棉花轉基因事件mon88701及其使用方法

棉花轉基因事件mon88701及其使用方法
【專利摘要】本發明提供棉花事件MON88701以及包含事件MON88701的植物、植物細胞、種子、植物部分和商品。本發明還提供事件MON88701特異性的多核苷酸以及包含事件MON88701特異性多核苷酸的植物、植物細胞、種子、植物部分和商品。本發明還提供與事件MON88701相關的方法。
【專利說明】棉花轉基因事件M0N88701及其使用方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月30日提交的美國臨時申請號61 / 469，118的利益，將其全文通過引用并入本文。
[0003]序列表并入
[0004]在名稱為“M0NS302W0.txt”的文件中包含的序列表通過電子提交與本文一起提交并通過引用并入本文，所述文件為21千字節(在Microsoft Windows?中測量的大小) 并在2012年3月9日產生。
發明領域
[0005]本發明涉及轉基因棉花(Gossypium hirsutum)事件M0N88701。所述事件表現出對麥草畏和草銨膦除草劑的耐受性。本發明還涉及與事件M0N88701相關的植物、植物部分、植物種子、植物細胞、農產品和方法，并提供了所述事件獨有的并與轉基因DNA插入棉花植物的基因組中相關聯而產生的核苷酸分子。
[0006]發明背景
[0007]棉花(陸地棉)在世界上許多地區是重要的作物，并且為了生產具有所需性狀的棉花，已將生物技術方法應用于這種作物。一種這樣的所需性狀是除草劑耐受性。除草劑耐受性轉基因在植物中的表達能夠賦予植物所需的除草劑耐受性狀，但是轉基因的表達可能受到轉基因插入的染色體位置和基因組結果的影響。例如，已經在植物中觀察到，在轉基因的染色體插入位點方面不同但在其他方面都相同的單個事件之間，通常存在著轉基因表達水平和模式的變異。在事件之間還可能存在不想要的和/或想要的表型或農學差異。因此，為了選擇具有所需性狀和使其適合于商業化目的所需的最適表型和農業特性兩者的事件，通常需要產生并分析大量單個植物轉化事件。這樣的選擇通常需要經過多年、在多個地點并在多種不同條件下對許多事件進行溫室和田間試驗，以便可以收集到大量農藝學、表型和分子數據。然后必須由科學家和農學家對得到的數據和觀察進行分析，其目的是選擇商業上適合的事件。這樣的事件一旦被選擇，隨后可能用于使用植物育種方法將所需性狀滲入到其他遺傳背景中，并由此產生含有所需性狀并適當地適應于特定當地生長條件的大量不同作物品種。
[0008]發明概沭
[0009]本發明提供了包含事件M0N88701的轉基因棉花植物，其對麥草畏和草銨膦除草劑的施用表現出可接受的耐受性，并且代表性種子樣品已在專利保藏名PTA-11754下保藏于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection) ( ATCC?)。本發明還提供了與棉花事件M0N88701相關的新的DNA分子以及使用這些分子的方法。本發明還提供了包含事件M0N88701的棉花植物的種子、后代、植物部分、細胞和商品。本發明還提供了使用棉花事件M0N88701的方法以及生產對麥草畏和草銨膦除草劑兩者耐受的棉花的方法。
[0010]本發明提供了與棉花事件M0N88701相關的重組DNA分子。 這些重組DNA分子可能包含具有代表了轉基因插入側翼的基因組DNA的區域，和/或轉基因插入的區域，和/ 或任何這些區域的連續序列(例如棉花事件M0N88701的轉基因插入片段與側翼基因組 DNA之間的連接區域)的核苷酸序列的核苷酸分子。本發明還提供了可用作診斷棉花事件 M0N88701的引物和探針的DNA分子以及診斷棉花事件M0N88701的存在的擴增子。還公開了包含這些分子的棉花植物、植物細胞、植物部分、商品、后代和種子。
[0011]本發明提供了可用于檢測源自于棉花事件M0N88701的DNA的存在和/或不存在， 并因此可用于檢測所述事件的存在和/或不存在的方法、組合物和試劑盒。本發明提供了一種用于通過將包含DNA的樣品與當與來自于包含事件M0N88701的棉花植物或種子的基因組DNA —起在核酸擴增反應中使用時產生可用于診斷棉花事件M0N88701的擴增DNA的引物組相接觸，進行核酸擴增反應由此產生所述擴增DNA，以及檢測所述擴增DNA的存在和/或不存在而檢測M0N88701的方法。本發明還提供了一種用于通過將包含DNA的樣品與當與來自于棉花事件M0N88701的DNA —起在雜交反應中使用時與棉花事件M0N88701特有的DNA分子雜交的探針相接觸，從而進行雜交反應，以及檢測所述探針與所述DNA分子的雜交而檢測M0N88701的方法。還提供了可用于檢測源自于棉花事件M0N88701的DNA的存在的包含本發明的方法和組合物的試劑盒。
[0012]本發明提供了源自于包含棉花事件M0N88701的植物、植物細胞或種子的棉花植物、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或商品。本發明還提供包含重組DNA分子的棉花植物、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或商品，所述重組DNA分子具有選自SEQ ID NO:1一 10及其互補序列和片段的核苷酸序列。本發明還提供了源自于包含棉花事件M0N88701 并包含重組DNA分子的植物或種子的棉花植物、種子、植物細胞、后代植物、植物部分或商品，所述重組DNA分子在DNA擴增方法中產生包含選自SEQ ID NO:1—10的序列的擴增的 DNA分子。
[0013]本發明提供了用于控制田間雜草的方法，所述方法包括種植包含事件M0N88701 的棉花植物，然后施用能夠控制雜草而不傷害含有棉花事件M0N88701的植物的有效劑量的麥草畏、草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑兩者。本發明還提供了用于控制田間雜草的方法，所述方法包括施用有效劑量的至少麥草畏、草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑以控制田間雜草，然后將包含事件M0N88701的棉花植物種植在田地中。本發明還提供了用于生產基本上不含雜草種子的棉花種子或棉絨的方法，所述方法包括將包含M0N88701的麥草畏和草銨膦耐受棉花植物的種子種植在田地中，向所述田地施用足以殺死雜草物種的萌發后有效劑量的至少麥草畏、草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑，以及從所述田地收獲種子或棉絨。
