用，其中圈套序列包含10-30個核苷酸或15-20個核苷酸。
21.根據權利要求16-20任一項的應用，其中質粒是廣宿主范圍或穿梭載體和/或是高 拷貝數質粒。
22.根據前述權利要求任一項的應用，其中誘餌多核苷酸中的轉錄因子結合位點包含 SEQ ID NO 21 或 SEQ ID NO 26 的序列。
23.一種包含轉錄因子結合位點的誘餌多核苷酸，其中轉錄因子是原核生物或真核生 物中一種或更多種抗生素抗性基因表達的調節子，以及其中誘餌多核苷酸中的結合位點不 與基因可操作地連接。
24.根據權利要求23的誘餌多核苷酸，其如權利要求12-22任一項所定義。
25.一種包含一個或更多個拷貝的單體序列的質粒，其中單體序列包含圈套序列，該圈 套序列包含轉錄因子結合位點，以及其中結合位點不與基因可操作地連接。
26.根據權利要求25的質粒，其包含(a)2個或更多個或至少10、20或30個拷貝的單體序列；和/或(b)串聯重復的單體序列。
27.根據權利要求25或26的質粒，其中單體額外包含(a)引物結合位點，其中該引物適用于滾環擴增；和/或(b)一種或更多種限制酶的識別和/或切割位點。
28.根據權利要求25-27任一項的質粒，其中單體包含10-1000個或10-500個核苷酸。
29.根據權利要求25-28任一項的質粒，其中圈套序列包含10-30個核苷酸或15-20個核苷酸。
30.根據權利要求25-29任一項的質粒，其中質粒是廣宿主范圍或穿梭載體和/或是高 拷貝數質粒。
31.根據權利要求25-30任一項的質粒，其用于原核細胞。
32.根據權利要求25-31任一項的質粒，其中轉錄因子結合位點包含順式調節序列或與之競爭轉錄因子結合，該順式調節序列調節編碼原核生物或真核生物中抗生素抗性的一 種或更多種基因的表達。
33.根據權利要求32的質粒，其中一種或更多種基因編碼對選自如下的一種或更多種 的抗生素的抗性氨基糖苷類；碳青霉烯類；頭孢菌素類；糖肽類；青霉素類；多肽類抗生 素；喹啉類；磺胺類；或四環素類。
34.根據權利要求33的質粒，其中抗生素選自如下的一種或更多種卡那霉素、美羅培 南、頭孢吡肟、萬古霉素、達托霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、多粘菌素B、左氧氟沙 星、菌特靈、四環素、氯霉素、利福平和斯沃。
35.根據權利要求34的質粒，其中轉錄因子是VanR轉錄因子。
36.根據權利要求35的質粒，其中轉錄因子結合位點包含SEQID N0:21或SEQ ID NO:26。
37.一種包含兩個或更多個的根據權利要求25-36任一項的質粒的質粒文庫，其中文 庫中的圈套序列共同包含原核生物或真核生物基因組DNA或基因組DNA片段中所有或基本 上所有的順式調節序列。
38.根據權利要求37的質粒文庫，其中基因組DNA或其片段包含編碼抗生素抗性的一 種或更多種基因。
39.一種包含兩個或更多個的根據權利要求25-36任一項的質粒的質粒文庫，其中每 個質粒中的圈套序列都包含長度η個核苷酸的隨機化核苷酸序列，其中基本上所有的長度 η個核苷酸的核苷酸序列都呈現在文庫中。
40.一種制備具有兩個或更多個拷貝的單體序列的質粒的方法，該方法包括(1)提供包含如下的環狀寡核苷酸(1)包含轉錄因子結合位點的目標測試序列；和( )適用于滾環擴增的引物的結合位點；其中單體序列包含(i)和(ii)；(2)使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多核苷 酸；并(3)將該多核苷酸克隆入質粒載體中。
41.根據權利要求40的方法，其中步驟(1)包括_提供包含如下的線型單鏈寡核苷酸目標測試序列(i)和適用于滾環擴增的引物的 結合位點(ii)；-環化寡核苷酸；-任選地用外切核酸酶消化殘留的線型DNA ；并-回收單體環狀寡核苷酸。
42.根據權利要求40或41的方法，用于制備根據權利要求25-36任一項的質粒或根 據權利要求37-39任一項的質粒文庫，其中目標測試序列(i)包含轉錄因子結合位點。
