專利名稱：：蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于農業生物防治和農業微生物基因工程領域。具體涉及一個具有殺線蟲活性的殺蟲晶體蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在微生物殺蟲劑中的應用。
背景技術：
：蘇云金芽胞桿菌(5a"7/船A"ri/^Zera&，Bt)是一類廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性細菌，在其生長發育過程中，能夠形成內生芽胞，因其伴隨芽胞形成而產生對昆蟲具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCiystalProteins,ICPs)，而有別于分泌腸毒素的蠟狀芽胞桿菌(5a"7to和引起炭疽病的炭疽芽胞桿菌(5ac說wa"AracW。研究表明，蘇云金芽胞桿菌產生的晶體蛋白可以對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱10個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物門、扁形動物門中某些有害種類也有特異的生物活性(Schn印fHE，CrickmoreN，RieJV，LereclusD，BaumJ,FeitelsonJ，ZeiglerD民DeanDH.1998.Sacz7Zws//!M/7."g/e"sfsanditspesticidalcrystalproteins.AficroZn'o/Afo/5Zo/iev，62:775-806)。Aroian的實驗室用實驗充分證明了蘇云金芽胞桿菌對線蟲的特異活性(Wei*J.Z.，Hale*K.，CartaL.，PlatzerE.，WongC.，FangS.C.,andAroianR.V.(2003).萬"c飾5Ciystalproteinsthattargetnematodes.Ato/.Jcai100:2760-2765)。蘇云金芽胞桿菌野生菌株一般含有多個編碼殺蟲晶體蛋白的基因。自1981年Schnepf和Whiteley從庫斯塔克亞種(subsp.bratofo')菌株HD-1中克隆得到第一個殺蟲晶體蛋白基因以來，陸續發現并鑒定了許多新的殺蟲晶體蛋白基因。此后，新的殺蟲晶體蛋白基因的克隆一直是蘇云金芽胞桿菌研究領域中的熱點。因此在1995年的無脊椎病理學年會上成立了由Crickmore等學者組成的殺蟲晶體蛋白基因命名委員會，并于1996年正式提出了蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白按氨基酸序列同源性進行分類的新的分類系統，規定了命名規則和分類原則。其規定cjj基因是來自蘇云金芽胞桿菌編碼伴胞晶體蛋白的殺蟲基因或者與已知C7基因有明顯的序列相似性的基因，C^基因是編碼具有溶細胞活性的伴胞晶體蛋白基因或與已知編碼Cyt蛋白有明顯的序列相似性的基因。根據全長基因推導的氨基酸序列的同源性分為四個等級。級與級之間的界限為同源性95%、78%和45%。截至2008年12月，蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因已累計達到55類436種oy基因和2類27個cj^基因(CrickmoreN，ZeiglerDR，FeitelsonJ,SchnepfE,vanRieJ,LereclusD,BaumJ,DeanDH.1998.Revisionofthenomenclatureforthe5a"7/wspesticidalcrystalproteins.A/z'cro6z'o/.Afo/.Zev.62:807-813)。3一種重要的植物寄生線蟲，主要寄生于被感染植物的塊根、塊莖、鱗莖或球莖上，從寄主體內吸取營養，造成寄主植物的生長發育不良、畸形、矮化甚至死亡，每年都給農業生產帶來重大損失。它們可以寄生于110多種植物，包括大豆、花生、煙草、黃瓜、牡丹等，而茄科、葫聲科、十字花科等植物的受害尤其嚴重(劉維志，植物病原線蟲學，北京中國農業出版社，2000)。由于其生活史短，分布面廣，目前已經成為農業生產上最重要的病原生物之一(WidmerTL，AbawiGS.MechanismofsuppressionofAfe/oW柳"ehaplaanditsdamagebyagreenmanureofSudangrass._P/awfIfeeose，2000，85(5):562-568.)。同時又由于根結線蟲的侵入往往會使真菌和細菌更易侵染植物，是誘發植物病害的重要原因之一(江來發等.根結線蟲生物防治研究進展.yfjT^ej^丈學^^f^^^^^^j,2002,26(1):64-68.)。傳統的防治根結線蟲的方法主要包括輪作、休耕和化學防治。