具有含氮脂環式骨架的單鏈核酸分子的制作方法

具有含氮脂環式骨架的單鏈核酸分子的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有含氮脂環式骨架的單鏈核酸分子。本發明的目的在于提供一種能夠容易且高效地制造、能夠抑制基因表達的新的核酸分子。所述分子的特征在于，其為包含抑制靶基因表達的表達抑制序列的單鏈核酸分子，包含區域(X)、連接子區域(Lx)和區域(Xc)，在上述區域(X)與上述區域(Xc)之間連結有上述連接子區域(Lx)，上述區域(Xc)與上述區域(X)互補，上述區域(X)和上述區域(Xc)中的至少一者包含上述表達抑制序列，上述連接子區域(Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸結構。根據該單鏈核酸分子，能夠抑制上述靶基因的表達。
【專利說明】具有含氮脂環式骨架的單鏈核酸分子
[0001] 本申請是申請號為2011800375929(國際申請號為PCT/JP2011/067292)的原申請 的分案申請，該原申請的申請日為2011年7月28日，發明名稱為"具有含氮脂環式骨架的 單鏈核酸分子"。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及抑制基因表達的單鏈核酸分子，更詳細而言，涉及具有含氮脂環式骨 架的單鏈核酸分子、包含該單鏈核酸分子的組合物及其用途。

【背景技術】
[0003] 作為抑制基因表達的技術，例如，已知RNA干擾（RNAi)(非專利文獻1)。基于RNA 干擾的基因的表達抑制通常通過例如在細胞等中投與短的雙鏈RNA分子來實施。上述雙鏈 RNA分子通常被稱為siRNA (小干擾RNA)。除此之外，還報道了一種環狀的RNA分子，該RNA 分子通過分子內退火而部分地形成了雙鏈，利用該RNA分子也能夠抑制基因表達（專利文 獻1)。但是，這些方法中，誘導基因的表達抑制的RNA分子存在以下問題。
[0004] 首先，在制造上述SiRNA的情況下，需要以下工序：在分別合成正義鏈和反義鏈之 后，最后將這些鏈雜交。因此，存在制造效率差的問題。另外，在細胞中投與上述siRNA時， 需要以抑制了其解離為單鏈RNA的狀態投與至細胞中，因而，其操作條件的設定也需要勞 力。接著，在為環狀的RNA分子的情況下，存在難以合成的問題。
[0005] 并且，這些RNA分子基本上由核苷酸殘基構成。而且，現狀是，在對上述RNA分子 賦予某些功能、標記時，例如，只能對作為核苷酸殘基的構成要素的堿基、糖殘基或磷酸基 進行修飾。因此，在利用了 RNA干擾的醫藥品等的開發中，極其難以在維持了基因表達的抑 制功能的狀態下進行賦予進一步的功能、標記的改變。
[0006] 現有技術文獻
[0007] 非專利文獻
[0008] 非專利文獻 1 :Fire 等、Nature、1998Febl9 ;391 (6669) :806-11
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1 :美國公開公報2004-058886


【發明內容】

[0011] 因此，本發明的目的在于提供一種能夠容易且高效地制造、能夠抑制基因表達的 新的核酸分子。
[0012] 為了達到上述目的，本發明的核酸分子的特征在于，其為包含抑制靶基因表達的 表達抑制序列的單鏈核酸分子，包含區域（X)、連接子區域（Lx)和區域（Xc)，在上述區域 (X)與上述區域（Xc)之間連結有上述連接子區域（Lx)，上述區域（X)和上述區域（Xc)中 的至少一者包含上述表達抑制序列，上述連接子區域（Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨 架中的至少一者的非核苷酸結構。
[0013] 本發明的組合物的特征在于，其為用于抑制靶基因表達的組合物，其包含上述本 發明的單鏈核酸分子。
[0014] 本發明的組合物的特征在于，其為藥學組合物，其包含上述本發明的單鏈核酸分 子。
[0015] 本發明的表達抑制方法的特征在于，其為抑制靶基因表達的方法，其使用上述本 發明的單鏈核酸分子。
[0016] 本發明的疾病的治療方法的特征在于，其包括將上述本發明的單鏈核酸分子投與 至患者的工序，上述單鏈核酸分子具有抑制成為上述疾病的原因的基因的表達的序列作為 上述表達抑制序列。
