專利名稱：：檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法
技術領域：
：本發明涉及一種快速診斷試劑盒及其應用方法，尤其涉及一種檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應用方法。屬于真菌核酸檢測
技術領域：
，適用于臨床及科研中對白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌及其他侵襲性念珠菌的快速檢測。
背景技術：
：近年來，隨著器官移植、骨髓移植的廣泛開展，艾滋病和腫瘤患者的增多以及皮質類固醇激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的大量應用，侵襲性念珠菌感染的發病率明顯增高。美國的一項前瞻性研究顯示，真菌感染占醫院血行感染的9.5%。念珠菌感染對免疫抑制和免疫缺陷病人的危害性大，死亡率高達45%，己成為威脅患者生命最嚴重的并發癥之一。研究表明，盡管白色念珠菌仍是侵襲性念珠菌感染最主要的病原菌，但其在臨床分離菌中所占的比例逐年下降，而熱帶念珠菌等非白色念珠菌(non'-albicansCandida,NAC)感染比例呈上升趨勢，且克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥，光滑念珠菌對此藥不敏感，給臨床的治療帶來一定的困難。既往研究發現，早期有效的抗念珠菌治療可以顯著改善預后。因此，早期確診侵襲性感染念珠菌菌種，對其實施針對性治療，及時救治生命具有重要意義。然而，侵襲性念珠菌感染的臨床表現,缺乏特異性，不同病原菌之間在毒力、感染部位、藥物敏感性以及臨床預后等方面均有差異，對其做出診斷常需結合實驗室診斷結果。目前侵襲性念珠菌的實驗室診斷方法包括真菌培養和表型檢測法、血清學檢測法、組織病理切片鑒定法與分子生物學鑒定技術等。真菌培養受取材時間、取材部位、樣本因素、培養條件等因素的影響，陽性率一直很低，且費時費力，常規培養需要3天，不能發揮指導臨床早期針對性治療的作用。血清學方法雖然因操作過程簡便而廣受實驗室歡迎，但該方法應用范圍窄，又存在交叉抗原，易出現假陽性或假陰性，且無法鑒定到種，無法滿足診斷需要。組織病理鑒定法是臨床侵襲性念珠菌病的確診方法，但因該法是有創性檢査，患者較難接受，且重癥侵襲性真菌感染患者，常常伴有血小板減少，凝血功能差，一般不宜采用組織活檢方法。該方法陽性率低。因此，前述的實驗室診斷方法限制了其在臨床診斷中的運用。由于分子生物學方法特異性和敏感性'高，并且可快速診斷，是目前真菌感染診斷研究中最活躍的一種方法；熒光定量PCR(fluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)技術具有自動化程度高、操作過程全封閉、無污染、實時性、能實現多重反應等優點，已廣泛用于病毒、細菌等病原體的檢測；因此，本發明基于分子生物學方法，研究一種檢測侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法。
發明內容本發明的第一個目的，是為了克服現有技術中的不足，提供一種檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒。本發明的第二個目的，是為了提供檢測三種/三種以上侵襲性念珠菌快速診斷試劑盒的應用方法。本發明的第一個目的可以通過采取如下技術方案達到檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特征是1)在所述試劑盒內設有熒光定量PCR反應液、13種念珠菌的陽性質控品和陰性質控n叩s2)所述熒光定量PCR反應液含有特異性引物和13種念珠菌相對應的熒光探針，所述特異性引物序列如序列表SEQIDNs:l所示；3)所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠'菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的標準菌株中的一種、任意二種組合或任意三種組合，經"煮沸法"獲得的DNA樣品，所述侵襲性念珠菌的陰性質控品為滅菌三蒸水。本發明的第一個目的還以通過采取如下技術方案達到本發明的一種實施方式是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的標準菌株，經"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌相對應的熒光探針序列如序列表SEQIDNs:2所示。本發明的一種實施方式是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌的標準菌株，經"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌相對應的熒光探針序列如序列表SEQIDNa:3所示。本發明的一種實施方式是所述熒光定量PCR反應i液包括25ul反應體系包括BrilliantQPCRMastermixII12.5ul，通用引物(0.lmmol/1)各O.5ul，四條探針(0.lmmol/1)各0.25ul，DNA模板lpl，補DEPC(^z'ez^^^rocar力o/7^e，焦碳酸二乙酯)水至25u1。本發明的第二個的可以通過采取以下枝術方案實現檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于包括以下步驟1)用"煮沸法"從待測標本中提取DNA;2)分別取第l)步中待測標本的DNA和與所述DNA同樣量的陽性質控品，加入到含有熒光定量反應液的PCR反應體系中；3)用熒光定量PCR檢測儀進行檢測，根據反應結，的Ct值，對檢測結果進行判斷。