專利名稱：基于凝膠固定核酸的dna固定方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及將DNA固定于凝膠上的方法，該方法可用于制備DNA微陣列 以及固定DNA的反復利用等。本發明還涉及按照所述方法將DNA固定其上的 材料以及用所述材料檢測靶核酸的方法。
背景技術：
由于持續的化學暴露(環境物質，食物等)，我們遺傳物質的完整性時刻受 到挑戰。在疾病過程以及人的一生中，基因組DNA并不是一成不變的，研究基 因組水平上的動態變化顯得越來越有必要。
由于技術瓶頸的制約，對疾病過程中基因組水平上動態變化的系統性的比 對研究仍然無法進行。但是保存個體基因組DNA以供現在或者將來研究的需要， 顯然具有極其重要的現實意義。如果能獲得人一生基因組變化的信息并作為醫 學資料保存下來，這必將能夠推動對健康狀態，疾病預測，疾病防治以及個性 化治療的認識。然而，基因突變位點數量眾多，從人體樣本中獲得基因組DNA 的產量受到限制，我們必須用有限的基因組DNA檢測數以百萬計的突變位點。 科研人員試圖建立起高通量平臺以實現檢測的微型化，然而對所有可疑SNP位 點進行分析仍然需要大量的DNA樣本。僅僅通過反應微型化技術似乎無法完成 這樣的任務，基因組DNA固定化以實現DNA的回收和反復利用是一比較理想 的解決方法。
目前,固定DNA的已知方法大體分為以下兩類丄DNA通過共價鍵與固相載 體相結合；2.DNA通過靜電作用或者其它非共價鍵的形式與固相載體結合。顯然，通過共價鍵結合的DNA具有更好的穩定性和可控性，是更合理的固定方法。為了提高與支持物的固定效率，需要預先熱變性DNA，在未變性的情況下固定效率明顯降低。另外，在現有技術中，為了對固定著的DNA進行分析，往往需要通過PCR方法對目的片段進行擴增。因此，這種DNA的固定方法需要耐受反復重復的熱循環
(1) 將樣品溫度增加至95 °C，解開DNA雙鏈中的氫鍵；
(2) 將樣品溫度降低至45 °C，使得DNA模板與引物雜交，便于后續的DNA擴增；
(3) 將樣品溫度增加至74 °C，通過使用聚合酶延伸引物實現DNA的體外擴增。
發明內容
本發明提供了一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，由本發明制備得到的固定有DNA的凝膠能夠承受反復的PCR反應條件，為DNA的反復使用提供了可能。
本發明所述的DNA樣本的固定方法，包括原料選擇、混合和聚合反應三個步驟；各步驟的內容如下-.
原料選擇選用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯酰胺儲存液10—70 %;稀釋變性氨基未端修飾的核酸1 nL—5ml;N,N,N,N-四甲基乙二胺1—10%; 10%過硫酸銨1—10%; 其余為水；
混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進行混合，混合物
中含有的核酸量為10-1000ng/3pL;
聚合反應取5 ^L混合物置于PCR反應管中，37"C放置30分鐘待聚合反應結束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應在凝膠中得以固定。
本發明與現有技術相比具有以下優點采用的固相載體，甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠的三維結構確保了 DNA結合的高承載量，同時水凝膠的親水特性能為固定的DNA創造良好的溶液環境便于隨后PCR反應的進行。末端修飾的核酸分子通過與固相載體之間形成穩定的共價鍵實現固定，能夠經受PCR反應的劇烈條件，為隨后的PCR反應驗證提供了保證。這種新型的DNA共聚反應在沒有UV激發的情況下，仍然有較高的固定效率，從而排除了共聚反應中生成嘧啶二聚體的可能性，對SNP檢測以及基因組測序尤為重要。
圖1是甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠固定末端氨基修飾的PCR產物的固定效果圖。
圖2是5'末端帶有氨基的PCR產物作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖。
圖3是pUCm-T-SEE質粒斷裂片斷作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖。
圖4是人基因組DNA斷裂片斷作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖。
具體實施方法
技術領域：
本發明所述的DNA樣本的固定方法，包括原料選擇、混合和聚合反應三個步驟；各步驟的內容如下
原料選擇選用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯
酰胺儲存液！0—70 % ，稀釋變性氨基未端修飾的核酸1 HL—5ml;N,N，N，N-