但是在許多的發展中國家，人們必須依靠多年生作物和作物連作，輪作和休耕都很難用于防治根結線蟲；而化學防治的方法又會給環境帶來很大污染。因此，通過生物的方法防治根結線蟲逐漸成為該領域的研究熱點之一。關于蘇云金芽胞桿菌對植物寄生線蟲防治的研究，最早的報道為1972年Prasad等首次發現該菌的p-外毒素即蘇云金素對根結線蟲的卵和幼蟲有較高的毒殺作用(PrasadSSV,TilakKVBR,GollakotaKG.Roleof5ac,7/w說w!'"g/em^var.onthelarvalsurvivabilityandegghatchingof她/oW。gy朋spp.,thecausativeagentofroot-knotdisease./wertek尸加to/.，1972,20:377-378.)。隨后的研究又發現蘇云金素可以明顯降低線蟲對植物的侵染(IgnoffoCM，DropkinVH.Deleteriouseffectsofthermostabletoxinof_80<^7/1toxinof丑ac/〃ws^wv'"g/e"w'sonspeciesofsoil-inhabitingwyce/Zop/zagjiy,andplant-parasiticnematodes.■/A^"j.五w,o/wo/.5bc,1977，50:394-398.;DevidasP，CibulskiRJ，RehbergerL.Evaluationof5acz7/usf/wri"gz'es/i:exotoxinfornematodecontrol.A^wto/ogz'ca,1988，34(3):249-301.)。上個世紀80年代Bone等人的研究首次證實了蘇云金桿菌晶體蛋白對線蟲的殺蟲活性(BoneLW,BottjerKP,GilSS.Trichostrongyluscolubriformis:Egglethalitydueto5ac"/MS//!""'"g/e"57'scrystaltoxin.￡x/>.尸oras〖to/.,1985，60:314-322.)。之后，美國Mycogen公司的大量研究工作也進一歩證實了蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體對線蟲的作用(BradfishGA(1992).Processforcontrolling印idopteranpests.EP19920920639.)。此外他們還克隆了多個具有線蟲活性的毒素蛋白的編碼基因并申請了相關專利，而我們所能看到的關于蘇云金芽胞桿菌對線蟲的防治的報道也多見于這些專利中的描述。目前，已經有越來越多的抗線蟲的蘇云金桿菌制劑在田間應用。Sharma等用蘇云金亞種(subsp.f/!W/7力g/eM^)和以色列亞種(subsp.菌劑處理大麥根際土壤對南方根結線蟲(Me/o/(to幼wei"cogwY為起到了一定的防效；此外，他們還發現，用以色列亞種菌株Bti-H14的毒素蛋白處理大豆和玉米種子，能夠使大豆胞囊線蟲的寄生率顯著降低(SharmaRD.5ac///w^^7'"gfe"sfe:abiocontrolagentofAfe/oz,fitogy"e/"cogw-caonbarely.iVewato/ogi'a_Bro7era，1994,18:79-84.)。Ivanova貝ll報道某種蘇云金芽胞桿菌制劑能夠用于防治黃瓜和番茄上的根結線蟲；而Ensard則用蘇云金桿菌制劑在防治香蕉穿孔線蟲方面也取得了顯著效果(IvanovaTS.Efficiencyofbiopreparationincontrolofgallnematodeinprotectedsoil.々to版附—,1996,3:101-106.;EnsardJ.Effectsofthreemicrobialbrothculturesongrowthandpopulationsoffreelivingandplant-parasiticnematodesonbanana,fwc;pea"/。w"a/。//Vt,/WAo/。gy,1998，104(5):457-463.)。然而，隨著Bt殺蟲劑應用的推廣和使用強度的不斷增加，目標害蟲的抗性現象陸續被科學家們4所報道。研究人員從目標害蟲對Bt殺蟲劑的抗性機制的研究中發現，昆蟲對Bt殺蟲劑的抗性的產生與受體的識別與結合密切相關。因此，新的殺蟲晶體蛋白基因的克隆和應用已經成為預防與控制目標害蟲對Bt殺蟲劑產生抗性的關鍵途徑，是各種防治策略的核心內容。而目前殺線蟲晶體蛋白基因資源十分有限，因此，尋找與克隆新的殺線蟲晶體蛋白基因已經成為蘇云金芽胞桿菌研究領域中最活躍的部分之一。蘇云金芽胞桿菌YBT-1518菌株是由申請人所在的農業微生物國家重點實驗室分離并保存的無鞭毛菌株(文獻見實施例)，它能夠在其芽胞形成過程中形成米粒狀的伴胞晶體，生物測定表明，它的晶體蛋白對秀麗小桿線蟲(CaewoWza6c/"isefegara)和北方根結線蟲(Afe/oWgye/w//a)具有較高的活性。在進一步的基因克隆中在該菌株中發現了2個殺線蟲活性的晶體蛋白基因ciy5B和cry6Aa2，但是該菌中是否還存在著其他的具有殺蟲活性的基因，前人的研究還不清楚。
