專利名稱：棉花纖維發育中兩個新的microRNA基因與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及與陸地棉纖維發育相關的兩個未知miRNA (gAr-MflW和gA&M/及9)基因的克隆、鑒定和 用途。建立了野生型(WT)和無絨無絮纖維突變體(M)兩個小分子RNA文庫，采用了目前國際最先進 的高通量測序列技術，獲得了上述兩個新的miRNA基因序列。進一步分析了該miRNA的兩個耙基因，分 別編碼葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶，兩者分別控制纖維的伸長發育及細胞壁的形成和加 厚。本發明屬于生物技術領域。若以該miRNA及其靶基因作為目的基因對棉花進行深入的功能研究.在 一定程度上可有效地提高棉纖維的品質，具有一定的經濟及社會效益。
二背景技術：
MicroRNAs (miRNAs)是一類新發現的非編碼、長度約為21 nt的單鏈小分子RNA。近年來的大量研 究表明，miRNA在調節植物生長發育，細胞增值、脅迫響應等過程中發揮著重要的作用。棉花是一種重 要的經濟作物，其纖維是天然紡織材料的主要來源。我國是世界上最大的棉花生產和消費國，也是一個重 要的棉花貿易國，因此，棉花作為經濟作為在我國更是具有舉足輕重的地位 (http://www.emergingtextiles.com)。棉花纖維的發育機理成為備受關注的熱點，因為它關系到如何提高棉 纖維產量(提髙單位面積棉纖維伸長的數量)，改良纖維品質，而所有這些是與紡織工業和民生密切相關 的現實問題。
隨著現代分子生物學技術的發展，國內外除了利用常規育種手段外，逐步運用基因工程技術對棉纖維 品質進行遺傳改良。利用基因工程改良纖維品質依賴于對纖維發育相關基因及其調控元件的認識。因此， 開展分離、鑒定與棉花纖維發育相關的功能基因是培育優質棉纖維新品種，實現育種理論和關鍵技術新突 破的重要基礎，也是提升我國棉花育種原始創新力的關鍵舉措。
2007年我們實驗室率先在已有的棉花基因組中挖掘出了 37miRNA。這也是國內外迄今為止從棉花植 物中發掘到最多的miRNA。這些重要的miRNA基因對調控棉花生長及纖維發育具有重要的生物學意義及 潛在的生產開發價值。雖然目前已經知道與棉纖維發育相關的基因有上千個，但對這些基因的表達機理及 網絡調控知之甚少。因此，迫切需要對我國已有的特色棉花資源，通過大規模克隆方法充分挖掘和開發屬 于本國知識產權的新的miRNA (包括其它sRNA)基因，為后期定向改良和培育優質性狀的棉花種質奠定 基礎。
本專利所克隆到的兩個新的miRNA來自于陸地棉品種，而且只在突變體中表達，表明在野生型中這 兩個miRNA不表達，因此它們不會對葉綠體co-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因的轉錄產物mRNA進 行轉錄后的切割抑制。o-3-脂肪酸脫飽和酶在植物中催化脂肪酸脫飽和生成二烯脂肪酸，后者對維持細胞 膜的功能起著重要的作用。更重要的是三烯脂肪酸是茉莉酸合成的前體，而茉莉酸對細胞壁的形成有調節 作用。乙醇脫氫酶在細胞壁中以眾多的代謝物為底物催化木質素的鉸鏈，形成細胞壁的成分。因此，兩者 可能對纖維細胞壁的合成有著重要的影響。
事實上，脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶是多功能酶，這兩種酶參與植物對冷害脅迫反應的調節，基因突變導致植物對冷脅迫的高度敏感。兩者可能在棉花植物開花吐絲后期由于氣溫較低調節棉纖維的生伸發 育。但是上述兩個靶基因在調節棉花纖維合成中的具體功能還不清楚。因此，通過研究miRNA的調節功 能系統研究脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶在棉花纖維發育中的作用具有重要的生物學意義和潛在應用價值。
發明內容
技術問題本發明的目的是克隆陸地棉纖維發育過程中兩個重要的miRNA (g/w-Affl 和g/zr-AfflWO， 分析和鑒定了二級結構，同時分析得到了兩個靶基因，葉綠體0)-3-脂肪酸脫飽和酶和乙醇脫氫酶基因，分 析表明它們參與了棉纖維發育過程中細胞壁的合成。以此基因為基礎，通過基因工程的方法改變目前棉纖 維的品質特性，獲得一定的經濟及社會效益，為棉花的品質育種提供基因資源，盡快提高我國棉花品種的 纖維品質。