[0017] 本發明的單鏈核酸分子能夠進行基因的表達抑制，并且由于不是環狀，因而其合 成容易，另外，由于是單鏈，因此不存在雙鏈的退火工序，能夠高效地制造。另外，由于上述 連接子區域包含上述非核苷酸殘基，因而不限于例如以往那樣的改變核苷酸殘基，例如，還 能夠改變上述連接子區域中的修飾等。
[0018] 需要說明的是，本發明人首次發現了本發明的單鏈核酸分子的結構能夠抑制基因 表達。本發明的單鏈核酸分子的基因的表達抑制效果被推測是與基于RNA干擾同樣的現 象，但本發明中的基因表達抑制不限制和限定于RNA干擾。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是示出本發明的單鏈核酸分子的一個例子的示意圖。
[0020] 圖2是示出本發明的單鏈核酸分子的其他例子的示意圖。
[0021] 圖3是示出本發明的單鏈核酸分子的其他例子的示意圖。
[0022] 圖4是示出本發明的實施例中的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。
[0023] 圖5是示出本發明的實施例中的穩定性的電泳照片。
[0024] 圖6是示出本發明的實施例中的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。
[0025] 圖7是示出本發明的實施例中的切酶（Dicer)蛋白質對于ssRNA的反應性的電泳 的結果。
[0026] 圖8是示出本發明的實施例中的A549細胞的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。
[0027] 圖9是示出本發明的實施例中的293細胞的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。
[0028] 圖10是示出本發明的實施例中的HCT116細胞的GAPDH基因表達量的相對值的圖 表。
[0029] 圖11是示出本發明的實施例中的HCT116細胞的GAPDH基因表達量的相對值的圖 表。
[0030] 圖12是示出本發明的實施例中的TGF-β 1基因表達量的相對值的圖表。
[0031] 圖13是示出本發明的實施例中的各投與組中單位重量的肺的TGF-β 1基因表達 量的圖表。
[0032] 圖14的（A)是示出本發明的實施例中的各投與組的BALF樣品中的TNF-α量的圖 表，圖14的（B)是示出本發明的實施例中的各投與組的BALF樣品中的IFN-β量的圖表。
[0033] 圖15是示出本發明的實施例中的核糖核酸酶耐受性的電泳照片。
[0034] 圖16是示出本發明的實施例中的S7核酸酶耐受性的電泳照片。
[0035] 圖17是示出參考例中使用的ssRNA的圖。
[0036] 圖18是示出參考例中的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。
[0037] 圖19是示出參考例中的TGF-β 1基因表達量的相對值的圖表。
[0038] 圖20是示出參考例中的LAMA基因的表達量的相對值的圖表。
[0039] 圖21是示出參考例中的LMNA基因的表達量的相對值的圖表。
[0040] 圖22是示出參考例中使用的ssRNA的圖。
[0041] 圖23是示出參考例中的GAPDH基因表達量的相對值的圖表。

【具體實施方式】
[0042] 只要沒有特別提及，則本說明書中使用的用語能夠以該【技術領域】中通常所用的含 義使用。
[0043] 1. ssPN 分子
[0044] 如上所述，本發明的單鏈核酸分子的特征在于，其為包含抑制靶基因表達的表達 抑制序列的單鏈核酸分子，包含區域（X)、連接子區域（Lx)和區域（Xc)，在上述區域（X)與 上述區域（Xc)之間連結有上述連接子區域（Lx)，上述區域（X)和上述區域（Xc)中的至少 一者包含上述表達抑制序列，上述連接子區域（Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的 至少一者的非核苷酸結構。
[0045] 本發明中，"靶基因的表達抑制"例如是指阻礙上述靶基因的表達。上述抑制的機 理沒有特別限制，例如，可以為下降調節或沉默。上述靶基因的表達抑制能夠通過例如由上 述靶基因的轉錄產物的生成量的減少、上述轉錄產物的活性的減少、由上述靶基因的翻譯 產物的生成量的減少或者上述翻譯產物的活性的減少等來確認。上述蛋白質可以舉出例如 成熟蛋白或者接受加工或翻譯后修飾之前的前體蛋白等。