4)所述結果判斷方法是檢測樣品Ct值《35.0者，且出現典型的擴增曲線判為陽性；無Ct值，且無典型的擴增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0，且出現典型的擴增曲線的樣本，按前述步驟重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。本發明的第二個目的還可以通過采取，如下技術方案達到所述熒光定量PCR反應體系的反應條件是95-C變性10min，95。C30s，59。Clmin，59°Clmin，擴增50個循環。所述Ct值指熒光信號在每次循環的延伸階段收集，熒光信號閾值以剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準，擴增產物的熒光信號達到閾值時所需的擴增循環次數。本發明的作用原理利用Taq酶的5'—3'外切酶活性，在PCR反應系統中加入不同熒光(例如FAM、HEX、CY5、ROX)標記的四條探針，分別和四種念珠菌的保守基因序列相對應，四條探針的5'端標以熒光發射基團FAM(或HEX、CY5、ROX)，靠近3，端標以熒光淬滅基團朋Q1(或BHQ3)。反應體系中的每種探針可以與引物包含序列內的DNA模板發生特異性雜交，每種探針對應每種堿基序歹^當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的熒光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，檢測波長處光密度增加而被熒光探測系統檢測到。復性期探針與模板DNA發生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿著DNA模板移動，當移動到探針結合處切斷探針，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放，結果中被檢測到的熒光信號所標記的探針，對應于檢測區域的基因類型。本發明具有的有益效果如下1、本發明結合熒光定量PCR技術，采用通用引物和白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌的任意13種特異探針，開發研制出用于檢測四種對氟康唑等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌的試劑盒，可同步對13種侵襲性念珠菌進行檢測，能夠為臨床侵襲性念珠菌病的早期病原體診斷提供依據，以便早期及時制定治療方案，減少死亡率和后遺癥。2、本發明的試劑合的特異性好，通過引物高特異擴增和熒光探針的高特異雜交雙重控制，具有很高的準確性，假陽性低；能簡便、快速、梧異、靈敏地同時檢測四種對氟康唑等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌，為臨床侵襲性念珠菌病的早期病原體診斷提供依據。3、本發明試劑盒具有靈敏度高，反應過程由熒光檢測系統實時監控，熒光檢測系統對熒光信號具有很高的檢測靈敏度；檢測速度快，僅2.5小時，加上樣品DNA的提取制備，共需3小時；步驟簡單，可重復性高；所有試劑均是一〗欠性擴增，沒有后處理，毋需開蓋，不產生污染。具體實施例方式本發明所用試劑BrilliantQPCRMastermixll，購自美國Stratagene公司；PCR通用引物和熒光探針，購自上海超世生物技'術有限公司。具體實施例1本實施例1構成檢測三種念珠菌的快速診斷試劑盒。包括盒體和設置在盒體內的熒光定量PCR反應液、三種念珠菌的陽性質控品和陰性質控品；所述熒光定量PCR反應液含有特異性引物和三種念珠菌相對應的熒光探針；所述侵襲性念珠菌的陽性質控品由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的標準菌株經"煮沸法"獲得的DNA樣品，所述侵襲性念珠菌的陰性質控品為滅菌三蒸水。所述三種物質的制備方法如下1)熒光定量PCR反應液的配制，BrilliantQPCRMastermixII12.5u1，通用引物(0.1,1/1)各0.5ixl，三條探針(0.1mmol/l)各0.25nl，DNA模板lyl，補DEPC水至25ul。其中通用引物包括正向引物、反向引物兩種，分別是-正向引物(P1):5'~GGCATGCCTGTTTGAGCGT~3';反向引物(P2):5'~TCCTCCGCTTATTGATATGC~3';所述三條探針如表1所述_表l:三種特異性熒光定量PCR探針序列及熒光標記白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-BHQ1克柔念珠菌HEX—TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA—BHQ1光滑念珠菌CY5—TTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGA—BHQ32)白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌陽性質控品三種念珠菌經"煮沸法"獲得的DNA樣品，一2(TC保存。3)陰性質控品滅菌三蒸水。本發明特異檢測三種念珠菌的快速診斷試劑盒的使用方法如下1)模板DNA的制備取含菌懸液lml，13，000rpni離心10min。棄上清，'沉淀中加入lmL滅菌生理鹽水，振蕩懸浮，13,OOOrpm離心10min。