43.一種自基因組DNA樣品制備質粒文庫的方法，其中每個質粒都包含一個或更多個 拷貝的單體序列，以及其中每條單體序列都包含來源于基因組DNA的圈套序列；該方法包 括(1)提供包含編碼抗生素抗性的一種或更多種基因的雙鏈基因組DNA樣品；(2)片段化基因組DNA;(3)將銜接頭連接到來自(2)的DNA片段的每一末端上，其中每一銜接頭包含(iii)用于固定DNA片段的手段；(iv)在與該識別位點隔開一段距離切割的第一限制酶的識別位點； 禾口(ν)第二限制酶的識別和切割位點；(4)任選地除去未連接的銜接頭；(5)用第一限制酶消化帶有銜接頭的片段，從而產生兩條銜接片段，其中每條銜接片段 包含(vi)銜接頭；和(vii)包含如下的DNA片段較短的鏈，和較長的鏈，其中較長的鏈包含圈套序列；(6)固定(5)中產生的銜接片段；(7)變性該片段以提供單鏈片段；(8)通過將互補寡核苷酸連接到銜接頭來再建第二限制酶識別位點并用第二限制酶消 化該銜接片段，從而產生包含如下的銜接頭_圈套片段(viii)銜接頭片段；和(ix)單鏈圈套序列；(9)從固定狀態釋放(8)中產生的銜接頭_圈套片段；并(10)將該銜接頭_圈套片段克隆入質粒載體中。
44.根據權利要求43的方法，其中每個質粒都包含兩個或更多個拷貝的單體 序列以及其中步驟(10)進一步包括-提供包含如下的環狀寡核苷酸(i)銜接頭_圈套片段；和( )適用于滾環擴增的引物的結合位點；其中單體序列包含(i)和(ii)；-使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多核苷酸；并-將該多核苷酸克隆入質粒載體中。
45.根據權利要求44的方法，其中提供環狀寡核苷酸的步驟包括_提供包含如下的線型單鏈寡核苷酸銜接頭-圈套片段(i)和適用于滾環擴增的引 物的結合位點(ii)； -環化該寡核苷酸；-任選地用外切核酸酶消化殘留的線型DNA ；并 -回收單體環狀寡核苷酸。
46.根據權利要求43-45任一項的方法，其中第一限制酶是MmeI和/或第二限制酶是 Nt. BbvCI。
47.根據權利要求43-45任一項的方法，其中基因組DNA樣品包含編碼抗生素抗性的一 種或更多種基因。
48.一種制備質粒文庫的方法，其中每個質粒都包含兩個或更多個拷貝的單體序列，以5及其中每條單體序列都包含長度η個核苷酸的隨機化核苷酸序列，該方法包括 (1)提供包含如下的環狀寡核苷酸(1)長度η個核苷酸的隨機化序列；和 ( )適用于滾環擴增的引物的結合位點； 其中單體序列包含(i)和(ii)；(2)使用環狀寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多核苷 酸；并(3)將該多核苷酸克隆入質粒載體中。
49.根據權利要求48的方法，其中步驟(1)包括-提供包含如下的線型單鏈寡核苷酸長度η個核苷酸的隨機化序列 (i)和適用于滾環擴增的引物的結合位點(ii)； -環化該寡核苷酸；-任選地用外切核酸酶消化殘留的線型DNA ；并 -回收單體環狀寡核苷酸。
50.一種根據權利要求48或49的方法，其中η是5_50。
51.一種根據權利要求48-50任一項的方法，其中基本上所有的長度η個核苷酸的核苷 酸序列都表現在文庫中。
52.根據權利要求40-51任一項制備的質粒或質粒文庫。
53.一種包含外源誘餌多核苷酸的細胞，該多核苷酸包含不與基因可操作地連接的轉 錄因子結合位點(誘餌序列)；其中該細胞包含可操作地連接包含轉錄因子結合位點的順 式調節序列的一種或更多種基因；以及其中該誘餌多核苷酸導致細胞抗生素抗性改變。
54.根據權利要求53的細胞，其中細胞中可操作地連接順式調節序列的一種或更多種 基因編碼對抗生素的抗性。
55.根據權利要求54的細胞，其中誘餌多核苷酸如權利要求12-22任一項所定義。
56.根據權利要求1-22任一項所述的方法制備的細胞。