[0014]本發明提供了用于生產耐受麥草畏和草銨膦除草劑施用的棉花植物和/或種子的方法，所述方法包括將含有棉花事件M0N88701的包含選自SEQ ID NO:1一 10的序列的植物與第二棉花植物進行有性雜交，由此產生種子，生長所述種子以產生后代植物，用麥草畏和/或草銨膦處理所述后代植物，以及選擇對麥草畏和草銨膦兩者耐受的后代植物。該方法還可以包括將所選擇的后代植物自交以產生多個第二代后代植物，并從其中選擇麥草畏和草銨膦耐受植物。所述方法還可以包括將所選擇的后代植物與另一種棉花植物進行有性雜交以產生種子，生長所述種子以產生第二代后代植物，用麥草畏和/或草銨膦處理所述第二代后代植物，以及選擇耐受麥草畏和草銨膦的第二代后代植物。本發明提供了生產耐受麥草畏和草銨膦除草劑施用的棉花植物和/或種子的方法，所述方法包括對包含事件M0N88701的含有選自SEQ ID NO:1一 10的序列的麥草畏和草銨膦耐受棉花植物進行自交，由此產生種子，生長所述種子以產生后代植物，用麥草畏和/或草銨膦處理所述后代植物，以及選擇耐受麥草畏和草銨膦的后代植物。本發明提供了確定含有棉花事件M0N88701 的植物或種子的接合性的方法，所述方法包括將棉花DNA樣品與包含SEQ ID NO:11、12和 14的引物組及包含SEQ ID NO:13和15的探針組相接觸；然后進行所述樣品、引物組和探針組的核酸擴增反應；然后在所述核酸擴增反應中檢測診斷事件M0N88701的第一熒光信號以及與所述第一熒光信號不同而診斷對應于事件M0N88701轉基因的插入位置的天然棉花基因組DNA的第二熒光信號；以及分析所述核酸擴增反應中所述第一熒光信號和所述第二熒光信號的存在和/或不存在，其中兩種熒光信號的存在表明所述樣品對事件M0N88701 是雜合的，且僅有所述第一熒光信號存在表明所述樣品對事件M0N88701是純合的。本發明還提供了包含麥草畏和草銨膦耐受性基因的棉花植物、種子、植物細胞或植物部分及其使用方法，所述麥草畏和草銨膦耐受性基因被定位于染色體A08上19.3cM的圖位處，并且在左側以18.6cM圖位處的NG0207927為界和在右側以20.0cM的圖位處的NG0207529為界。 從下面的詳細說明，本發明的上述和其他方面將變得更加明顯。
[0015]附圖簡沭
[0016]圖1示出了轉基因插入片段在包含事件M0N88701的棉花植物的基因組中的組構。 [A]對應于SEQ ID NO:1的相對位置；[A’]對應于SEQ ID NO:3的相對位置；[A”]對應于 SEQ ID NO:5的相對位置；[B]對應于SEQ ID NO:2的相對位置；[B，]對應于SEQ ID NO: 4的相對位置；[B” ]對應于SEQ ID NO:6的相對位置；[C]對應于SEQ ID NO:7的相對位置；[D]對應于SEQ ID NO:8的相對位置；[E]對應于SEQ ID NO:9的相對位置；[F]對應于SEQ ID NO:10的相對位置；SQ21654和SQ23205對應于用于鑒定棉花事件M0N88701的引物的相對位置。
[0017]圖2示出了以每英畝籽棉磅數報告的兩年農學產量田間試驗數據。
[0018]圖3示出了以每英畝籽棉磅數報告的第一年產量田間試驗數據。
[0019]圖4示出了以每英畝籽棉磅數報告的第二年產量田間試驗數據，其使用增加量的麥草畏(4.A.)或草銨膦(4.B.)除草劑。
[0020]圖5示出了使用增 加量的麥草畏(5.A.)或草銨膦(5.B.)除草劑時出現的壞死斑點的百分率。
[0021]圖6示出了用于事件M0N88701的噴灑方案的以每英畝籽棉磅數計的產量田間試驗數據。
[0022]圖7顯示了田間用麥草畏和草銨膦噴灑的包含事件M0N88701的植物與非轉基因 Coker 130植物。除草劑施用是事先施用Ilb麥草畏(2X)，2葉時施用Ilb草銨膦(2X)，5葉時施用Ilb麥草畏，以及8葉時施用Ilb草銨膦。
[0023]序列簡沭
[0024]SEQ ID NO:1是20個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的5’連接區域。SEQ ID NO:1位于SEQ ID NO:10中1117 —1136核苷酸位置處。
[0025]SEQ ID NO:2是20個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的3’連接區域。SEQ ID NO:2位于SEQ ID NO: 10中5222— 5241核苷酸位置處。
[0026]SEQ ID NO:3是60個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的5’連接區域。
[0027]SEQ ID NO:4是60個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的3’連接區域。
[0028]SEQ ID NO:5是100個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的5’連接區域。
[0029]SEQ ID NO:6是100個核苷酸的序列，其表示棉花基因組DNA與整合的轉基因表達盒的3’連接區域。
[0030]SEQ ID NO:7是側鄰M0N88701的插入DNA直到并包括一部分整合的轉基因表達盒的5’序列。
[0031]SEQ ID NO:8是側鄰M0N88701的插入DNA直到并包括一部分整合的轉基因表達盒的3’序列。
[0032]SEQ ID NO:9是整合的轉基因表達盒的序列。
[0033]SEQ ID NO:10是側鄰插入DNA的5’序列(SEQ ID NO:7)、整合的轉基因表達盒 (SEQ ID NO:9)和側鄰插入DNA的3’序列(SEQ ID NO:8)的連續核苷酸序列。SEQ ID NO:
10包含 SEQ ID NO:1一9。
[0034]SEQ ID NO:11是被稱為引物SQ21654并用于鑒定棉花事件M0N88701的引物的序列。它在接近3’轉基因插入邊界的區域處與插入的表達盒互補。使用引物SQ21654和 SQ23205 (SEQ ID NO:12)的組合從TAQMAN? (PE Applied Biosystems,Foster City, CA)分析產生的PCR擴增子是存在事件M0N88701的陽性結果。該引物組也可用于在接合性分析中鑒定M0N88701事件。
[0035]SEQ ID NO:12是被稱為引物SQ23205并用于鑒定棉花事件M0N88701的引物的序列。它與側鄰插入的表達盒的3’區域互補并靠近轉基因插入邊界。使用引物SQ21654(SEQ ID NO:11)和 SQ23205 的組合從TAQMAN? (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)分析產生的PCR擴增子是存在事件M0N88701的陽性結果。它也是用于在接合性分析中鑒定M0N88701事件和野生型的引物。
[0036]SEQ ID NO:13是被稱為探針PB10280并用于鑒定棉花事件M0N88701的探針的序列。它與插入的表達盒的區域互補并鄰近基因組DNA的3’接合部。該探針是6-FAM?標記的合成寡核苷酸。在使用引物SQ21654和SQ23205(SEQ ID NO:11—12)與6-FAM?標記的探針PB10280結合的擴增反應中熒光信號的釋放在TAQMAN?分析中診斷事件 M0N88701。PB10280也是在接合性分析中用于鑒定M0N88701事件的探針。
[0037]SEQ ID NO:14是被稱為引物SQ23901并用于在M0N88701接合性分析中鑒定棉花野生型等位基因的引物的序列。
[0038]SEQ ID NO:15是被稱為探針PB10631并用于在M0N88701接合性分析中鑒定棉花野生型等位基因的VIC?標記的探針的序列。
[0039]詳細描沭
[0040]提供下面的定義 和方法是為了更好地定義本發明并在本發明的實施中指導本領域的普通技術人員。除非另有指明，否則術語應該由相關領域的普通技術人員根據慣常用法來理解。
[0041]本發明提供了轉基因棉花事件M0N88701，其對麥草畏和草銨膦除草劑的施用表現出商業上可接受的耐受性。所述事件包含轉基因DNA在棉花種質的染色體/基因組中的單一插入。“事件”通過下述步驟產生:(i)用包括目標轉基因的核酸構建物轉化植物細胞，
(ii)再生由轉基因在植物基因組中的插入獲得的植物群體；以及(iii)選擇以轉基因插入到植物基因組中的特定位置為特征的特定植物。