發明內容本發明的目的在于從蘇云金芽胞桿菌中分離、克隆一個新的具有殺線蟲活性的晶體蛋白基因，利用其編碼的蛋白應用于微生物殺蟲劑中。本發明從報道的蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中分離并克隆了一種新型的殺線蟲晶體蛋白基因^0;"/(§-_5，驗證它對北方根結線蟲具有高毒力，并揭示了該晶體蛋白在防治根結線蟲領域的應用。本發明是這樣實現的申請人從報道的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1518(菌株來源參見實施例l)中分離到一個新的晶體蛋白基因《7""-"。經過測序發現本發明的晶體蛋白基因CTj""-J5其編碼區由861個堿基組成，具有序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。經過序列分析發現本發明的c77"/S-35基因編碼的蛋白Ciyl518-35是由286個氨基酸殘基組成，具有序列表SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，預計分子量人小為34kDa。通過原核表達和室內生物測定證實本發明的基因c7^WS-"在微生物中表達的Cryl518-35蛋白，能夠對北方根結線蟲有毒殺作用，這就預示著該基因可以用于構建抗線蟲的轉基因植物。本發明提供的上述基因序列是一種新的殺線蟲晶體蛋白基因，該基因可以應用于轉化微生物和植物，使之表達出Cryl518-35，使受體生物表現出對線蟲的毒殺活性，在寄生線蟲的生物防治方面具有廣泛的應用價值。更詳細的技術方案參考實施例部分的描述。序列表SEQIDNO:l是本發明分離克隆的蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質序列；圖l:是本發明實施例中殺線蟲晶體蛋白基因C7"M-35所在的BAC克隆子的物理圖譜；圖2:是本發明實施例中克隆載體pUC18-co^57S-35的構建圖及其物理圖譜5圖3:是本發明實施例中超量表達載體pEMB0225的構建圖及其物理圖譜；圖4:是本發明實施例中殺線蟲晶體蛋白基因CTy""-h在重組菌EMB0225中表達純化的SDS-PAGE電泳分析；圖中M:蛋白質分子量標準；1:純化后的Cryl518-35殺線蟲晶體蛋白。具體實施方案以下敘述是根據本發明實施方案的實施例。應該說明的是，本發明的實施例對于本發明只有說明作用，而沒有限制作用。有關DNA的標準操作方法和所使用的藥品均參考《分子克隆實驗指南》所描述的內容(參見薩姆布魯克和拉塞爾，2001，分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，北京)。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。實施例1蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因c/^5M-35的克隆本發明以蘇云金芽胞桿菌YBT-1518作為殺線蟲晶體蛋白基因C77"/S-J5的來源菌株，該菌株的來源見文獻Yu，Z.,P.Bai，W.Ye，F.Zhang，L.Ruan，Z.Yu，andM.Sun.ANovelNegativeRegulatoryFactorforNematicidalCryProteinGeneExpressionin￡ac!7ZiAi/n>jg!'era&.Mcroto/.傷ofec/jno/.18(6):1033-1039。該菌株無鞭毛，能形成典型的長米粒狀晶體，對根結線蟲和秀麗小桿線蟲具有高毒力。1.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518總質粒的抽提將蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1518過夜活化，按1/100(v/v)的接種量轉接至5mL新鮮的LB培養基中(LB培養基配方胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉0.5%，pH7.0)，28°C，200rpm培養至對數生長中期。