57.一種包含根據權利要求25-39或52任一項的質粒或質粒文庫的細胞。
58.根據權利要求53-57任一項的細胞，其具有改變的對選自如下的一種或更多種的 抗生素的抗性氨基糖苷類；碳青霉烯類；頭孢菌素類；糖肽類；青霉素類；多肽類抗生素； 喹啉類；磺胺類；或四環素類。
59.根據權利要求58的細胞，其中抗生素選自如下的一種或更多種卡那霉素、美羅培 南、頭孢吡肟、萬古霉素、達托霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、多粘菌素B、左氧氟沙 星、菌特靈、四環素、氯霉素、利福平和斯沃。
60.根據權利要求53-59任一項的細胞，其中細胞是(a)抗生素抗性的非致病模型；或(b)病原體。
61.根據權利要求53-60任一項的細胞，其中細胞是(a)選自如下的屬的革蘭氏陽性細菌放線菌屬；鏈霉菌屬；分枝桿菌屬；梭菌屬；芽 孢桿菌屬；李斯特氏菌屬；葡萄球菌屬；鏈球菌屬；腸球菌屬；或(b)選自如下的屬的革蘭氏陰性細菌腸桿菌科；假單胞菌屬；莫拉氏菌屬；螺桿菌屬；寡養單胞菌屬；蛭弧菌屬；醋酸細菌；軍團病桿菌屬；藍細菌屬；螺體屬；綠色硫細菌；和綠 色無硫細菌。
62.根據權利要求53-61任一項的細胞，其中細胞是選自如下的病原體結核分枝桿 菌；牛分枝桿菌；非洲分枝桿菌；田鼠分枝桿菌；麻風分枝桿菌；艱難梭菌；肉毒梭菌；產氣 莢膜梭菌；破傷風梭菌；沙門氏菌；大腸桿菌；屎腸球菌；糞腸球菌；淋病奈瑟氏菌；腦膜炎 奈瑟氏菌；卡他莫拉氏菌；流感嗜血桿菌；肺炎克雷伯氏菌；嗜肺軍團菌；銅綠假單胞菌； 奇異變形桿菌；陰溝腸桿菌；粘質沙雷氏桿菌；幽門螺桿菌；腸炎沙門氏菌；和傷寒沙門氏 菌。
63.一種鑒定蛋白-DNA復合物中一個或更多個蛋白結合位點邊界的方法，該方法包括1.提供蛋白-DNA復合物；2.用如下的進行消化a.具有非特異性DNA切口能力的酶；和b.5’-3’外切核酸酶；并3.相對于DNA鏈上已知固定點，測定(2)中的每條DNA鏈中產生的5’缺失的位置。
64.根據權利要求63的方法，其中步驟3包括-自(2)中回收消化的DNA并變性DNA以形成單鏈；-將單鏈DNA與包含蛋白結合位點的互補DNA鏈雜交，其中該互補DNA鏈包含接頭；-使用結合該接頭的標記引物進行擴增反應；并-測定標記的擴增產物的大小。
65.根據權利要求64的方法，其中互補DNA鏈被固定。
66.根據權利要求63-65任一項的方法，其中具有非特異性DNA切口能力的酶是DNA酶 I和/或5’ -3’外切核酸酶是T7外切核酸酶。
67.根據權利要求63-66任一項的方法，其中在體內進行消化。
68.根據權利要求63-67任一項的方法，其中蛋白-DNA復合物包含結合順式調節序列 的轉錄因子，以及其中轉錄因子與順式調節序列的結合調節原核生物或真核生物中一種或 更多種抗生素抗性基因的表達。
69.一種鑒定原核或真核一種或更多種基因表達的順式作用調節子的方法，包括1.提供根據權利要求37-39或52任一項的質粒文庫；2.將該質粒文庫導入宿主細胞中，其中該宿主細胞包含可操作地連接一種或更多種基 因的目標順式調節序列，該一種或更多種基因的表達可直接或間接測定；及3.在質粒文庫存在和不存在下，直接或間接測定該一種基因(或多種基因)的表達。
70.根據權利要求69的方法，用于鑒定原核或真核一種或更多種抗生素抗性基因表達 的順式作用調節子。
71.根據權利要求69或70的方法，其中宿主細胞中的順式調節序列可操作地連接一種 或更多種基因，該一種或更多種基因的表達在其天然環境中為該序列所調節。
72.根據權利要求69或70的方法，其中在宿主細胞中，順式調節序列和/或可操作地 連接的一種或更多種基因對于該細胞是異源的。
73.根據權利要求72的方法，其中順式調節序列可操作地連接報道基因。
74.根據權利要求73的方法，其中順式調節序列是阻抑序列以及報道基因編碼對于在 合適的培養條件下細胞存活所必需的產物。
75.根據權利要求73或74的方法，其中報道基因編碼抗生素抗性。