[0042]術語“事件”是指包含插入的DNA和緊鄰插入的DNA的任一側的側翼棉花基因組 DNA的DNA分子。該DNA分子通過將轉基因DNA插入到棉花植物的基因組中的行動、即轉化行動來產生。因此，該DNA分子包含對所述事件特異性的，并且對于其中插入有轉基因DNA 的棉花植物基因組來說獨有的核苷酸序列，因為該核苷酸序列含有棉花基因組DNA的特定區域和轉基因DNA插入片段兩者的序列。因此，在棉花事件M0N88701中插入的DNA相對于周圍棉花植物的基因組DNA的排列方式對于棉花事件M0N88701來說是特異性的和獨有的。 該DNA分子也是包含事件M0N88701的植物的棉花染色體的整體組成部分，因此在植物中是靜態的并且可以傳遞給植物的后代。
[0043]本發明還提供了包括插入到植物基因組的特定位置中的轉基因的原始轉化體，以及所述轉化體的包括插入到植物基因組的特定位置中的轉基因的后代。這樣的后代可以通過轉化體或其后代與另一植物之間的有性異交來產生。這樣的其他植物可以是包含相同或不同轉基因的轉基因植物和/或非轉基因植物，例如來自于不同品種的植物。即使在與輪回親本重復回交后，來自于被轉化親本的插入DNA和側翼DNA也存在于雜交后代中的相同基因組位置 處。
[0044]當在本文中使用時，術語“棉花”是指陸地棉(Gossypium hirsutum),并包括可以與棉花育種的所有植物品種，包括野生棉物種和屬于棉屬(Gossypium)的允許種間繁育的植物。
[0045]事件M0N88701包含整合的轉基因表達盒，其賦予棉花植物對麥草畏和草銨膦除草劑施用的耐受性。“麥草畏”是指3，6_ 二氯-2-甲氧基苯甲酸。麥草畏是可用于控制闊葉雜草的合成的范長素除草劑。用來自于嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的編碼麥草畏單加氧酶(DMO)的基因(dmo)轉化棉花植物。DMO是催化經
0-去甲基化反應將麥草畏滅活成非除草性化合物3，5- 二氯水楊酸的酶。“草銨膦”是指 2-氨基-4-(羥甲基膦)丁酸。草銨膦是可用于控制廣譜的一年生和多年生禾草和闊葉雜草的有機磷除草劑。用來自于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的編碼草丁膦乙酰轉移酶(PAT)的雙丙氨膦抗性基因(bar)轉化棉花植物。PAT是催化草銨膦的乙酰化并因此使其失活的酶。
[0046]當在本文中使用時，術語“重組的”是指通常不存在于自然界中并且因此通過人類干預而產生的DNA和/或蛋白質和/或生物體形式。這樣的人類干預可以產生重組DNA分子和/或重組植物。當子本文中使用時，“重組DNA分子”是包含在自然界中不一起出現而由于人類干預而產生的DNA分子組合的DNA分子，例如包含彼此異源的至少兩個DNA分子的組合的DNA分子，和/或由人工合成并包含與自然界中正常存在的多核苷酸序列有偏差的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工整合到宿主細胞的基因組DNA中的轉基因和宿主細胞基因組的相關側翼DNA的DNA分子。重組DNA分子的實例是本文中描述的通過將轉基因插入到棉花基因組DNA中而得到的DNA分子，其可能最終導致重組RNA和/或蛋白質分子在該生物體中表達。當在本文中使用時，“重組植物”是通常在自然界中不存在，是人類干預的結果的植物，并且含有整合到其基因組中的轉基因和/或異源DNA分子。作為這樣的基因組改變的結果,重組植物與相關的野生型植物明顯不同。重組植物的實例是本文中描述的包含事件M0N88701的棉花植物。
[0047]當在本文中使用時，術語“轉基因”是指人工整合到宿主細胞基因組中的核苷酸分子。這樣的轉基因對于所述宿主細胞可能是異源的。術語“轉基因植物”是指包含這樣的轉基因的植物。
[0048]當在本文中使用時，術語“異源的”是指在自然界中第一分子通常不與第二分子組合存在。例如，一個分子可能源自于第一物種并被插入到第二物種的基因組中。因此，所述分子對于所述宿主來說是異源的，并人工整合到宿主細胞的基因組中。
[0049]當在本文中使用時，術語“嵌合的”是指通過將第一 DNA分子與第二 DNA分子融合而產生的單一 DNA分子，其中第一和第二 DNA分子通常都不以該構造(即彼此融合)存在。 因此，嵌合的DNA分子是通常不存在于自然界中的新的DNA分子。
[0050]本發明提供了 DNA分子及其相應的核苷酸序列。當在本文中使用時，術語“DNA”、 “DNA分子”、“核苷酸分子”是指基因組或合成來源的DNA分子，即脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，其從5’(上游)末端向3’(下游)末端閱讀。當在本文中使用時，術語“DNA序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”是指DNA分子的核苷酸序列。在本文中使用的命名法是美國聯邦法規編碼(United States Code of Federal Regulations) § 1.822 的第37條所規定的、并在WIPO Standard ST.25(1998)附錄2的表1和3中列出的命名法。 按照慣例，作為SEQ ID NO:1 —10提供的本發明的核苷酸序列及其片段僅針對兩條互補核苷酸序列鏈中的一條鏈來公開。這暗示了互補序列(即互補鏈的序列)(在本【技術領域】中也稱為反向互補序列)在本發明的范圍之內，并且明確地打算在所要求保護的主題的范圍之內。[0051]與插入的轉基因DNA和所述插入的轉基因DNA任一末端側翼的棉花基因組DNA的實質片段的完整核苷酸序列對應的核苷酸序列在本文中以SEQ ID N0:10提供。它的子區段是以SEQ ID N0:9提供的插入的轉基因DNA。通過磷酸二酯鍵物理連接于插入的轉基因 DNA并因此鄰接于其5’末端的棉花基因組DNA的核苷酸序列如圖1中所示，并以SEQ ID NO:1、3、5和7提供。通過磷酸二酯鍵物理連接于插入的轉基因DNA并因此鄰接于其3’末端的棉花基因組DNA的核苷酸序列如圖1中所示，并以SEQ ID NO:2、4、6和8提供。
[0052]棉花事件M0N88701還包含兩個區域，一個區域跨越轉基因DNA插入到基因組DNA 中的5’位置，另一個區域跨越3’位置，在本文中分別被稱為5’和3’接合部。“接合部序列”或“接合部區域”是指跨越插入的轉基因DNA和相鄰的側翼基因組DNA的DNA序列和/ 或相應的DNA分子。接合部序列可以任意地用以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2提供的核苷酸序列來表示，所述序列各表示與插入DNA的10個核苷酸相鄰并毗連的側翼基因組DNA 的10個核苷酸。或者，接合部序列可以任意地用被以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4提供的兩個60個核苷酸的序列來表示，所述序列各表示與插入DNA的30個核苷酸相鄰并毗連的側翼基因組DNA的30個核苷酸。或者，接合部序列可以任意地用以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6提供的兩個100個核苷酸的序列來表不,所述序列各表不與插入DNA的50個核苷酸相鄰并毗連的側翼基因組DNA的50個核苷酸。這些核苷酸通過磷酸二酯鍵相連，并且在棉花事件M0N88701中作為基因組的部分存在。在源自于棉花植物、種子或植物部分的樣品中SEQ ID NO:1—10中的一個或多個的鑒定能夠確定所述DNA是從棉花事件M0N88701獲得，并且能夠診斷樣品中來自于棉花事件M0N88701的DNA的存在。因此，本發明提供了含有至少一個以SEQ ID NO:1-10提供的核苷酸序列的DNA分子。足以包含至少一個以SEQ ID NO:1—10提供的序列的源自于轉基因棉花事件M0N88701的任何DNA片段在本發明的范圍之內。此外，包含與本段落中描述的任何序列互補的序列的任何多核苷酸在本發明的范圍之內。圖1示出了 SEQ ID NO:1—9從5’向3’排列的相對于SEQ ID NO:10的物理排列。