技術方案
陸地棉/^-g/^-M/i (基因表達前體)，長度為205bp ，序列如下:
陸地棉;^-g/^-M/卵(基因表達前體)，長度為296bp ，序列如下:
AATGAATCAAAAGAGAAGAAA
1. 按照IUumina Sample Preparation Protocol文庫構建方法，構建了陸地棉Xuzhou-142( WT)和Xuzhou-142 光籽突變體(M)開花后(0， 1， 2, 3, 4， 5， 6， 8， 10天，DPA)胚珠cDNA兩個文庫。
2. 從文庫中挑取克隆，進行轉化，將分析得到的高質量的長度為18-30 nt的RNA進行高通量測序。根據 測序結果，進一步進行BLAST比對分析，篩選符合miRNA標準的序列。生物信息學預測其靶基因。
有益效果
1. 目前常用的mRNA克隆分析技術效率低、不靈敏，有些表達豐度低的小分子RNA根本測不出來。 本研究采用目前國際上最先進的大規模高通量測序，其優點為
(1) 靈敏度高，準確性高，能夠測出一個小分子RNA，測定的RNA分子的堿基準確率高；
(2) 高通量、規模大，能夠測定所有基因組的轉錄子。兩個文庫的測序量高達到130萬條堿基序列 以上，包涵所有的小分子RNA序列；
(3) 同時測定小分子RNA的表達豐度，因此可以比較兩個基因文庫中小分子RNA表達譜的差異。
2. 本發明所克隆到的兩個miRNA (g/w-M/iW和g/w-M/i 0分別調控葉綠體co-3-脂肪酸脫飽和酶和 乙醇脫氫酶的耙基因，后者有研究表明參與細胞壁的合成，即與細胞壁的加厚有關，而細胞壁的此基因作為靶基因，對棉花進行轉化理論上可直接有效地提高 其強度，打破產量品質的負相關，獲得優質棉花，帶來可觀的經濟社會效益。
3. 目前轉基因的外源基因大部分來源于微生物，這類轉基因作物對安全性評價要求嚴格。本專利報 道的基因來源于棉花，再導入棉花不存在安全性評價問題。同時，與棉纖維發育相關的miRNA 基因目前在國內外申請的專利甚少。
4. 通過該基因的功能預測和分析，表明上述兩個靶基因參與棉纖維發育進程，通過農桿菌介導法將 該基因導入棉花，使其過量表達，獲得的轉基因植株將在棉纖維伸長或和加厚期大量表達，獲得 一定的經濟及社會效益，為棉花的品質育種提供基因資源，盡快提髙我國棉花品種的纖維品質。
四
圖l.g^-Affi^和ghr-MJi 9前體二級結構圖。miRNA從無絨無絮纖維突變體中克隆得到，并具有較 高的相對表達豐度。結構鑒定表明成熟miRNA片斷位于5'端(紅字黑線部分)。
五、 發明的具體實施例
1. 棉花胚珠采集棉花種植地為江蘇省農科院試驗田，開花期進行掛牌。胚珠釆集后立即液氮冷凍，-80°C
冰箱保存，備用。
2. 按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構建方法，構建了陸地棉Xuzhou-142( WT)禾卩Xuzhou-142 光籽突變體(M)開花后0， 1， 2， 3, 4, 5， 6， 8， 10天(DPA)胚珠混合cDNA兩個文庫。
3. 從文庫中挑取克隆，進行分離鑒定，將分析得到的高質量的長度為18-30 nt的RNA進行高通量測序。 根據測序結果，進一步進行BLAST比對分析，篩選符合miRNA標準的序列。生物信息學預測其耙基 因。
5SEQUENCE LISTING
<110>南京農業大學
<120>棉花纖維發育中兩個新的microRNA基因與用途 <130>說明書
<160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 205
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum <220>
<221> ghr-MIR3前體基因
<222> (1)..(205) <223><400> 1
aactaatcct tgtacattag atcaaagagc aaacttatca tttctattaa aaactaacgt 60
gattgatgga ttaaccagac agttacacgt agcgtgccac atgtatctca tttgagaggt 120
aggcacaagt ttttagcaat agaaatagat gggatttcaa cagaaggacc aatttgctct 180 ttgatctagt atacaatgac taatt