76.根據權利要求73的方法，其中順式調節基因是激活子序列以及報道基因是自殺報道基因。
77.根據權利要求73或76的方法，其中報道基因產物將代謝物轉化為毒素。
78.根據權利要求69-77任一項的方法，其中步驟(3)包括測定宿主細胞的生存力。
79.根據權利要求69-78任一項的方法，其進一步包括文庫雜交步驟。
80.根據權利要求69-79任一項的方法，其進一步包括通過根據權利要求63-68任一項 的方法測定順式調節序列的邊界。
81.根據權利要求1-22任一項的應用，其中順式調節序列已通過根據權利要求69-80 任一項的方法得以鑒定。
82.一種用于治療細菌感染的誘餌多核苷酸，其中該多核苷酸包含轉錄因子結合位點 以及該結合位點不與基因可操作地連接。
83.誘餌多核苷酸用于治療細菌感染的應用，其中該多核苷酸包含轉錄因子結合位點 以及該結合位點不與基因可操作地連接。
84.誘餌多核苷酸在制備用于治療細菌感染的藥物中的應用，其中該多核苷酸包含轉 錄因子結合位點以及該結合位點不與基因可操作地連接。
85.根據權利要求82的誘餌多核苷酸或根據權利要求83或84的應用，其中轉錄因子 是原核生物或真核生物中一種或更多種抗生素抗性基因表達的調節子。
86.根據權利要求82-85任一項的誘餌多核苷酸或應用，其中治療細菌感染包括使用 一種或更多種抗生素。
87.根據權利要求82-85任一項的誘餌多核苷酸或應用，其中多核苷酸如權利要求 12-22任一項所定義。
88.一種改變原核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含原核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多核苷酸中的 基因可操作地連接；并(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序列包 含轉錄結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合； 以及其中(i)多核苷酸包含根據權利要求25-39或52任一項的質粒或質粒文庫； ( )多核苷酸包含多于一個拷貝的結合位點；(iii)多核苷酸包含多個同向重復的結合位點；(iv)多核苷酸包含附加到結合位點上的額外的序列； (ν)多核苷酸包含至少一個二級結構元件；(vi)多核苷酸包含環狀雙鏈DNA。
89.一種改變原核或真核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含原核或真核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多核苷酸中的基因可操作地連接；并(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序列包 含轉錄因子結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合；以及其中順式調節序列是通過權利要求69-80任一項的方法鑒定的一種順式調節序列。
90. 一種改變真核細胞中一種或更多種基因表達的方法，該方法包括(a)提供包含真核轉錄因子結合位點的多核苷酸，其中該結合位點不與多核苷酸中的 基因可操作地連接；并(b)將該多核苷酸導入細胞中；其中該細胞包含可操作地連接順式調節序列的一種或更多種基因，該順式調節序列包 含轉錄結合位點或與轉錄因子結合位點競爭轉錄因子結合；以及其中多核苷酸包含根據權利要求25-39或52任一項的質粒或質粒文庫。9
全文摘要
用于鑒定及使用順式調節和誘餌序列的組合物及方法。
文檔編號C12Q1/68GK101883867SQ200880119076
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月3日 優先權日2007年10月3日
發明者邁克爾·麥克阿瑟 申請人:普羅卡塔生物系統有限公司