[0053]本發明提供了可以用作診斷樣品中源自于包含事件M0N88701的棉花植物的DNA 的存在的引物或探針的示例性DNA分子。這樣的引物或探針對于目標核酸序列是特異性的，且因此可用于通過本文中描述的本發明的方法鑒定棉花事件M0N88701的核酸序列。
[0054]“引物”通常是高度純化的分離的多核苷酸，其被設計用于涉及熱擴增的特異性退火雜交方法中。一對引物可以與模板DNA例如棉花基因組DNA樣品一起使用在熱擴增例如聚合酶鏈反應(PCR)中，以產生擴增子，其中從這樣的反應產生的擴增子具有與位于引物雜交到模板處的兩個位點之間的模板DNA的序列相對應的DNA序列。當在本文中使用時， “擴增子”是使用擴增技術合成的DNA碎片或片段。本發明的擴增子包含至少一個以SEQ ID NO:1—10提供的序列。弓丨物通常被設計成與互補的靶DNA鏈雜交以在引物與靶DNA鏈之間形成雜交體，并且引物的存在是聚合酶使用靶DNA鏈作為模板開始引物延伸(即另外的核苷酸聚合到伸長的核苷酸分子中)的識別位點。當在本發明中使用時，引物對意圖指使用結合雙鏈核苷酸片段的相反鏈的兩個引物以通常在熱擴增反應或其他常規核酸擴增方法中實現線性擴增由引物對的單個成員的結合所靶定的位置之間的多核苷酸片段的目的。可用作引物的示例性DNA分子以SEQ ID NO:11 一 12提供。以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO: 12提供的引物對可用作第一 DNA分子和與所述第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，并且兩者各具有SEQ ID NO:10的足夠長度的連續核苷酸以起到當在熱擴增反應中與源自于棉花事件M0N88701的模板DNA —起使用時，產生診斷樣品中棉花事件M0N88701DNA的擴增子的 DNA引物的作用。
[0055]“探針”是與靶核酸鏈互補的分離的核酸。根據本發明的探針不但包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚酰胺和特異性結合于靶DNA序列的其他探針材料，并且這種結合的檢測可用于診斷、辨別、確定或證實靶DNA序列在特定樣品中的存在。探針可以連接于常規的可檢測標記或報告分子，例如放射性同位素、配體、化學發光劑或酶。可用作探針的示例性DNA分子以SEQ ID NO:13提供。
[0056]根據本發明的探針和引物可以與靶序列具有完全的序列同一性，盡管可以通過常規方法來設計保持與靶序列優先雜交的能力的而與靶序列不同的引物和探針。為了使核酸分子起到引物或探針的作用，只需要在序列中足夠互補以便能夠在所使用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構。可以使用任何常規的核酸雜交或擴增方法來鑒定樣品中來自于棉花事件M0N88701的轉基因DNA的存在。探針和引物的長度一般為至少約11個核苷酸、至少約18個核苷酸、至少約24個核苷酸或至少約30個核苷酸或更長。這樣的探針和引物在嚴格雜交條件下與靶DNA序列特異性雜交。常規的嚴格性條件描述在Samtoook 等，1989 和 Haymes 等，Nucleic Acid Hybridization, APractical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)中。當在本文中使用時,如果兩個核酸分子能夠形成反向平行的雙鏈核酸結構，則這兩個分子能夠彼此特異性雜交。如果兩個核酸分子表現出完全互補性，則一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補體”。當在本文中使用時，如果兩個分子在比對時，第一分子的每個核苷酸與第二分子的每個核苷酸互補，則這兩個分子表現出“完全互補性”。 如果兩個分子可以以足夠的穩定性彼此雜交以允許它們在至少常規的“低嚴格性”條件下保持彼此退火，則這兩個分子是“最低互補的”。同樣地，如果分子能夠以足夠的穩定性彼此雜交以允許它們在常規的“高嚴格性”條件下保持彼此退火，則它們是“互補的”。因此，偏離完全互補性是容許的，只要這樣的偏離不完全排除分子形成雙鏈結構的能力即可。
[0057]當在本文中使用時，術語“分離的”是指分子至少部分地與在天源或自然狀態下通常與其相伴的其他分子分離。在一種實施方式中，術語“分離的”是指DNA分子與在天源或自然狀態下通常鄰接所述DNA分子的核酸至少部分地分離。因此，例如作為重組技術的結果，與正常情況下不與其相關的調節或編碼序列融合的DNA分子在本文中被認為是分離的。即使在整合到宿主細胞的染色體中或與其他DNA分子一起存在于核酸溶液中時，這樣的分子也被認為是分離的。
[0058]可以使用本領域技術人員公知的大量方法來分離和操作本發明中公開的DNA分子或其片段。例如，可以使用PCR(聚合酶鏈反應)技術來擴增特定的起始DNA分子和/或產生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可以通過其他技術來獲得，例如通過使用化學手段直接合成所述片段，正如通常通過使用自動化寡核苷酸合成儀所實現的。
[0059]因此，本文中提供的DNA分子和相應的核苷酸序列除了其他用途之外，可用于鑒定棉花事件M0N88701、選擇包含棉花事件M0N88701的植物品種或雜種、檢測樣品中源自于轉基因棉花事件M0N88701的DNA的存在以及監測樣品中棉花事件M0N88701或源自于包含事件M0N88701的棉花植物的植物部分的存在和/或不存在。
[0060]本發明提供了棉花植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、莢、花組織、根組織、莖組織和葉組織)和商品。這些植物、后代、種子、植物細胞、植物部分和商品含有可檢測量的本發明的多核苷酸，即例如具有以SEQ ID NO:1—10提供的至少一個序列的多核苷酸。本發明的植物、后代、種子、植物細胞和植物部分也可以含有一個或多個其他的轉基因。這樣的轉基因可以是編碼賦予所需性狀的蛋白質或RNA分子的任何核苷酸序列，所 述性狀包括但不限于提聞的抗蟲性、提聞的水利用效率、提聞的廣量性能、提聞的抗旱性、提高的種子品質、性狀的營養品質和/或提高的除草劑耐受性，其中所述所需性狀相對于缺少這樣的其他轉基因的棉花植物測定。
[0061]本發明提供了源自于包含事件M0N88701的轉基因棉花植物的棉花植物、后代、種子、植物細胞和植物部分例如花粉、胚珠、莢、花、根或莖組織和葉。包含事件M0N88701的棉花種子的代表性樣品已按照布達佩斯公約(Budapest Treaty)保藏于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection) (ATCC?)。ATCC 保藏機構已將專利保藏號PTA-11754指派給包含事件M0N88701的種子。
