專利名稱：：用于傷寒沙門菌dna芯片轉錄表達譜的基因組特異引物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一組基于傷寒沙門菌基因組序列的基因組特異引物(genomedirectedprimers,GDP引物)，共34條，屬于生物信息學及分子生物學領域。可用于傷寒沙門菌基因轉錄譜分析，尤其活體條件下基因表達譜分析，提高了靈敏度及特異性；同時可指導已知序列基因組的擴增以構建基因文庫。
背景技術：
：全基因組DNA芯片表達譜分析技術具有高通量和平行性的優勢，能同時分析不同條件下成千上萬個基因的表達情況。DNA芯片雜交所需探針通常由轉錄本mRNA反轉錄標記熒光素生成。目前，傷寒沙門菌DNA芯片轉錄譜所用探針，通常仍使用PatBrown法(http:〃cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/4—Ecoli—RNA.txt)由N6或N7隨機引物通過反轉錄酶催化獲得熒光素標記的cDNA。隨機引物理論上能夠覆蓋幾乎所有的序列，但同時，也能與除mRNA外的rRNA和tRNA互補，從而造成高背景；另外，細菌侵襲過程中，使用DNA芯片分析基因表達情況時，細菌RNA通常會混有宿主細胞RNA,隨機引物不僅能標記細菌RNA，也能標記宿主細胞RNA，以致降低了細菌RNA檢測的靈敏度，增加了非特異性雜交信號。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服隨機引物標記探針的靈敏度低及非特異性強的不足，提供一種基于傷寒沙門菌基因組序列的GDP引物。該引物在傷寒沙門菌DNA芯片基因表達譜分析中標記RNA時，不僅可提高靈敏度和特異性，還可用于活體條件下的基因表達譜分析，避免宿主細胞RNA所產生的影響，同時可指導已知序列基因組的擴增。本發明所說的基于傷寒沙門菌基因組序列的基因組特異引物，含有引物34條，其3序列如下-1GCGGCG2ACGCCG3CAGCAG4TCATCA5GCCAGA6CGCCAA7GGTTTT8ATCCAG9TTTCAT10GCGATA11TATTTT12GCCTGA13CGGCAA14AAAATC15TGCCGT16GCGCAT17AAATGC18ATTTGC19ATAAAT20TGAATA21ATTTCC22CAGTAC23ATACCG24TGGCGC25AACAAT26CGTAAC27TTACCA28CTGTTG29GCGGAT30CAATCA31GGTGTT32ACGTGG33GAGCGC34CACGCA上述所說基因組特異引物，是通過下述方法設計得到使用FindGDPs軟件設計，如圖1所示，設計GDP引物時需滿足1)針對基因組所有序列做出篩選；2)針對所選目的基因3'-端50%的序列作為靶標設計全基因組特異引物；3)引物長度為6bp;4)所設引物對ORF的覆蓋率。根據以上條件，我們共設計合成34條GDP引物，每條引物及其覆蓋率詳見表1。本發明的有益效果運用傷寒沙門菌DNA芯片用基因組特異引物能對細菌mRNA進行選擇性標記，提高標記的靈敏度和特異性。使得傷寒沙門菌全基因組DNA芯片的應用范圍增加，不僅可用于傷寒沙門菌的體外基因表達譜研究，還可用于體內的基因表達譜研究，對開展傷寒沙門菌的致病機理研究，以及作為原核模式生物的研究平臺，對認識生物細胞基因表達調節網絡研究，具有極其重要的作用。下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖1.本發明GDP引物設計流程具體實施例方式本實施例以比較GDP引物和隨機引物標記探針的基因表達譜差異為例說明具體過程為(1)GDP引物的設計使用FindGDPs軟件設計，流程如圖1所示，1)目的基因選定選擇全部傷寒沙門菌標準菌株Ty2全基因組基因(保藏號:ATCC19430;來源日本岐阜大學病原微生物保存中心；全基因組序列基因BANK登錄號AE014613)，剔除所有IS序列相關基因、整合酶基因、轉座酶基因及大小在150bp以下的基因、彼此間在核苷酸水平上高度同源的基因，再加選傷寒沙門菌z66陽性株(保藏號3P91;來源日本岐阜大學病原微生物保存中心；部分基因序列信息基因BANK登錄號AB108532)和CT18菌株(保藏號3P97;來源日本岐阜大學病原微生物保存中心；全基因組序列基因BANK登錄號AL513382)獨有基因41條，及作為陽性對照的傷寒沙門菌16SrRNA基因，最后共選定傷寒沙門菌4224條基因，導入數據庫，待用。2)候選反向引物的確定以所選4224條目的基因序列的3'-端50%的序列為靶標設計獲得反向引物，將每個目的基因序列的3'-端50%的序列(共4224條)，導入數據庫。每個目的基因序列的3'-端50%的序列中每6個堿基構成一個引物，存于單獨的反向引物表中，待用。3)最佳反向引物的確定大部分序列中均能blast到的候選反向引物確定為最佳反向引物，存于最佳反向引物表。最后挑選出能夠覆蓋所有序列的系列6堿基引物作為基5因組特異引物，用于傷寒沙門菌DNA芯片基因表達譜分析。根據以上條件，我們共設計合成34條GDP引物，每條引物及其覆蓋率詳見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)基因表達譜的應用將傷寒沙門菌z66陽性野生菌株培養至對數生長期，提取出穩定的RNA后，分3份，一份取20嗎的RNA,以六堿基隨機引物或上述GDP引物分別標記獲得cDNA探針，標記過程使用SuperScriptIII反轉錄系統直接摻入法摻入Cy5-dCTP。一份則以1:50的比例摻入單細胞系THP-1(ATCCTIB-202)RNA至20嗎，再分別使用六堿基隨機引物或GDP引物標記獲得摻入Cy3-dCTP的cDNA探針。分別混合六堿基隨機引物標記獲得的兩種cDNA和GDP引物標記獲得的兩種cDNA,QiaquickPCRpurificationkit(Qiagen)純化后，65。C分別與兩張芯片雜交，用GenePixPersonal4100芯片掃描儀(AxonInstruments)掃描芯片。經分析，與純傷寒沙門菌RNA獲得的熒光信號相比，兩種引物標記的混合RNA均含有非特異性的熒光信號(可能是由于單細胞系THP-1具有與傷寒沙門菌相似序列導致)，其中GDP引物標記的探針，獲得的熒光信號中非特異性熒光信號為12.3%,而隨機引物標記的探針，非特異性熒光信號高達34.6%。