STE(10mMTris.HCl，1mMEDTApH8.0)洗滌菌體1次；加入90溶液1(50mM蔗糖，25mMTris.HCl(pH8.0)，10mMEDTA)懸浮菌體，再加100mg/mL的溶菌酶(在溶液I中加溶菌酶)10pL，冰浴2h以上；加入200pL新鮮配制的溶液11(0.2MNaOH，1%十二烷基硫酸鈉，即SDS),輕緩混勻后置冰上冰浴510min;力B150nL溶液111(5MKAc60mL，冰乙酸11.5mL,定容至100mL)，混勻后置冰上放5min;以12,000rpm離心5min，吸取上清液到一個新的離心管，苯酚/氯仿/異戊醇溶液(體積比為25:24:1,v:w)抽提2次；上清液中加入2倍體積的無水乙醇或等體積的異丙醇，于室溫靜置510min;12,000離心5min，棄上清，加入70%乙醇，離心洗滌沉淀1次；真空干燥沉淀，用30含有20pg/mLRNase的TE溶液(lmMEDTA，10mMTris-HCl，pH8.0)溶解沉淀。2.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518總質粒文庫的構建將上步制備的質粒加入適量歷'"dIII進行不完全酶切，冋收5-12kb片段連接于載體pHT304(載體來源見ArantesOandLereclusD.1991.ConstructionofcloningvectorsforBacillusthuringiensis.Gene108:115-119)轉化大腸桿菌DH5ou并涂布氨芐青霉素抗性平板(含有IOOng/mL的氨節青霉素，100pg/mLIPTG和80pg/mL的X-gal)，抗性平板置于37'C培養箱中培養14h后，挑取白斑于新鮮的LB平板(含有100ng/mL的氨芐青霉素)，即得菌株YBT-1518的質粒文庫，隨機挑取1000個克隆保存于-80'C冰箱，從中隨機挑取12個克隆抽取質粒之后進行///"(1111酶切和0.8%瓊脂糖電泳檢測得該文庫的平均插入片段大小為8]*，1000個克隆大約可以覆蓋整個質粒基因組的23倍(假設質粒基因組總大小為300kb,每個質粒的拷貝數為3個)。3.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因c/7/57S-35的克隆禾擁基因《76.4的特異片段為探針，從上述構建好的總質粒文庫中篩選到了一個陽性克隆子EMB0229，對該克隆子的測序(由Invitrogen公司完成)表明該重組子中所含有一個大小為10kb左右的質粒pBMB0229(見圖l)。對該質粒進行序列分析發現該質粒上除了編碼有基因c/:y6A^外，在這個基因的卜游還存在一個同co^4a2高度相似的基因。申請人依據該基因的特異序列并在兩端引入酶切位點5awHI和歷"dUl設計上游引物P1(引物序列為5'-CGC^fA甲芒feATGAATAATATTAATAAGAAG-3，)和下游引物P2(引物序列為5'-CCC^40^BCTAAGATATATAAGCATTTAAAG-3')，并以重組質粒pBMB0229為模板進行PCR擴增以獲得目標基因，PCR反應的體系和程序如下25nL反應體系包含2.5jiL10xPCR反應緩沖液，1pLdNTP(各2.5mM),0.5特異性上游引物Pl(20mM)，0.5nL特異性下游引物P2(20mM)，0.2nL模板(質粒pBMB0229)，0.25nLExT叫酶，加滅菌去離子水至25nL。PCR反應參數和程序為94'C，5min，1個循環；94'C,20s，52°C，20s，72'C，1.5min，30個循環；72°C，10min，1個循環。將擴增到的目標片段通過PCR產物回收試劑盒(購自Omega生物技術公司)純化回收后通過T/A克隆連接到T載體pMD18-TSimpleVector上(購自TaKaRa公司)，得到含有c""7S-JJ全長序列的重組質粒pUC18-coJ5/S-J5(見圖2).。之后將該重組質粒轉化大腸桿菌(￡co/Z)DH5a，并涂布氨芐青霉素抗性平板(AmpK,終濃度為100pg/mL)。將抗性平板置于37'C培養箱中培養12-16h，待轉化子長到一定大小以后，通過質粒快檢(大腸桿菌質粒快檢方法參考張桂敏等，一種簡便快速篩選重組子的方法，湖北大學學報(自然科學版),2005,27(3):280-281.)對轉化子進行篩選。將篩選到的轉化子用5mL的液體LB培養基活化培養，然后抽提質粒進行酶切驗證，酶切片段大小與預期大小一致。最后將篩選到的陽性轉化子用5mL的液體LB培養基活化培養，取lmL的過夜培養物送樣測序(由Invitrogen公司完成)。測序結果顯示該基因具有如序列表SEQIDNO:l中所示的核苷酸序列，申請人將該基因命名為^y"M-"(在本發明中，被命名的基因以斜體小寫表示)。通過軟件分析預測此段編碼序列可編碼一個如序列表SEQIDNO:l中所示的由286個氨基酸組成的多肽片段，預測其分子量為34kDa，申請人將其命名為Ciyl518-35(在本發明中，被命名的蛋白以正體大寫表示)。74.