四甲基乙二胺1—10%; 10%過硫酸銨1—10%;其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3|iL;
聚合反應取5 ^L混合物置于PCR反應管中，37'C放置30分鐘待聚合反應結束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應在凝膠中得以固定。
所述甲基丙烯酰胺單體重量濃度在5% - 30%之間，N,N,N,N-四甲基乙二胺
重量濃度在4%，過硫酸胺重量濃度在6%。核酸的濃度在0.5pg/mL - 50pg/mL
用5%和20%聚甲基丙烯酰胺凝膠原料配制DNA樣本的配方表
原料名稱 20%聚甲基丙烯酰胺凝膠 5%聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3 pL 3
40。/。甲基丙烯酰胺儲存液 15 nL 4pL
H20 6jiL 17 pL
稀釋變性的氨基未端修 3&飾的核酸
N,N，N,N-四甲基乙二胺 1.2 nL 1.2 pL
10%AP (過硫酸銨) 1.8 HL 1.8
參照圖1:本發明所述甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠固定末端氨基修飾的PCR產物的固定效果(其中泳道l: pH11.0;泳道2: pH7.0)。
參照圖2: 5'末端帶有氨基的PCR產物作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (40次PCR反應后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；泳道2(80次PCR反應后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.7序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；泳道3 (120次PCR反應后)SEQIDN0.4和SEQIDNO,8序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；泳道4(160次PCR反應后)SEQIDN0.3和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物。參照圖3: pUCm-T-SEE質粒斷裂片斷作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (40次PCR反應后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；泳道2(80次PCR反應后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.8序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；泳道3 (120次PCR反應后)SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.6序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物。
參照圖4:人基因組DNA斷裂片斷作為固定模板進行PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (50次PCR反應后)SEQIDNO.9和SEQIDNO.10序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物；其中泳道2 (100次PCR反應后)SEQIDNO.il和SEQ ID NO. 12序列號的引物對PCR擴增后的PCR產物。實施例1
水凝膠共聚化學固定DNA效率的檢測
(1) 末端修飾的PCR擴增產物的制備
將包含金黃色葡萄球菌腸毒素E基因的質粒DNA (pUCm-T-SEE,其中see的GenBank登錄號M21319)作為模板，通過PCR擴增該基因約850 bp的片段。用于此PCR的兩種引物的堿基序列見SEQIDNO.l和SEQIDNO.2;在引物合成過程中，在上下游引物的5'末端引入了(CH2)6-NH2修飾；PCR反應結束后，回收PCR產物后，GeneQuant定量分析，-20 "C保存待用；
(2) 取5%聚甲基丙烯酰胺凝膠和20%聚甲基丙烯酰胺凝膠液待用；按照下列配方配置凝膠
5%聚甲基丙烯酰胺凝膠20%聚甲基丙烯酰胺凝膠H20 3.167 mL —
10xTBE (pH13) — 3nL
5xTBE (pH8.3) 1 mL —
Acrylamide/Bis儲存液(30%) 0.833 mL —
40%甲基丙烯酰胺溶液 一 15 nL
PCR產物 一 9 nL
TEMED 2.5 1.2