由此可見，GDP引物相較隨機引物而言，降低了對RNA純度和濃度的要求，更適合于活體的基因表達譜研究，可提高靈敏度及特異性，為疫苗的研制及藥物治療奠定了一定基礎。SEQUENCELISTING<110>江蘇大學<120>用于傷寒沙門菌DNA芯片轉錄表達譜的基因組特異引物<130><160>34<170>Patentlnversion3.3<210><211><212><213>16DNA人工序列<400>1gcggcg<210><211><212><213>26DNA人工序列<400>2acgccg<210><211><212><213>36DNA人工序列<400>3cagcag<210><211><212><213>46DNA人工序列<400>tcatca<210><211><212><213>6DNA人工序列<400>gccaga<210><211><212><213>66DNA人工序列<400>6cgccaa<210><211><212><213>6DNA人工序列<400>ggtttt<210><211><212><213>86DNA人工序列<400>8atccag<210><211><212>96DNA9<213>人工序列<400>9tttcat6<210>10<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>10gcgata6<210>11<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>11tatttt6<210>12<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>12gcctga6<210>13<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>13cggcaa6<210>14<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>14aaaatc<210><211><212><213>156DNA人工序列<400>15tgccgt<210><211><212><213>166DNA人工序列<400>16gcgcat<210><211><212><213>176DNA人工序列<400>17aaatgc<210><211><212><213>186DNA人工序列<400>18atttgc<210>19<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>19ataaat6<210>20<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>20tgaata6<210>21<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>21atttcc6<210>22<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>22cagtac6<210>23<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>23ataccg6<210>24<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>24tggcgc<210>25<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>25aacaat6<210>26<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>26cgtaac<210>27<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>27ttacca6<210>28<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>28ctgttg6<210><211><212><213><400>gcggat<210><211><212><213><400>csatca<210><211><212><213><400>ggtgtt<210><211><212><213><400>acgtgg<210><211><212><213><400>gagcgc296DNA人工序列296306DNA人工序列306316DNA人工序列316326DNA人工序列326336DNA人工序列33'614<210>34<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>34cacgca權利要求1.一種用于傷寒沙門菌DNA芯片轉錄表達譜的基因組特異引物，其特征在于，含有特異引物34條，其序列如下1)GCGGCG2)ACGCCG3)CAGCAG4)TCATCA5)GCCAGA6)CGCCAA7)GGTTTT8)ATCCAG9)TTTCAT10)GCGATA11)TATTTT12)GCCTGA13)CGGCAA14)AAAATC15)TGCCGT16)GCGCAT17)AAATGC18)ATTTGC19)ATAAAT20)TGAATA21)ATTTCC22)CAGTAC23)ATACCG24)TGGCGC25)AACAAT26)CGTAAC27)TTACCA28)CTGTTG29)GCGGAT30)CAATCA31)GGTGTT32)ACGTGG33)GAGCGC34)CACGCA。全文摘要本發明屬于生物信息學及分子生物學領域，具體涉及用于傷寒沙門菌DNA芯片轉錄表達譜的基因組特異引物，共34條。它是通過FindGDPs軟件針對傷寒沙門菌基因組序列所有基因3′-端50％的序列為靶標設計的全基因組特異引物。用于傷寒沙門菌基因轉錄譜分析時提高了靈敏度及特異性；活體條件下基因表達譜分析時降低了對傷寒沙門菌RNA純度和濃度的要求，特異性高；同時可指導已知序列基因組的擴增以構建基因文庫。文檔編號C12Q1/68GK101575638SQ20091003116公開日2009年11月11日申請日期2009年4月24日優先權日2009年4月24日發明者張海方,徐順高,生秀梅,許化溪,黃新祥申請人:江蘇大學