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因CTy"/S-"的序列分析對co^i"-"的進一步序列分析表明，該基因由861個核苷酸組成，編碼一個由286個氨基酸組成的多肽，其理論分子量為34-kDa，在GenBank上進行的BlastP分析發現，同該多肽最相似的蛋白質為Cty6Aa2蛋白，其氨基酸序列的一致性為29.7%，相似性為40.4%，依據晶體蛋白基因的命名原貝U(參見文獻(CrickmoreN，ZeiglerDR，FeitelsonJ，SchnepfE，vanRieJ，LereclusD,BaumJ，DeanDH.1998.Revisionofthenomenclatureforthe5a"7/uyAwr/Mg-e,wispesticidalcrystalproteins.Af/cro6/o/.Afci/.5z'o/.Zev.62:807-813)，該基因將被歸為I類新型c"基因。實施例2殺線蟲晶體蛋白基因c/j^5M-35在大腸桿菌JM109中的表達純化及生物活性測定1.殺線蟲晶體蛋白基因cv^A57S-J5在大腸桿菌中超量表達載體的構建將實施例l中獲得的含有基因co^57S-35的重組質粒pUC18-cJ7/5/S-35經過AjmHI和歷"c/ffl雙酶切，同時將質粒載體pQE30進行相同的雙酶切，然后將上述載體和外源的酶切產物通過0.8%的瓊脂糖凝膠分離后，切下目標片段并通過DNA凝膠回收試劑盒(購自Omega生物技術公司)純化回收。之后將兩者通過T4DNA連接酶(購自TaKaRa生物技術公司)連接，從而獲得了含有基因c^v""-"全長ORF的重組表達質粒pEMB0225(見圖3),將該重組表達質粒轉化大腸桿菌五.co//DH5a(購自Tiangen公司)，并抽提質粒分別進行￡^^^1和///"必//雙酶切驗證，酶切片段大小與預期大小一致。進一步的測序結果表明c^/5/S-15基因被正確地插入了到了表達載體pQE30中。2.殺線蟲晶體蛋A基因C77W7S-"在大腸桿菌JM109中的表達和純化為了大量表達Cryl518-35蛋白，中請人將上述攜帶有其編碼序列的重組表達質粒pEMB0225轉化到大腸桿菌JM109(購自Tiangen公司)中，得到了重組菌JM109/pEMB0225。將該重組菌株接種于5mLLB液體培養基中(另外附加終濃度為100ng/mL氨芐青霉素)，過夜活化。以1:100(v/v)轉接至50mLLB液體培養基中，置于37。C搖床培養至OD6Q。為0.5-0.8左右以后，加入1.0mmol/L的異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)于37'C誘導培養3h。將上述50mL重組菌JM109/pEMB0225的3h誘導培養物經過12000rpm離心30s收集菌體，利用超聲波(技術參數功率400W，破碎30s，間歇30s)將細胞破碎后12000rpm離心15min取上清。然后將上清液過Ni-iDA親和jS析柱(His鎳tt)(購自Novagen公司)提純該特異蛋白Cryl518-35(具體的純化步驟按照試劑盒操作說明書進行)。對最終的純化產物進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖4所示，提純的蛋白與蛋白分子量標準比對，估算分子量為35kDa，與預計的晶體蛋白Ciyl518-35分子量大小35.2kDa基本吻合，證明本發明的殺線蟲晶體蛋白Ciyl518-35在大腸桿菌JM109中得到了成功的表達。申請人將上述的表達殺線蟲晶體蛋白基因的coJ5/S-35游重組大腸桿菌命名為(Esc/ien'c/n'aco")EMB0225，于2009年1月8日將該重組大腸桿菌送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCMO:M20卯09。重組大腸桿菌emb0225的生物學及遺傳學特性①生物學特性菌體直桿狀，營養體呈鏈狀或單生，長l-3微米，寬0.4-0.7微米，革蘭氏染色陰性，無芽胞，在牛肉膏蛋白胨培養基上菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。生長溫度范圍為15-46°C,最適生長溫度為37°C。兼性厭氧，在有氧條件下生長良好。在含0.5°/。NaCl的牛肉膏蛋白胨培養基中生長，最適生長pH為6.8-8.0。在葡萄糖、麥芽胞、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等培養基中產酸產氣，甲基紅反應陽性。②遺傳學特性本發明是以大腸桿菌^&cfen'cWaco/ZB121為出發菌株得到的基因工程菌，含有本發明得到的殺線蟲晶體蛋白基因《yU/s-"。經繼代培養，殺線蟲晶體蛋白基因c/t"M-W能夠在工程菌中穩定存在，表達正常，對受體菌的生長無重大影響。3.殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35對北方根結線蟲生物活性的測定以北方根結線蟲(We/oWogy^/zap/fl)的二齡幼蟲作為靶標線蟲檢測Cry蛋白對線蟲的生物活性。