棄上清，向沉淀加入滅菌三蒸水100u1，再放入IOO'C水浴18min,13,000rpm離心10min，取上清，置-20'C冰箱中保存備用。2)熒光定量PCR反應取熒光定量PCR反應液14.5ixl，加入第一步所取得的DNA模板lnl，補DEPC水至25ul。循環條件為95'C變性10min，95'C30s，59。Clmin，59°Clmin，擴增50個循環。熒光信號在每次循環的延伸階段收集。3)結果判斷循環結束后，運用儀器自帶軟件分析檢測結果。循環域值(Ct值)設定原則根據儀器噪聲情況調整，以Ct值剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準；陰性結果判定無Ct值，且無典型的擴增曲線；陽性結果判定Ct值《35.0,且出現典型的擴增曲線；實驗灰區Ct值>35.0，且出現典型的擴增曲線的樣本建議重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。本實施例提供檢測三種侵襲性念珠菌的多重熒光定量PCR試劑盒，主要針對三種念珠菌檢測中的特殊性，對不同的靶片斷進行反應體系，如引物和探針濃度、退火溫度等的優化，建立了多重熒光定量PCR檢測三種侵襲性念珠菌的方法，是一種特異檢測三種侵襲性念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒。具體實施例2本具體實施例2的特點是所述三條探針如下所述'白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-BHQ1克柔念珠菌HEX-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-BHQi熱帶念珠菌ROX-CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACA-BHQI2)白色念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌陽性質控品三種念珠菌經"煮沸法"獲得的DNA樣品，一20'C保存。結合表2、表3所示，用本發明試劑盒擴增13種94株臨床上常見的致病性真菌、5種細菌和人全血細胞DNA,白色念珠菌、克柔念珠菌熱帶念珠菌的Ct值均《35.0，鑒定結果為陽性，而其它念珠菌、細菌、曲霉菌、新生隱球菌、人類基因組DNA等Ct值無讀數，呈陰性結果。由表2、表3數據結果充分證明本發明試劑盒具有很好的特異性。其余同具體實施例l。具體實施例3將白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌懸液的任意兩種或三種按10倍倍比稀釋為5X108、5X107、5X106、5X105、5X104、5X103、5X102、5X10'CFU/ml。按上述方法提取DNA后進行熒光定量PCR擴增，結果在5X103CFU/ml均仍能觀察到"S"型曲線，表明熒光定量PCR法最低可檢出5X103CFU/ml的上述四種念珠菌，本發明的試劑盒具有很強的靈敏性。具體實施例4隨機抽取的10份樣品，經多重熒光定量PCR法進行4次重復實驗，結果均與常規真菌培養結果相符，證明本發明試劑盒具有很好的重復性。表2多重熒光定量PCR法檢測標準菌株結果標準菌株編號白色念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌白色念珠菌ATCC64548+一一—白色念珠菌ATCC90028+—一一克柔念珠菌ATCC5258一+—一克柔^fe珠菌ATCC6258一+——光滑念珠菌ATCC2001，一—+—熱帶念珠菌ATCC750一——+乳酒念珠菌ATCC10022—一———近平滑念珠菌ATCC22019一一—一季也蒙念珠菌ATCC6260一——一<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3多重熒光定量PCR法檢測臨床分離菌株結果菌株種類'多重熒光定量PCR法結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過上述具體實施例可知，念珠菌核糖體RNA基因，(rDNA)為串連重復序列，由編碼18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA的基因和相互之間的轉錄間隔區(internallytranscribedspacers，ITS)構成。編碼rRNA的基因在生物進化過程中相對保守，一定程度上反映了各物種間的進化關系和種間差異，可作為研究生物系統進化和分類的可靠參照物，設計通用引物。ITS區進化速率較快，具有一定的種間變異性和種內保守性，可用于區分同屬不同種乃至種內水平的變異。其中，ITSII區有較高的種間變異性和種內特異性，可用來設計種特異核酸探針。根據保守區設計的通用引物和針對可變g:設計的種特異核酸探針，不僅可以把真菌跟其他病原菌區分開來，而且可將其鑒定到種。