[0062]本發明提供了包含存在于基因組中的具有選自SEQ ID NO:1 —10的至少一個序列的DNA分子的微生物。這樣的微生物的實例是轉基因植物細胞。微生物，例如本發明的植物細胞，可用于許多工業應用中，包括但不限于:(i)用作科學探索或工業研究的研究工具；(ii)用于培養以產生內源或重組的糖、脂質、核酸或蛋白質產物或小分子，其可用于隨后的科學研究或作為工業產品；以及(iii)用于現代植物組織培養技術以產生隨后可用于農業研究或生產的轉基因植物或植物組織培養物。微生物例如轉基因植物細胞的產生和使用利用了現代微生物學技術和人類干預來生產人造的獨特的微生物。在這一過程中，將重組DNA插入到植物細胞的基因組中以產生與天然存在的植物細胞分離的和獨特的轉基因植物細胞。這種轉基因植物細胞隨后可以使用現代微生物學技術以更類似于細菌和酵母細胞的方式培養，并且可以以未分化的單細胞狀態存在。新植物細胞的遺傳組成和表型是由異源DNA整合到細胞基因組中所產生的技術效果。本發明的另一方面是本發明微生物的使用方法。使用本發明的微生物例如轉基因植物細胞的方法包括(i)通過將重組DNA整合到細胞的基因組中，然后使用該細胞衍生具有相同異源DNA的其他細胞生產轉基因細胞的方法；(ii)使用現代微生物學技術培養含有重組DNA的細胞的方法；(iii)生產和純化來自于培養細胞的內源或重組糖、脂質、核酸或蛋白質產物的方法；以及(iv)使用現代植物組織培養技術使用轉基因植物細胞生產轉基因植物或轉基因植物組織培養物的方法。
[0063]本發明的植物可以將事件DNA(包括轉基因)傳遞給后代。當在本文中使用時，“后代”包括包含源自于祖先植物的事件DNA和/或包含具有選自SEQ ID NO:1一 10的至少一個序列的DNA分子的任何植物、種子、植物細胞和/或可再生植物部分。植物、后代和種子對于所述轉基因可以是純合的或雜合的。可以從由含有棉花事件M0N88701的植物產生的種子和/或從用來自于含有棉花事件M0N88701的植物的花粉授粉的植物所產生的種子來生長后代。
[0064]后代植物可以自花授粉(也稱為“自交”)以產生植物的純育品系，即對轉基因純合的植物。適宜的后代的自交可以產生對兩種添加的外源基因純合的植物。
[0065]或者，后代植物可以異交，例如與另一種無親緣關系的植物雜交，以產生變種或雜種種子或植物。所述另外的無親緣關系的植物可以是轉基因的或非轉基因的。因此， 本發明的變種或雜種種子或植物可以通過將缺少棉花事件M0N88701的特異性和獨特的 DNA的第一親本與包含棉花事件M0N88701的第二親本雜交來產生，從而產生包含棉花事件 M0N88701的特異性的和獨特的DNA的雜種。各個親本可以是雜種或近交系/變種，只要雜交或育種產生本發明的植物或種子，即具有含有棉花事件M0N88701的DNA的至少一個等位基因和/或具有選自SEQ ID NO:1-10的至少一個序列的DNA分子的種子。因此，可以將兩種不同的轉基因植物雜交以產生含有兩個獨立地分離的添加的外源基因的雜種后代。例如，含有M0N88701的麥草畏和草銨膦耐受性棉花可以與其他轉基因棉花植物雜交以產生具有兩種轉基因親本的特征的植物。其一個實例是含有M0N88701的麥草畏和草銨膦耐受棉花與具有一種或多種另外的性狀例如除草劑耐受性(例如棉花事件M0N1445或棉花事件 M0N88913)和/或昆蟲防治(例如棉花事件M0N15985、M0N757或M0N531)的植物雜交，從而產生對麥草畏和草銨膦耐受的并具有至少一種或多種另外的性狀的后代植物或種子。還設想了與親本植物的回交和與非轉基因植物的異交，以及無性繁殖。通常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在幾篇參考文獻之一中找到，例如Fehr，Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.主編，American Society of Agronomy, Madison WI (1987)。
[0066]本發明提供了源自于包含事件M0N88701的棉花植物的植物部分。當在本文中使用時，“植物部分”是指由源自于包含事件M0N88701的棉花植物的材料構成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、莢、花、根或莖組織、纖維和葉。植物部分可以是有可存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。
[0067]本發明提供了源自于包含事件M0N88701的棉花植物的商品。當在本文中使用時， “商品”是指由源自于含有棉花事件M0N88701的植物、種子、植物細胞或植物部分的材料構成的任何組合物或產品。商品可以銷售給消費者，并且可以是存活的或非存活的。非存活的商品包括但不限于非存活的種子，加工的種子、種子部分和植物部分，棉絨，用于飼料和食品、油、纖維、紙、生物質和燃料產品的加工的種子和植物部分。存活的商品包括但不限于種子、植物和植物細胞。因此，包含事件M0N88701的棉花植物可用于制造通常從棉花獲得的任何商品。任何這樣的源自于包含事件M0N88701的棉花植物的商品可能含有至少可檢測量的對應于棉花事件M0N88701的特異性和獨特的DNA，并且具體來說可能含有可檢測量的包含具有選自SEQ ID NO:1—10的至少一個序列的DNA分子的多核苷酸。可以使用檢測核苷酸分子的任何標準方法，包括本文公開的檢測方法。如果在商品中存在任何可檢測量的具有選自SEQ ID NO:1 —10的至少一個序列的DNA分子，則所述商品在本發明的范圍之內。
[0068]因此，本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、莢、花、根或莖組織和葉)和商品，除了其他用途之外，可用于生長植物，其目的在于生產包含棉花事件M0N88701的種子和/或植物部分以實現農業目的，生產包含棉花事件M0N88701的后代用于植物育種和研究目的，采用微生物學技術以用于工業和研究應用，以及銷售給消費者。
[0069]本發明提供了用于控制雜草的方法和使用麥草畏和草銨膦除草劑和棉花事件 M0N88701生產植物的方法。提供了一種用于控制田間雜草的方法，其由下述步驟構成:將含有棉花事件M0N88701的變種或雜種植物種植在田地中，并且向所述田地施用除草有效劑量的麥草畏或草銨膦或麥草畏和草銨膦以實現控制田間雜草而不損傷含有M0N88701的植物的目的。麥草畏或草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑的這種施用可以是在出土前，即在含M0N88701的種子種植之后和在含有M0N88701的植物萌發之前的任何時間，或者是在出土后，即在含有M0N88701的植物萌發之后的任何時間。還提供了用于控制田間雜草的另一種方法，其由下述步驟構成:施用有效劑量的麥草畏或草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑以控制田間雜草，然后將包含事件M0N88701的棉花植物種植在田地中。麥草畏或草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑的這種施用是種植前的，即在含有M0N88701的種子種植之前，并且可以在種植之前的任何時間進行，包括但不限于種植之前約14天至種植之前約I天。本發明還提供了用于生產`基本上不含雜草種子的棉花種子或棉絨的方法，所述方法包括將包含 M0N88701的麥草畏和草銨膦耐受性棉花植物的種子種植在田地中，向所述田地施加足以殺死雜草的出土后有效劑量的麥草畏或草銨膦或麥草畏和草銨膦除草劑，以及從所述田地收獲種子或棉絨。在田地中使用的除草有效劑量的麥草畏應該由在生長季內約0.005磅每英畝至約16磅每英畝麥草畏的范圍構成。在一種實施方式中，在生長季中施用總共約0.5磅每英畝至約2磅每英畝的麥草畏。可以在生長季內采用麥草畏的多次施用，例如兩次施用 (例如種植前施用和出土后施用，或出土前施用和出土后施用)或三次施用(例如種植后施用、出土前施用和出土后施用)。在田地中使用的除草有效劑量的草銨膦應該由生長季內約