205
<210>. 2 <211> 296 <212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> ghr-MIR9前體基因
<222> (1)"(296) <223>
<400> 2
ttcttctctt tagattcatt ggctgagtta aaacagcagc acaaatttcg gggtcaagaa 60
ttttatatgc. aggtgaaaaa accactttta acttaaaaat attctttttc cgeaaaaata 120 ccggaaaacg ctagtgtttt aaagttaaat atgcgattaa aaaaaccttt ctacccaaat 180 attgagaagt tggttaaaag aattttaaac tcgacatcga gtcaaagtca tcgagtttaa 240 gacctaaaac caaatatctg aatattaact cagctaatga atcaaaagag aagaaa 29權利要求
1.兩個新發現的miRNA基因(ghr-MIR3和ghr-MIR9)的成熟片斷分別為21和22堿基(表1)。
2. 根據權利要求l，這兩個miRNA基因只在突變體(M)中表達，而在野生型(WT)中不表達(表2)， 表明這兩個miRNA基因.對纖維發育功能有著不可缺少的作用。
3. 根據權利要求l，通過生物信息學預測到12個靶基因(表3)。表l.陸地棉(GoMj^MH7feVTOtom)新發現的miRNA成熟片斷。M:突變體__Precursor Library_5p成熟片斷(5'-3)_g/w-M/i 3 DR459348 M TGTACATTAGATCAAAGAGCAA(22) g/w-M/i 9 TA40540 M TAGATTCATTGGCTGAGTTAA (21)表2.陸地棉(GomwZww fe'rawtow)新的miRNA及表達豐度(Reads)。 5p禾B 3p分別指成熟miRNA在 5鄰3'端。WT:野生型IDLibrary5p Reads3p Reads表達(相對于WT)M010 上調M120 上調表3. 和g/zr-Affl^的耙基因miRNAGene ID耙基因Ghr-MIR3DT455847葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶Chloroplast omega 3 fatty acid desaturaseGhr-MIR9TA20488乙醇脫氫酶TA20490Putative alcohol dehydrogenaseTA20491TA20492TA20493TA20494TA20495CD485586CD485902CD486113DN803191全文摘要
MicroRNAs(miRNAs)是一類新發現的非編碼長度約為21nt的內源小分子RNA。它們可以與其特定的靶基因mRNA互補結合，通過引起靶基因的降解或翻譯抑制來調節基因的表達。本發明建立了棉花野生型(Xuzhou-142)及其無絨無絮纖維突變體(光籽，Xuzhou 142 fuzzless-lintless)胚珠兩個小分子RNA文庫，采用了目前國際最先進的高通量測序技術(Solexa)，獲得了2個未知的miRNAs基因，暫時命名為ghr-MIR3和ghr-MIR9，并研究其在棉花纖維初始發育過程中的不同表達豐度。通過生物信息學預測到了12個靶基因，其中ghr-MIR3靶基因編碼葉綠體omega 3-脂肪酸脫飽和酶(omega 3-fatty acid desaturase)，而ghr-MIR9靶基因編碼乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)。上述研究結果迄今為止尚未見有報道，通過基因工程手段與方法為深入研究調控棉纖維生長發育和改良纖維品質奠定了基礎。
文檔編號C12N15/11GK101565701SQ200910029480
公開日2009年10月28日 申請日期2009年4月14日 優先權日2009年4月14日 公開號200910029480.發明者楊志敏, 王芹芹, 陳旭升 申請人:南京農業大學 被以下專利引用 (1),