10%AP (過硫酸銨) 25 nL 1.8(3)安裝垂直板型電泳裝置，將所配置的5%聚甲基丙烯酰胺凝膠和20%聚甲 基丙烯酰胺凝膠液分別沿著凝膠的長玻璃片的內側用移液器加至長短玻璃片的 窄縫內直至凝膠液溢出，輕輕地將梳子插入凝膠內；放置lh后小心拔去梳子， 用濾紙條吸去殘留的液體；將制備好的含有PCR產物的30 pL凝膠注入凹槽，37 'C烘箱內放置lh，直至聚合反應結束；將500mL電泳緩沖液(lxTBE)倒入電 泳槽中，合上電泳槽，設置電泳時間和電壓；160V電泳60min;電泳結束后， 帶上手套，小心從制膠板上將凝膠剝下，清水洗膠，將膠放入EB染色液中緩慢 搖動，染色20-30min，小心不要將膠撕破；取出用水漂洗后，UV下拍照記錄。 實施例2
固定方法的熱穩定性實驗
(1) 末端修飾的PCR擴增產物的制備
將包含金黃色葡萄球菌腸毒素E基因的質粒DNA (pUCm-T-SEE，其中see 的GenBank登錄號M21319)作為模板，通過PCR擴增該基因約850 bp的片段； 用于此PCR的兩種引物的堿基序列見SEQIDNO.l和SEQIDN0.2;在引物合 成過程中，在上下游引物的5，末端引入了(CH2)6-NH2修飾；PCR反應結束后，回 收PCR產物后，GeneQuant定量分析，-20 。C保存待用；
(2) PCR產物的固定
取之前擴增、純化后的PCR產物(末端帶有NH2修飾)，取lpL用雙蒸水稀 釋到10ng-l嗎/nL;取稀釋后的PCR產物，100 。C加熱變性5 min后立即置于冰浴 內；按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13)
40%甲基丙烯酰胺儲存液 H20
稀釋變性的PCR產物 TEMED
10%AP (過硫酸銨)
3pL (末端NH2修飾)
1.2 nL 1.8 nL
3pL 15
6nL制備好的凝膠均分成3分注入PCR反應管中，37 ""C烘箱內放置0.5h，待凝膠 聚合成型。用ixTAE配制1.5X的瓊脂糖凝膠，取聚合反應完的甲基丙烯酰胺凝 膠，放置于瓊脂糖凝膠的孔洞中。電泳緩沖液為lxTAE，電壓為120V，電泳45 min，去除吸附于凝膠內部和表面的PCR產物。2mL雙蒸水振蕩洗滌凝膠3次后， 吸去凝膠表面水滴，作為模板運用于隨后的PCR反應中。
(3)以固定的PCR產物為模板進行PCR擴增
根據固定的PCR產物的序列信息，設計以下3對上下游引物SEQIDNO，3 -SEQIDNO.8;通過不同配伍，逐漸延伸所獲得的PCR產物，排除每次PCR反應 后殘留PCR產物的影響；在每次PCR反應結束以后，對反應液進行瓊脂糖凝膠電 泳，觀察是否有預期的特異性條帶生成，如果有則證明該次PCR反應之前在凝膠 中仍然有模板DNA的存在，以PCR反應的成功次數來表征該方法的耐熱效果。 實施例3
pUCm-T-SEE質粒片段的固定
(1) pUCm-T-SEE的斷裂以及末端修飾 按照常規方法提取pUCm-T-SEE質粒，取純化后的pUCm-T-SEE質粒100 pL， 加入甲酸50pL，混勻后置于30 'C水浴中反應，反應時間由20min;反應結束 后立即加入NaOH乳濁液調整pH至7.0;按照試劑盒說明書要求，使用DNA膠回 收試劑盒回收經過甲酸處理后的質粒DNA，用100 pL雙蒸水回收柱上的DNA， 離心管中的液體即為回收的質粒DNA;向脫嘌呤的質粒溶液中加入25 ^L2.5 mol'L"的乙二胺鹽酸鹽溶液，混勻后加入NaOH乳濁液調整pH至7.4， 37 'C水浴 中反應4h; 4h后加入25pL新配的0.1mol七"的硼氫化鈉溶液，室溫放置l h。最 后加入15pL的20%的乙二胺鹽酸鹽溶液，室溫放置lh，結束反應；反應結束 后，按照DNA回收試劑盒說明書要求，回收質粒DNA片段，瓊脂糖電泳檢測反應結果后，-20 "C保存待用；
(2) pUCm-T-SEE片段的固定及熱穩定性實驗
將純化得到的帶有末端氨基的pUCm-T-SEE質粒片段電泳檢測，選取分子大
小〈850bp的質粒片段進行割膠回收，得到的終溶液用GeneQuant定量，稀釋到一
定濃度，PCR反應驗證模板DNA的存在后，置于-20 "C保存。
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6nL
稀釋的變性pUCm-T-SEE質粒片段 3
TEMED 1.2^
10%AP (過硫酸銨) 1.8 jiL
制備好的凝膠分裝3分注入PCR反應管中，37 "C烘箱內放置lh，待凝膠聚 合成型。按照之前方法使用不同引物的配伍進行PCR反應，檢測化學方法的熱穩 定性，并將部分PCR產物送檢測序。 實施例4
人基因組DNA的固定化
(1) 人基因組DNA的提取
按照說明書的要求，提取人基因組DNA，使用GeneQuant定量；
(2) 人基因組DNA的斷裂以及末端修飾