0.005磅每英畝至約16磅每英畝草銨膦的范圍構成。在一種實施方式中，在生長季內施用總共約0.5磅每英畝至約1.59磅每英畝的草銨膦。可以在生長季內采用草銨膦的多次施用，例如兩次施用(例如種植前施用和出土后施用，或出土前施用和出土后施用)或三次施用(例如種植后施用、出土前施用和出土后施用，或三次出土后施用)。
[0070] 提供了用于生產包含對于本發明的事件M0N88701來說特異性的且獨特的DNA序列的除草劑耐受性棉花植物的方法。在這些方法中使用的轉基因植物對于所述轉基因來說可以是純合的或雜合的。通過這些方法產生的后代植物可以是變種或雜種植物，可以從由含有棉花事件M0N88701的植物產生的種子和/或從由來自于含有棉花事件M0N88701的植物的花粉授粉的植物所產生的種子生長，并且對于所述轉基因來說可以是純合的或雜合的。后代植物隨后可以自花授粉以產生植物的純育品系，即對轉基因純合的植物，或者可以異交，例如與另一種無親緣關系的植物育種，以產生變種或雜種種子或植物。
[0071]對麥草畏和草銨膦除草劑的應用耐受的棉花植物可以通過將包含具有選自SEQ ID NO:1—10的至少一個序列的DNA分子的含有事件M0N88701的植物與另一種棉花植物進行有性雜交并由此產生種子，然后將所述種子生長成后代植物來生產。然后可以用麥草畏和/或草銨膦除草劑處理這些后代植物以選擇對麥草畏和草銨膦除草劑耐受的后代植物。或者，可以使用診斷方法來分析這些后代植物以選擇含有事件M0N88701DNA的后代植物。在雜交中使用的另一種植物可以耐受或者不耐受麥草畏和草銨膦除草劑，并且可以是或者不是轉基因的。產生的后代植物和/或種子可以是變種或雜種種子。在這種方法的實施中，將一種植物與另一種植物有性雜交(即異花授粉)的步驟可以通過人為干預來實現或促進，例如:通過人手收集一種植物的花粉，并將該花粉與第二植物的花柱或柱頭相接觸；通過人手和/或行動來移除、破壞或覆蓋植物的雄蕊或花藥(例如通過去雄或通過施用化學殺配子劑)以使得天然的自花授粉被阻止，因而為了發生受精必須進行異花授粉； 通過在用于“定向授粉”的位置中人工放置授粉昆蟲(例如通過在果園或田地中放置蜂巢或將植物與授粉昆蟲籠養在一起)；通過人工打開或移除花的允許在花柱或柱頭上放置或接觸外來花粉的部分(例如在天然具有阻礙或防止異花授粉的花而使它們在沒有人類干預時成為天然地專性自花授粉者的大豆中)；通過植物的選擇性放置(例如將植物故意種植在授粉距離內)；和/或通過施用化學物質以促使開花或促進(柱頭對花粉的)感受性。
[0072]耐受麥草畏和草銨膦除草劑施用的棉花植物可以通過將包含具有選自SEQ ID NO:1—10的至少一個序列的DNA分子的含有事件M0N88701的植物自交并由此產生種子， 然后將所述種子生長成后代植物來生產。隨后將這些后代植物用麥草畏和草銨膦除草劑處理以選擇對麥草畏和草銨膦除草劑耐受的后代植物。或者，可以使用診斷方法來分析這些后代植物以選擇含有事件M0N88701DNA的后代植物。在這種方法的實施中，將一種植物與自身有性雜交(即自花授粉)的步驟可以通過人為干預來實現或促進，例如:通過人手收集植物的花粉并將該花粉與同一植物的花柱或柱頭相接觸，然后任選地防止所述植物的進一步受精；通過人手和/或行動來移除、破壞或覆蓋附近其他植物的雄蕊或花藥(例如通過去雄或通過施用化學殺配子劑)以使得天然的異花授粉被阻止，因而為了發生受精必須進行自花授粉；通過在用于“定向授粉”的位置中人工放置授粉昆蟲(例如通過將植物單獨地與授粉昆蟲籠養在一起)；通過花或其部分的人工操作以允許自花授粉；通過植物的選擇性放置(例如將植物故意種植在授粉距離之外)；和/或通過施用化學物質以促使開花或促進(柱頭對花粉的)感受性。
[0073]這些方法所涵蓋的和通過使用這些方法生產的后代棉花植物和種子與其他棉花植物不同，這是由于例如所述后代棉花植物和種子:是重組的并且因此通過人為干預產生；是麥草畏和草銨膦除草劑耐受的；含有至少一個由本發明的轉基因DNA構成的等位基因； 和/或含有可檢測量的包含選自SEQ ID NO:1—10的至少一個序列的DNA分子。可以從單個后代植物選擇種子，并且只要所述種子包含具有選自SEQ ID NO=1-1O的至少一個序列的DNA分子，它將在本發明的范圍之內。
[0074]在本發明的實施中，可以將兩種不同的轉基因植物雜交以產生含有兩個獨立分離的異源基因的雜種后代。適合的后代的自交可以產生對兩個基因純合的植物。還設想了與親本植物的回交和與非轉基因植物的異交，以及無性繁殖。通常用于不同性狀和作物的其他方法的描述可以在幾篇文獻之一中找到，例如Feh, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.主編，American Society of Agronomy, Madison WI (1987)。
[0075]在本文公開的方法中使用的植物和種子也可以含有一個或多個另外的轉基因。這樣的轉基因可以是編碼賦予所需性狀的蛋白質或RNA分子的任何核苷酸序列，所述性狀包括但不限于提聞的抗蟲性、提聞的水利用效率、提聞的廣量性能、提聞的抗旱性、提聞的種子品質、提高的營養品質和/或提高的除草劑耐受性，其中所述所需性狀相對于缺少這樣的另外的轉基因的棉花植物測定。
[0076]因此，本發明的方法除了其他用途之外，可用于控制田間雜草而同時生長植物 (其目的在于生產包含棉花事件M0N88701的種子和/或植物部分用于農業或研究目的)， 選擇包含棉花事件M0N88701的后代用于植物育種或研究目的，以及生產含有棉花事件 M0N88701的后代植物和種子。
[0077]本發明的植物、后代、種子、植物細胞、植物部分(例如花粉、胚珠、莢、花、根或莖組織和葉)和商品可評估其DNA組成、基因表達和/或蛋白質表達。這樣的評估可以通過使用任何標準方法來進行，例如PCR、northern印跡、southern分析、western印跡、免疫沉淀和ELISA，或使用本文中提供的檢測方法和/或檢測試劑盒。
[0078]提供了檢測樣品中源自于包含棉花事件M0N88701的棉花細胞、組織、種子或植物的DNA的存在的方法。一種方法由下述步驟構成:(i)從至少一個棉花細胞、組織、種子或植物提取DNA樣品，(ii)將所述DNA樣品與能夠在適合于DNA測序的條件下產生事件 M0N88701DNA特異性的DNA序列的至少一個引物相接觸，(iii)進行DNA測序反應，然后 (iv)證實所述核苷酸序列包含事件M0N88701特異性的核苷酸序列，例如選自SEQ ID NO:1一10的一個核苷酸序列。另一種方法由下述步驟構成:(i)從至少一個棉花細胞、組織、 種子或植物提取DNA樣品，(ii)將所述DNA樣品與能夠在適合于DNA擴增的條件下產生事件M0N88701DNA的擴增子的引物對相接觸，(iii)進行DNA擴增反應，然后(iv)檢測所述擴增子分子和/或證實所述擴增子的核苷酸序列包含事 件M0N88701特異性的核苷酸序列，例如選自SEQ ID NO:1—10的一個核苷酸序列。擴增子應該是對事件M0N88701特異性的擴增子,例如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的擴增子。擴增子中對事件M0N88701 特異性的核苷酸序列的檢測對于樣品中棉花事件M0N88701特異性DNA的存在是確定性的和/或診斷性的。能夠在適合于DNA擴增的條件下產生事件M0N88701DNA的擴增子的引物對的實例以SEQ ID N0:11 —12提供。其他引物對可以由本領域技術人員容易地設計，并且應該包含SEQ ID NO:10的至少一個片段。檢測樣品中源自于包含棉花事件M0N88701的棉花細胞、組織、種子或植物的DNA的存在的另一種方法由下述步驟構成:(i)從至少一個棉花細胞、組織、種子或植物提取DNA樣品，(ii)將所述DNA樣品與對事件M0N88701DNA特異性的DNA探針相接觸，(iii)允許所述探針和DNA樣品在嚴格雜交條件下雜交，然后(iv) 檢測所述探針與靶DNA樣品之間的雜交。對事件M0N8870IDNA特異性的DNA探針的序列的實例以SEQ ID N0:13提供。其他探針可以由本領域技術人員容易地設計，并且將包含SEQ ID NO:10的至少一個片段。檢測到探針與DNA樣品的雜交對樣品中棉花事件M0N88701特異性DNA的存在是診斷性的。或者，不存在雜交對樣品中棉花事件M0N88701特異性DNA的不存在是診斷性的。