取被北方根結線蟲感染的番茄根，用自來水沖洗干凈。從根部取下根結線蟲卵塊，用0.5%NaC10消毒2次，然后25°C孵化35d，孵化山的線蟲即作為生物測定的靶標。生物測定在96孔板上進行，每孔吸入40頭2齡幼蟲(具體方法參考文獻余子全等，蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對植物寄生線蟲生物測定方法的建立和高毒力菌株的篩選，農業生物技術學報，2007(15):867-871)。整個實驗設57個濃度梯度，每個濃度設3個重復，用20ng/mLBSA作為陰性對照，純化的Cry6Aa2蛋白作為陽性對照。5天后統計死亡率，將死亡率校正后換算成幾率值，蛋白濃度換算成對數值，求出二者之間回歸方程計算LC50，結果見表l。從表1中可以看出，本發明得到的殺線蟲晶體蛋白Ciyl518-35對北方根結線蟲顯示出了很高的殺蟲活性，半致死濃度為7.43ng/mL,而且與已知的殺線蟲晶體蛋白Ciy6Aa2的殺線蟲活性相當。這些結果證明本發明得到的殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35對北方根結線蟲具有高活性。表1:殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35和Cry6Aa2對北方根結線蟲的活性檢測晶體蛋白回歸方程R2值半致死濃度Oig/mL)Cry6Aa2y=1.0297x+4.09610.98967.55Cryl518-35y=1.1067x+4.03590.96587.43本發明發現的晶體蛋白Cryl518-35對北方根結線蟲具有高毒力，為北方根結線蟲的生物防治提供了一種新的基因資源。9〈110〉華中農業大學<120>蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35及應用<130><141〉2009-01-09<160〉2<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉861<212>DNA〈213〉蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>gene<222>(1)..(861)<223><220><221〉CDS<222>(1)..(861)<223><400>1atgaataatattaataagaagtatagacttaatgatatgattaataaa48MetAsnAsnlieAsnLysLysTyrArgLeuAsnAspMetlieAsnLys151015aatcaatttattattteaaaaacagaatgggttactataagaacatat恥AsnGinPhelielieSerLysThrGluTrpValThrlieArgThrTyr202530attg朋attggattaactttsccagtsa^tgaacaageitttscgaa犯144lieGlulieGlyLeuThrLeuProValAsnGluGinAspLeuArgLys35404510tatttcaatttaaatccagatataacaetatctaatgatttttctgaa192TyrPheAsnLeuAsnProAsplieThrLeuSerAsnAspPheSerGlu505560ttatttgatatttgttattctattaaaaatttagetcaatggtggaat240LeuPheAsplieCysTyrSerlieLysAsnLeuAlaGinTrpTrpAsn65707580accactatacttcctttaattattaaatctgttaataatattacatea288ThrThrlieLeuProLeulielieLysSerValAsnAsnlieThrSer859095tatggatttaaaattgetggtaatccttttaataataaagaaggatac336TyrGlyPheLyslieAlaGlyAsnProPheAsnAsnLysGluGlyTyr100105110tttteaaaattacaaaatgaattscatattatt幼taattataattct384PheSerLysLeuGinAsnGluLeuHislielieAsnAsnTyrAsnSer115120125aat肌aeicbaca肌elactatt333caatttceieitcteggtgtaacatt432AsnLysThrThrLysThrlieLysGinPheGinSerArgCysAsnlie130135140ttaattaaggaagttaaacaatatgaagatgttaccaaaaatattgta480LeulieLysGluValLysGinTyrGluAspValThrLysAsnlieVal145150155160atattattaaataaacttttatatggtaatcagcaaaaattagaaggg528lieLeuLeuAsnLysLeuLeuTyrGlyAsnGinGinLysLeuGluGly165170175att3ttaatsttcaaaascgattoaaagtggttcaascsactttt犯t576lielieAsnlieGinLysArgLeuLysValValGinThrThrPheAsn180185190ccgatatctaatg肌set肌tttsatttat肪a3幼ctetttg犯s肌624ProlieSerAsnGluThrAsnUulieTyrLysLysLeuPheGluLys195200205ataaaaaaaataaatattggtttttttgaatgcgtaaataaatatata672lieLysLyslieAsnlieGlyPhePheGluCysValAsnLysTyrlie210215220agtatatttaacaaaataattattptgtggteaaatactgaacaacaa720SerliePheAsnLyslielielieMetTrpSerAsnThrGluGinGin225230235240attatagattttaaateaattttatttcaagaatttaaaaatataaat768lielieAspPheLysSerlieLeuPheGinGluPheLysAsnlieAsn245250255gaaacagttsttgaatttgaagat8ttsttgagstttggtt3att3t3816GluThrVallieGluPheGluAsplielieGlulieTrpLeulielie260265270getaaaaaatctcgtgaatttactttaaatgettatatatcttag861AlaLysLysSerArgGluPheThrLeuAsnAlaTyrlieSer275280285〈210〉2<211>286<212>PRT<213>蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)<400>2MetAsnAsnlieAsnLysLysTyrArgLeuAsnAspMetlieAsnLys151015AsnGinPhelielie'SerLysThrGluTrpValThrlieArgThrTyr202530lieGlulieGlyLeuThrLeuProValAsnGluGinAspLeuArgLys354045TyrPheAsnLeuAsnProAsplieThrLeuSerAsnAspPheSerGlu50556012<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>權利要求1、一個來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、一個來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因cr少"M-W的編碼蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。3、一株轉殺線蟲晶體蛋白基因tr少"M-"的重組大腸桿菌(Esc/zen'c&aco//)EMB0225，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M209009。4、權利要求2所述的編碼蛋白在制備微生物殺蟲劑中的應用。5、權利要求2所述的編碼蛋白在轉基因微生物或轉基因植物中的應用。6、權利要求3所述的重組大腸桿菌EMB0225在制備微生物殺蟲劑中的應用。全文摘要本發明屬于微生物基因工程
技術領域：
。公開了一種來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因的分離、克隆及其對線蟲的生物活性。本發明從對北方根結線蟲有活性的蘇云金芽胞桿菌YBT-1518菌株中分離得到一個新的殺蟲晶體蛋白基因cry1518-35；該基因的編碼產物為一種新的殺蟲晶體蛋白Cry1518-35；該蛋白Cry1518-35對北方根結線蟲有很高的殺蟲活性。本發明還包括表達殺蟲晶體蛋白基因cry1518-35的大腸桿菌重組菌EMB0225的制備，該重組大腸桿菌菌已保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCCNOM209009。文檔編號C12N15/32GK101492686SQ200910060470公開日2009年7月29日申請日期2009年1月9日優先權日2009年1月9日發明者喻子牛,明孫,彭東海,王鵬霞,郭素霞,阮麗芳申請人:華中農業大學