[0046] 以下，將本發明的單鏈核酸分子也稱為本發明的"ssPN分子"。本發明的ssPN分 子例如在體內（in vivo)或體外（in vitro)中能夠用于祀基因的表達抑制，因而也稱為"革巴 基因的表達抑制用ssPN分子"或"靶基因的表達抑制劑"。另外，本發明的ssPN分子例如 通過RNA干擾而能夠抑制上述靶基因的表達，因而也稱為"RNA干擾用ssNP分子"、"RNA干 擾誘導用ssPN分子"或者"RNA干擾劑或RNA干擾誘導劑"。另外，本發明能夠抑制例如干 擾素誘導等副作用。
[0047] 本發明的ssPN分子的5'末端和3'末端未連結，還能夠稱為線狀單鏈核酸分子。
[0048] 在本發明的ssPN分子中，例如，本發明的ssPN分子以體內或體外的方式導入到 細胞內的情況下，上述表達抑制序列為顯示抑制上述靶基因的表達的活性的序列。上述 表達抑制序列沒有特別限制，能夠根據目標靶基因的種類適宜設定。上述表達抑制序列例 如能夠適宜適用基于siRNA的RNA干擾的相關序列。RNA干擾通常為下述現象：長的雙鏈 RNA(dsRNA)在細胞內被切酶切斷成3'末端突出的19?21堿基對左右的雙鏈RNA(siRNA : 小干擾RNA)，其中一個單鏈RNA與靶mRNA結合，上述mRNA分解，由此抑制上述mRNA的翻 譯。與上述靶mRNA結合的上述siRNA中的單鏈RNA的序列例如根據靶基因的種類被報道 了各種種類。本發明可以使用例如上述siRNA的單鏈RNA的序列作為上述表達抑制序列。 [0049] 需要說明的是，本發明的關鍵點不在于對于上述靶基因的上述表達抑制序列的序 列信息，而是涉及用于在例如細胞內使上述表達抑制序列所產生的上述靶基因的表達抑制 活性發揮功能的核酸分子的結構。因此，本發明中，例如，除了申請時公知的上述siRNA的 單鏈RNA序列之外，還能夠利用將來所獲知的序列作為上述表達抑制序列。
[0050] 上述表達抑制序列例如相對于上述靶基因的規定區域優選具有90%以上的互補 性、更優選為95%、進一步優選為98%、特別優選為100%。通過滿足這樣的互補性，例如， 能夠充分減輕脫靶。
[0051] 作為具體例，在靶基因為GAPDH基因的情況下，上述表達抑制序列能夠使用例如 序列號4所示的19堿基長的序列；在靶基因為TGF-β 1的情況下，上述表達抑制序列能夠 使用例如序列號18所不的21喊基長的序列；在革E基因為LAMA1基因的情況下，上述表達抑 制序列能夠使用例如序列號6所不的19喊基長的序列；在祀基因為LMNA基因的情況下，能 夠使用例如序列號30所示的19堿基長的序列。
[0052] 5' -GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3'（序列號 4)
[0053] 5' -AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3'（序列號 18)
[0054] 5' -AUUGUAACGAGACAAACAC-3'（序列號 6)
[0055] 5' -UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3'（序列號 30)
[0056] 本發明的ssPN分子所產生的上述靶基因的表達抑制被推測是由于例如產生RNA 干擾。需要說明的是，本發明并不限定于該機理。本發明的ssPN分子并不是如例如所謂的 siRNA那樣以由兩條單鏈RNA構成的dsRNA的形式導入細胞等中，并且，在細胞內未必需要 上述表達抑制序列的切出。因此，本發明的ssPN分子也可以說例如還具有RNA干擾樣的功 能。
[0057] 本發明的ssPN分子中，上述連接子區域（Lx)例如可以具有包含上述吡咯烷骨架 的非核苷酸結構，也可以具有包含上述哌啶骨架的非核苷酸結構，還可以具有包含上述吡 咯烷骨架的非核苷酸結構和包含上述哌啶骨架的非核苷酸結構兩者。本發明的ssPN分子 例如能夠抑制生物體內的干擾素誘導等副作用，核酸酶耐受性優異。
[0058] 本發明的ssPN分子中，上述吡咯烷骨架例如可以是構成吡咯烷的五元環的碳的1 個以上被取代了的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情況下，例如，優選為C-2的碳以外的 碳原子。上述碳可以被例如氮、氧或硫取代。上述吡咯烷骨架例如可以在吡咯烷的五元環 內包含例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。上述吡咯烷骨架中，構成吡咯烷的五元環的碳和氮 例如可以鍵合氫，也可以鍵合后述的取代基。上述連接子區域（Lx)例如可以介由上述吡咯 烷骨架中的任意基團而與上述區域（X)和上述區域（Xc)結合，優選為上述五元環中的任意 1個碳原子和氮，優選為上述五元環的2位的碳（C-2)和氮。作為上述吡咯烷骨架，可以舉 出例如脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。上述脯氨酸骨架和脯氨醇骨架等由于為例如生物體內 物質及其還原體，因此安全性也優異。