[0079]提供了 DNA檢測試劑盒，其可用于鑒定樣品中的棉花事件M0N88701DNA，并且也可以應用于含有適宜的事件DNA的棉花植物的育種方法。這樣的試劑盒含有包含SEQ ID NO:
1—10的片段的DNA引物和/或探針。這樣的試劑盒的一個實例包含具有SEQ ID NO:10 的足夠長度的連續核苷酸的至少一個DNA分子，以起到可用于檢測樣品中源自于包含事件 M0N88701的轉基因棉花植物的DNA的存在和/或不存在的DNA探針的作用。所述源自于包含事件M0N88701的轉基因棉花植物的DNA包含具有選自SEQ ID NO:1 一 10的至少一個序列的DNA分子。提供了足以用作DNA探針的DNA分子，其可用于確定、檢測或診斷樣品中棉花事件M0N88701DNA的存在和/或不存在，并以SEQ ID NO: 13提供。其他探針可以由本領域技術人員容易地設計，并且應該包含SEQ ID NO:10的至少15個連續核苷酸和對于棉花事件M0N88701DNA足夠獨特，以便鑒定源自于所述事件的DNA。另一種類型的試劑盒包含可用于產生擴增子的引物對，所述擴增子可用于檢測樣品中源自于轉基因棉花事件M0N88701 的DNA的存在和/或不存在。這樣的試劑盒將利用包含下列步驟的方法:將靶DNA樣品與本文中所描述的引物對接觸，然后進行足以產生包含具有選自SEQ ID NO:1-10的至少一個序列的DNA分子的擴增子的核酸擴增反應，然后檢測所述擴增子的存在和/或不存在。這樣的方法還可以包括對擴增子或其片段進行測序，其對靶DNA樣品中棉花事件M0N88701特異性DNA的存在是確定性的，即診斷靶DNA樣品中棉花事件M0N88701特異性DNA的存在。 其他引物對可以由本領域技術人員容易地設計，并且應該包含SEQ ID NO:10的至少15個連續核苷酸和對棉花事件M0N88701DNA足夠獨特以便鑒定源自于所述事件的DNA。
[0080]核酸擴增可以通過本領域已知的各種核酸擴增方法中的任一種來進行，包括熱擴增方法。在本領域中已知許多用于對通過這些方法產生的擴增子進行檢測、定量和/ 或測序的技術。可用于實施本發明的一種示例性技術是TAQMAN? (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)。
[0081]本發明的試劑盒和檢測方法除了其他方面之外，可用于鑒定棉花事件M0N88701， 選擇包含棉花事件M0N88701的植物品種或雜種，檢測樣品中源自于包含事件M0N88701的轉基因棉花植物的DNA的存在，以及監測樣品中包含事件M0N88701的棉花植物或源自于包含事件M0N88701的棉花植物的植物部分的存在和/或不存在。
[0082]來自于棉花事件M0N88701的異源DNA插入片段的序列、接合序列或側翼序列可以通過使用源自于本文提供的序列的引物擴增這樣的來自于事件的序列，然后對擴增子或克隆的DNA進行標準DNA測序來驗證(以及如果需要的話進行校正)。
[0083]當在本文中使用時，術語“包含”意味著“包括但不限于”。
[0084]包含了下面的實施例以闡明本發明的某些優選實施方式的實例。本領域技術人員應該認識到，在后面的實施例中公開的技術代表了本發明人發現在本發明的實施中表現良好且因此可以被認為構成其優選實施方式的實例的方式。然而，根據本公開，本領域技術人員應該認識到，可以在所公開的特定實施方式中做出許多改變并仍獲得類似或相似結果而不背離本發明的精神和范圍。
實施例
[0085]實施例1:棉花的轉化和M0N88701事件選擇
[0086]本實施例描述了事件M0N88701的產生、分析和選擇。概括來說，在許多年間，通過最終選擇商品化事件(即M0N88701事件)所需的嚴格的分子、表型和田間試驗，產生并分析了數千個單個植物。
[0087]耐受麥草畏和草銨膦的轉基因棉花事件M0N88701利用包含圖1中示出的表達盒的植物轉化載體，通過土壤桿菌介導的棉花下胚軸組織的轉化來產生。用于轉化棉花的方法在本領域中是已知的。為了產生M0N88701事件，將Cokerl30棉花材料(Asgrow，St Louis,MO)用于植物轉化。將棉花細胞轉化并再生成完整棉花植物。選擇具有正常表型特征的生根植物，并將其轉移至土壤進行生長和進一步評估。
[0088]將RO植物轉移至土壤，并以麥草畏和草銨膦兩者IX或2X的田間施用率(即0.5 或1.01b /英畝的活性成分)進行除草劑篩選。隨后，鑒定并選擇僅含單一 T-DNA表達盒的RO植物。T-DNA表達盒含有帶有重復增強子區域的花生褪綠條紋病毒(PCISV)啟動子(P-PC1SV.FLt-enh);其可操作地與源自于煙草蝕紋病毒的RNA轉錄本的DNA前導序列(L-TEV)連接；可操作地與編碼來自于擬南芥的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)的葉綠體轉運肽的N-端葉綠體轉運肽的DNA分子(TS—CTP2)連接；可操作地與編碼來自于嗜麥芽窄食單胞菌的麥草畏單加氧酶的DNA分子(DMO)連接；可操作地與源自于海島棉的纖維蛋白E6基因的3’ UTR DNA分子(T_Gb.E6 — 3b)連接；可操作地與來自于花椰菜花葉病毒的增強35S RNA轉錄本(具有重復的增強子區域)的啟動子(P—CaMV.35S— enh)連接；可操作地與源自于矮牽牛(Petuniax hybrida)熱休克蛋白70(HSP70)基因的 5’非翻譯區的DNA前導序列(L-Ph.DnaK)連接；可操作地與編碼草丁膦乙酰轉移酶(PAT) 的來自吸水鏈霉菌的雙丙氨膦抗性(bar)基因(CR-Sh.bar)連接；可操作地與來自于根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶(NOS)基因(其指導mRNA的多腺苷化)的3’非翻譯區(T-AGRtu.nos)連接。
[0089]根據表型特 征(包括對麥草畏和草銨膦除草劑兩者的商用水平的耐受性)、分子特征(使用全面的分子譜分析來確定)和單倍型相關性的優越組合從約151個單個轉基因事件中選擇M0N88701事件。從原始的151個轉基因事件中選擇M0N88701事件是耗時多年的過程，其每一步都需要數據分析。進行兩波轉化事件以允許從更大量的事件中選擇最終的商業化事件。表1提供了每種類型的分析的概述以及事件篩選的每一步所選擇和推進至下一步的事件數量。第2波的波多黎各田間試驗效能篩選在第一次美國田間試驗之前進行。
[0090]表1
[0091]
【權利要求】
1.一種重組DNA分子，其包含選自SEQ ID NO:1-10的核苷酸序列及其互補序列。
2.權利要求1的重組DNA分子，其通過將異源核酸分子插入到棉花植物或細胞的基因組DNA中來形成。
3.權利要求1的重組DNA分子，其中所述DNA分子源自于包含事件M0N88701的轉基因棉花植物，包含棉花事件M0N88701的種子的代表性樣品已以ATCC登記號PTA-11754保藏。
4.權利要求1的重組DNA分子，其中所述DNA分子在棉花植物、植物細胞、種子、植物部分或商品中。