取純化后的人基因組DNA100pL，加入甲酸50pL，混勻后置于30 "C水浴 中反應，反應時間5min。反應結束后立即加入NaOH乳濁液調整pH至7.0;按照 試劑盒說明書要求，使用DNA膠回收試劑盒回收經過甲酸處理后的人基因組 DNA，最后用100pL雙蒸水回收柱上的DNA，離心管中的液體即為回收的人基 因組DNA;向液體中加入25nL2.5mol丄"的乙二胺鹽酸鹽溶液，混勻后加入 NaOH乳濁液調整pH至7.4， 37 。C水浴中反應4h; 4h后加入25nL新配的0.1mol.L"的硼氫化鈉溶液，室溫放置lh;最后加入15pL的20%的乙二胺鹽酸
鹽溶液，室溫放置lh，結束反應；反應結束后，按照DNA回收試劑盒說明書要
求，反復多次回收人基因組DNA片段，PCR反應驗證基因組DNA的完整程度，
-20 'C保存待用；
(3)人基因組DNA片段的固定及熱穩定性實驗
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3 nL
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6 |xL
人基因組DNA片段 3pL
TEMED 1.2
10%AP (過硫酸銨) 1,8 jiL
制備好的凝膠分裝3分注入PCR反應管中，37 'C烘箱內放置lh，待凝膠聚 合成型；使用以下引物反復進行PCR檢測，檢測化學方法的熱穩定性。
權利要求
1. 一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征是包括原料選擇、混合和聚合反應三個步驟；各步驟的內容如下原料選擇選用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺儲存液10—70％；稀釋變性氨基未端修飾的核酸1μL—5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1—10％；10％過硫酸銨1—10％；其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3μL；聚合反應取5μL混合物置于PCR反應管中，37℃放置30分鐘待聚合反應結束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應在凝膠中得以固定。
2、 根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述甲基丙烯酰胺單體重量濃度在5% - 30%之間，N,N,N，N-四甲基乙二胺重 量濃度在4%，過硫酸胺重量濃度在6%;核酸的濃度在0.5pg/mL-5(Hig/mL。
3、 根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述混合物的pH值的范圍在7.0-11.0之間，且隨著pH值的增高，DNA的固定效率具有明顯的上升趨勢。
4、 根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的核酸是末端氨基的寡聚核苷酸、末端氨基修飾的PCR產物或末端氨基 修飾的長鏈DNA分子中的一種；當待固定的核酸是質粒、基因組等長鏈DNA 分子時，需要采用將其長鏈斷裂成100bp-100Kb的D NA碎片，并在其3'或5' 末端引入活性氨基便于后續的固定。
5、 根據權利要求4所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的長鏈DNA采用甲酸處理DNA生成活性醛基，該活性醛基隨后與乙二 胺和硼氫化鈉反應隨機斷裂長鏈DNA，并在斷裂片斷的3'末端引入了活性氨基。
全文摘要
本發明涉及將DNA固定于凝膠上的方法，特別是涉及一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法及其應用；所述的DNA樣本的固定方法包括原料選擇、混合和聚合反應三個步驟；各步驟的內容如下原料選擇選用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺儲存液10-70％；稀釋變性氨基末端修飾的核酸1μL-5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1-10％；10％過硫酸銨1-10％；其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3μL；聚合反應取5μL混合物置于PCR反應管中，37℃放置30分鐘待聚合反應結束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應在凝膠中得以固定；本發明具有承載量高、末端修飾的核酸分子通過與固相載體之間形成穩定的共價鍵實現固定，能夠經受PCR反應的劇烈條件等優點。
文檔編號C12Q1/68GK101481733SQ20091000398
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月4日
發明者厲朝龍, 賈丹梅 申請人:杭州恩氏基因技術發展有限公司