[0059] 本發明的ssPN分子中，上述哌啶骨架例如可以是構成哌啶的六元環的碳的1個 以上被取代了的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情況下，例如，優選為C-2的碳以外的碳原 子。上述碳可以被例如氮、氧或硫取代。上述哌啶骨架例如可以在哌啶的六元環內包含例 如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。上述哌啶骨架中，構成哌啶的六元環的碳和氮例如可以鍵合 氫基，也可以鍵合后述的取代基。上述連接子區域（Lx)例如可以介由上述哌啶骨架中的任 意基團而與上述區域（X)和上述區域（Xc)結合，優選為上述六元環中的任意1個碳原子和 氮，優選為上述六元環的2位的碳（C-2)和氮。
[0060] 上述連接子區域例如可以僅包含由上述非核苷酸結構構成的非核苷酸殘基，也可 以包含由上述非核苷酸結構構成的非核苷酸殘基與核苷酸殘基。
[0061] 本發明的SSPN分子中，上述連接子區域例如由下述式⑴表示。
[0062] [化學式1]
[0063]

【權利要求】
1. 一種單鏈核酸分子，其特征在于，其為包含抑制靶基因表達的表達抑制序列的單鏈 核酸分子， 包含區域（X)、連接子區域（Lx)和區域（Xc)， 在所述區域（X)與所述區域（Xc)之間連結有所述連接子區域（Lx)， 所述區域（Xc)與所述區域（X)互補， 所述區域（X)和所述區域（Xc)中的至少一者包含所述表達抑制序列， 所述連接子區域（Lx)具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一者的非核苷酸結 構。
2. 根據權利要求1所述的單鏈核酸分子，其中，所述連接子區域（Lx)由下述式（I)表 示， [化學式1]
所述式中， X1和X2各自獨立地為H2、0、S或NH ; Y1和Y2各自獨立地為單鍵、CH2、NH、0或S ; R3為與環A上的C-3、C-4、C-5或C-6鍵合的氫原子或取代基； L1為由η個原子構成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子可以被OH、0Ra、NH 2、 NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可以不被取代，或者， L1為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y1為ΝΗ、0或S的情況下，與Y1鍵合的L1的原子為碳，與0R 1鍵合的L1的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； L2為由m個原子構成的亞烷基鏈，此處，亞烷基碳原子上的氫原子可以被OH、0Re、NH 2、 NHRe、NReRd、SH或SRe取代，也可以不被取代，或者， L2為所述亞烷基鏈的一個以上碳原子被氧原子取代的聚醚鏈， 其中，Y2為ΝΗ、0或S的情況下，與Y2鍵合的L2的原子為碳，與0R 2鍵合的L2的原子為 碳，氧原子彼此不相鄰； Ra、Rb、Re和Rd各自獨立地為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0?30的范圍的整數； η為0?30的范圍的整數； 環Α可以是所述環Α上的C-2以外的1個碳原子被氮、氧或硫取代， 所述環A內可以包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵， 所述區域（Xc)和所述區域（X)分別介由-0R1-或-0R2-與所述連接子區域（Lx)結合， 此處，R1和R2可以存在，也可以不存在，在存在的情況下，R1和R 2各自獨立地為核苷酸 殘基或所述結構（I)。
3. 根據權利要求1或2所述的單鏈核酸分子，其中，所述區域（X)的堿基數（X)和所述 5'側區域（Xc)的堿基數（Xc)滿足下述式（3)或式（5)的條件。 X>Xc · · · (3) X = Xc · · · (5)