5.權利要求1的重組DNA分子，其中所述DNA分子是診斷源自于事件M0N88701的DNA 的存在的擴增子。
6.一種DNA探針，其包含SEQ ID NO: 10的足夠長的連續核苷酸的核苷酸序列或其互補序列，以起到在嚴格雜交條件下與包含選自SEQ ID NO:1—10的核苷酸序列的DNA分子雜交，并且在嚴格雜交條件下與不包含選自SEQ ID NO:1—10的核苷酸序列的DNA分子不雜交的DNA探針的作用。
7.一對DNA分子，其包含第一 DNA分子和與所述第一 DNA分子不同的第二 DNA分子，其中所述第一和第二 DNA分子各自包含SEQ ID NO:10的足夠長的連續核苷酸的核苷酸序列或其互補序列，以在與源自于事件M0N88701的DNA —起在擴增反應中使用時起到DNA引物的作用，以產生診斷樣品中的棉花事件M0N88701DNA的擴增子。
8.一種檢測樣品中源自于包含事件M0N88701的棉花植物的DNA分子的存在的方法，所述方法包括:a)將所述樣品與權利要求6的DNA探針相接觸；b)使所述樣品和所述DNA探針經受嚴格雜交條件；以及 c)檢測所述DNA探針與所述樣品中的DNA分子的雜交，其中所述DNA探針與所述DNA 分子雜交表明所述樣品中存在源自于棉花事件M0N88701的DNA分子。
9.一種檢測樣品中源自于包含事件M0N88701的棉花植物的DNA分子的存在的方法，所述方法包括:a)將所述樣品與權利要求7的DNA分子對相接觸；b)進行足以產生包含選自SEQID NO:1—10的序列及其互補序列的DNA擴增子的擴增反應；以及c)檢測所述反應中所述DNA擴增子的存在，其中在所述反應中存在所述DNA擴增子表明所述樣品中存在源自于包含事件M0N88701的棉花植物的DNA分子。
10.一種DNA檢測試劑盒，其包含至少一個DNA分子，所述DNA分子包含SEQ ID NO: 10的足夠長的連續核苷酸的核苷酸序列及其互補序列，以起到特異性檢測源自于包含事件 M0N88701的棉花植物的DNA的存在的DNA引物或探針的作用，其中所述DNA的檢測對樣品中事件M0N8870IDNA的存在具有診斷作用。
11.一種重組棉花植物、種子、細胞或其植物部分，其包含權利要求1的重組DNA分子。
12.權利要求11的重組棉花植物、種子、細胞或其植物部分，其中所述棉花植物、種子、 細胞或其植物部分對麥草畏和草銨膦除草劑的處理具有耐受性。
13.權利要求11的重組棉花植物、種子、細胞或其植物部分，當在DNA擴增方法中測試時，其基因組產生包含選自SEQ ID NO:1 —10及其互補序列的DNA分子的擴增子。
14.一種包含事件M0N88701的棉花植物、種子、細胞或其部分，包含事件M0N88701的種子的代表性樣品已以ATCC登記號PTA-11754保藏。
15.權利要求14的棉花植物、種子、細胞或其部分，其中所述棉花植物或種子是具有至少一個包含棉花事件M0N88701的親本的雜體。
16.一種無生命植物材料，其包含權利要求1的重組DNA分子。
17.一種微生物，其包含權利要求1的重組DNA分子。
18.權利要求17的微生物，其中所述微生物是植物細胞。
19.一種商品，其包含權利要求1的重組DNA分子。
20.一種控制田間雜草的方法，所述方法包括將包含事件M0N88701的棉花植物種植在田間，并施用有效劑量的麥草畏或者草銨膦或者麥草畏和草銨膦除草劑以控制所述田間的雜草而不損傷所述包含事件M0N88701的棉花植物。
21.權利要求20的方法，其中所述有效劑量的麥草畏除草劑是在生長季內總共約 0.005磅每英畝至約16磅每英畝的麥草畏除草劑。
22.權利要求20的方法，其中所述有效劑量的麥草畏除草劑是在生長季內總共約0.5 磅每英畝至約2磅每英畝的麥草畏除草劑。
23.權利要求20的方法，其中所述有效劑量的草銨膦除草劑是在生長季內總共約0.005磅每英畝至約16磅每英畝的草銨膦除草劑。
24.權利要求20的方法，其中所述有效劑量的草銨膦除草劑是在生長季內總共約0.5 磅每英畝至約1.59磅每英畝的草銨膦除草劑。`
25.—種控制田間雜草的方法，所述方法包括施用有效劑量的麥草畏或者草銨膦或者麥草畏和草銨膦除草劑以控制田間雜草，且然后將包含事件M0N88701的棉花植物種植在所述田地中。
26.權利要求25的方法，其中所述有效劑量的麥草畏除草劑為約0.005磅至約16磅每英畝，并且所述種植包含事件M0N88701的棉花植物是在所述施用有效劑量的麥草畏除草劑的14天之內。
27.一種用于生產基本上不含雜草種子的棉花種子或棉絨的方法，所述方法包括:a)將包含棉花事件M0N88701的種子種植在田地中；b)向所述田地施用有效劑量的麥草畏或者草銨膦或者麥草畏和草銨膦除草劑以殺死所述田地中的雜草而不傷害包含事件M0N88701的棉花植物；以及c)從所述田地收獲棉花種子或棉絨。
28.—種生產耐受麥草畏和草銨膦除草劑施用的棉花植物的方法,所述方法包括:a)將包含事件M0N88701的包含具有選自SEQID NO: I—8的核苷酸序列及其互補序列的核苷酸分子的轉基因棉花植物與第二棉花植物進行有性雜交；b)收集從所述雜交產生的種子；c)生長所述種子以產生多個后代植物；d)用麥草畏或者草銨膦或者麥草畏和草銨膦處理所述多個后代植物；以及e)選擇耐受麥草畏和草銨膦的后代植物。
29.—種生產耐受麥草畏和草銨膦除草劑施用的棉花植物的方法,所述方法包括:a)將包含事件M0N88701的包含具有選自SEQ ID NO: I—8的核苷酸序列及其互補序列的核苷酸分子的轉基因棉花植物進行自交；b)收集從所述自交產生的種子；c)生長所述種子以產生多個后代植物；d)用麥草畏或者草銨膦或者麥草畏和草銨膦處理所述多個后代植物；以及e)選擇耐受麥草畏和草銨膦的后代植物。
30.一種確定包含事件M0N88701的棉花植物或種子的接合性的方法，所述方法包括:a)將包含棉花DNA的樣品與引物組和探針組相接觸，所述引物組和探針組i)當在核酸擴增反應中與事件M0N88701DNA—起使用時，產生診斷事件M0N88701的第一擴增子；并且ii)當在核酸擴增反應中與事件M0N88701DNA之外的其他棉花基因組DNA—起使用時， 產生診斷事件M0N88701之外的其他天然棉花基因組DNA的第二擴增子；b)使用所述樣品、引物組和探針組進行核酸擴增反應；c)在所述核酸擴增反應中檢測診斷事件M0N88701的第一熒光信號，以及與所述第一熒光信號不同的且診斷對應于事件M0N88701轉基因的插入位置的天然棉花基因組DNA的第二熒光信號；并且d)分析所述核酸擴增反應中所述第一熒光信號和所述第二熒光信號的存在或不存在， 其中兩種熒光信號的存在表明所述樣品對事件M0N88701是雜合的，且只有`所述第一熒光信號存在表明所述樣品對事件M0N88701是純合的。
31.權利要求30的方法，其中所述引物組包含SEQID NO =IUSEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
32.權利要求30的方法，其中所述探針組包含SEQID NO:13和SEQ ID NO:15。
33.一個棉花單體型區域，其包含事件M0N88701并定位于染色體A08上19.3cM的圖位處，并且左側以18.6cM圖位處的NG0207927為邊界和右側以20.0cM圖位處的NG0207529 為邊界。
【文檔編號】C12N15/82GK103597079SQ201280024266
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年3月13日 優先權日:2011年3月30日
【發明者】R·J·布林克爾, W·C·伯恩斯, P·C·C·馮, J·A·肯迪格, S·萊克勒爾, J·L·盧特克, M·瑪爾文 申請人:孟山都技術公司