序列表<110>廣州醫學院第一附屬醫院、廣州呼吸病研究所、呼吸疾病國家重點實驗室<120>檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應用方法<160>1<210>1<211>〈212>DNA<213〉人工序列<220><223>為了用于病毒、細菌等病原體的檢測而設計的引物，用作熒光定量PCR擴增〈400〉3正向引物(Pl):5'~GGCATGCCTGTTTGAGCGT~3'反向引物(P2):5'~TCCTCCGCTTATTGATATGC~3'〈210>2<211><212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉為了用于病毒、細菌等病原體的檢測而設計的三種特異性熒光定量PCR探針序列及熒光標記序列，用作熒光定量PCR擴增〈400>3白色念珠菌歷-CCTAAGCCATTGTC嵐GCGATCCCG-BHQ1克柔念珠菌HEX-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-朋Q1光滑念珠菌CY5-TTMTCTGCTGCTCGTTTGCGCGA-BHQ3〈210〉3〈211><212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉為了用于病毒、細菌等病原體的檢測而設計的三種特異性熒光定量PCR探針序列及熒光標記序列，用作熒光定量PCR擴增〈400>3白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCMAGCGATCCCG-BHQ1克柔念珠菌HEX-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-朋Q1熱帶念珠菌R0X-CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACA-朋Q權利要求1、檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特征是1)在所述試劑盒內設有熒光定量PCR反應液、1～3種念珠菌的陽性質控品和陰性質控品；2)所述熒光定量PCR反應液含有特異性引物和1～3種念珠菌相對應的熒光探針，所述特異性引物序列如序列表SEQID№1所示；3)所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的標準菌株中的一種、任意二種組合或任意三種組合，經“煮沸法”獲得的DNA樣品，所述侵襲性念珠菌的陰性質控品為滅菌三蒸水。2、如權利要求l所述的檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特征是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的標準菌株，經"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌相對應的熒光探針序列如序列表SEQIDN2:2所示。3、如權利要求l所述的檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特征是所述侵襲性念珠菌的陽性質控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌的標準菌株，經"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌相對應的熒光探針序列如序列表SEQIDNa:3所示。4、檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于包括以下步驟1)用"煮沸法"從待測標本中提取DNA;2)分別取第l)步中待測標本的DNA和與所述DNA同樣量的陽性質控品，加入到含有熒光定量反應液的PCR反應體系中；3)用熒光定量PCR檢測儀進行檢測，根據反應結果的Ct值，對檢測結果進行判斷。4)所述結果判斷方法是檢測樣品Ct值《35.0者，且出現典型的擴增曲線判為陽性；無Ct值，且無典型的擴增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0，且出現典型的擴增曲線的樣本，按前述步驟重做。重做結果出現Ct值和典型的擴增曲線者為陽性，否則為陰性。5、如權利要求4所述檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于熒光定量PCR反應體系的反應條件是95。C變性10min，95。C30s，59。Clmin，59°Clmin，擴增50個循環。6、如權利要求4所述檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應用方法，其特征在于所述Ct值指熒光信號在每次循環的延伸階段收集，熒光信號閾值以剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準，擴增產物的熒光信號達到閾值時所需的擴增循環次數。全文摘要本發明涉及檢測三種/三種以下侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特征是1)在試劑盒內設熒光定量PCR反應液、1～3種侵襲性念珠菌陽性質控品和陰性質控品；2)熒光定量PCR反應液含有特異性引物和熒光探針；3)陽性質控品由前述念珠菌的標準菌株中的一種、任意二種組合或任意三種組合，經“煮沸法”獲得的DNA樣品，陰性質控品為滅菌三蒸水。其應用方法如下1)從待測標本中提取DNA；2)將DNA和同樣量的陽性質控品加入到含有熒光定量反應液的PCR反應體系；3)用熒光定量PCR檢測儀進行檢測，根據反應結果的Ct值，對檢測結果進行判斷。本發明可同步對1～3種侵襲性念珠菌進行檢測，為臨床侵襲性念珠菌病的早期病原體診斷提供依據，可減少死亡率和后遺癥。文檔編號C12Q1/68GK101586159SQ20091003819公開日2009年11月25日申請日期2009年3月25日優先權日2009年3月25日發明者何為群,劉曉青,張彥峰,淳楊,靈楊,袁錦屏,邱桂霞,黃紅川,黎毅敏申請人:廣州醫學院第一附屬醫院;廣州呼吸病研究所;呼吸疾病國家重點實驗室