4. 根據權利要求3所述的單鏈核酸分子，其中，所述區域⑴的堿基數⑴和所述5' 側區域（Xc)的堿基數（Xc)滿足下述式（11)的條件。 X-Xc = 1、2 或 3 · · · (11)
5. 根據權利要求1?4中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述區域（Xc)的堿基數 (Xc)為19堿基?30堿基。
6. 根據權利要求2?5中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述式（I)中，L1為所述 聚醚鏈，所述聚醚鏈為聚乙二醇。
7. 根據權利要求2?6中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述式（I)中，L1的原子 個數（η)與L 2的原子個數（m)的合計（m+n)為0?30的范圍。
8. 根據權利要求2?7中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述式（I)的結構為下 述式（1-1)?式（1-9)中的任意一個，下述式中，η為0?30的整數，m為0?30的整數， q為〇?10的整數， [化學式3]
9. 根據權利要求8所述的單鏈核酸分子，其中，所述式（1-1)中，η = 8 ;所述（1-2)中， η = 3 ;所述式（1-3)中，η = 4或8 ;所述（1-4)中，η = 7或8 ;所述式（1-5)中，η = 3且 m = 4 ;所述（1-6)中，η = 8 且 m = 4 ;所述式（1-7)中，η = 8 且 m = 4 ;所述（1-8)中，η =5 且m = 4 ;所述式（1-9)中，q = 1 且m = 4。
10. 根據權利要求9所述的單鏈核酸分子，其中，所述式（1-4)為下述式（I-4a)，所述 式（1_8)為下述式（I_8a)， [化學式4]
11. 根據權利要求1?10中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述區域（X)的堿基數 (X)為19?30堿基。
12. 根據權利要求1?11中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述表達抑制序列的堿 基數為19?30堿基。
13. 根據權利要求1?12中任一項所述的單鏈核酸分子，其包含至少1個經修飾的殘 基。
14. 根據權利要求1?13中任一項所述的單鏈核酸分子，其包含標記物質。
15. 根據權利要求1?14中任一項所述的單鏈核酸分子，其包含穩定同位素。
16. 根據權利要求1?15中任一項所述的單鏈核酸分子，其為RNA分子。
17. 根據權利要求1?16中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述單鏈核酸分子中， 堿基數的合計為38堿基以上。
18. 根據權利要求1?17中任一項所述的單鏈核酸分子，其中，所述基因的表達抑制為 基于RNA干擾的表達抑制。
19. 一種表達抑制用組合物，其特征在于，其為用于抑制靶基因表達的組合物， 其包含權利要求1?18中任一項所述的單鏈核酸分子。
20. -種藥學組合物，其特征在于，其包含權利要求1?18中任一項所述的單鏈核酸分 子。
21. 根據權利要求20所述的藥學組合物，其為炎癥治療用。
22. 權利要求1?19中任一項所述的單鏈核酸分子在制備用于抑制靶基因表達的藥物 中的用途。
23. 根據權利要求22所述的用途，其中，所述基因的表達抑制為基于RNA干擾的表達抑 制。
24. 權利要求1?19中任一項所述的單鏈核酸分子在制備用于誘導抑制靶基因表達的 RNA干擾的藥物中的用途。
25. -種單鏈核酸分子，其特征在于，其為用于疾病的治療的核酸分子， 所述核酸分子為權利要求1?19中任一項所述的單鏈核酸分子， 所述單鏈核酸分子具有抑制成為所述疾病的原因的基因的表達的序列作為所述表達 抑制序列。
【文檔編號】C12N15/113GK104059911SQ201410217512
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2011年7月28日 優先權日:2010年8月3日
【發明者】大木忠明, 林宏剛, 白水久男, 濱崎智洋, 伊藤彰浩, 鈴木寬 申請人:株式會社博納克