蘇云金芽胞桿菌3-1-a、殺蟲基因cry8Ax表達蛋白及其應用
【專利摘要】本發明涉及“蘇云金芽胞桿菌3?1?a、殺蟲基因cry8Ax、表達蛋白及其應用”，屬于生物防治技術領域。蘇云金芽胞桿菌3?1?a，其保藏編號為：CGMCC No.12440。從菌株3?1?a中分離得到的殺蟲蛋白，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優選所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。上述基因對農業害蟲具有一定的毒殺力，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。CGMCC No. 1244020160513
【專利說明】
蘇云金芽胞桿菌3-1 -a、殺蟲基因 crySAx表達蛋白及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及生物防治技術領域，特別是本發明設及對銷翅目農業害蟲具有高毒力 的化殺蟲基因及由該基因所編碼的蛋白質。
【背景技術】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱化)是一種分布廣泛的革蘭氏陽 性細菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。 它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt 在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白（Insecticidal CrystalProteinsJCPs)，也稱δ-內毒 素（delta-endotoxin)，它的形狀、結構和大小均與其毒力有著密切關系[Schnepf .Ε， Cri ckmore.N, Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R., Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins .Microbiol .Mol. Biol .Rev，1998,62(3): 775-806.]。自 1981 年Schnepf等克隆了 化的第一個ICPs基因，并于1985年發表了它的DM堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起， 目前（2014年4月）共776個，其中C巧基因738個，C巧模式基因289個；巧t基因38個，巧t模式 基因11個。當今，采用噴施化學農藥防治手段固然可W減輕害蟲對農作物的為害，但化學農 藥造成環境污染，長期W來，大量噴施化學殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其 它生態區系遭受破壞，而且嚴重污染環境，提高生產成本，破壞生態平衡。蘇云金芽胞桿菌 殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優點而被廣泛的應用于蟲害防治。蘇云金芽胞 桿菌除了直接作為生物農藥W外，1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準應用， 它使用的基因來自化C巧lAc。在接下來的幾年里，轉crylAb基因的抗蟲玉米，轉cry3Aa基 因的抗蟲±豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/c巧lAb基因的抗蟲 棉W來，已經被普遍種植。在轉基因作物商業化的第一個12年（1996-2007)中，由于能得到 持續穩定的收益，農民種植轉基因作物量逐年增加。自1996年W來，2015年已是轉基因作物 成功商業化種植的第20年。據統計，2015年全球轉基因作物的種植面積約1.797億公頃，與 2014年1.815億公頃相比減少1%。在運20年里，全球已累積種植轉基因作物面積約20億公 頃，相當于美國總陸地面積的兩倍，保守估計農民獲益超過約1500億美元。截止到2015年12 月，已有28個國家成功種植轉基因作物，其中20個為發展中國家，且轉基因作物的種類、范 圍W及種植面積也在隨著轉基因技術的不斷發展而增長并將繼續保持增長趨勢。中國750 萬資源匿乏的小農戶種植了420萬公頃的化棉花，采用率為90%，平均每戶農民種植0.5公 頃的化棉花。轉基因作物商業化給工業化國家和發展中國家的農民都帶來了經濟和環境效 益。蘇云金芽胞桿菌及其基因發掘已成為可持續發展農業中重要課題。
[0003] 由于目前商品化的轉基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來避免害蟲抗藥性上升的風險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的化殺蟲基因，可 W豐富殺蟲基因資源，為轉基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高化轉基因產品的 抗蟲效果，并且可w降低害蟲對化毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的 經濟、社會和生態效益。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種對銷翅目害蟲大猿葉甲，馬鈴馨甲蟲等活性的蘇云金芽胞桿菌3- 1-曰，及其殺蟲新基因基因 crySAx和其晶體殺蟲蛋白，W應用于轉化微生物和植物，使之表 現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。
[0005] 蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a，其保藏編號為:CGMCC No. 12440。
[0006] 蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a在殺滅銷翅目大猿葉甲，馬鈴馨甲蟲農業害蟲中的應 用。
[0007] 殺蟲蛋白化784^，其氨基酸序列如569 10^:2所示。
[000引殺蟲基因 crySAx，編碼殺蟲蛋白CrySAx。
[0009] 殺蟲基因 crySAx，其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0010] -種表達載體，其特征是含有crySAx基因。
[0011] 所述表達載體為祀B-cry8Ax，其骨架載體為祀B，其結構如圖4所示。
[0012] 一種微生物轉化體，其特征是含有crySAx基因。
[0013] 殺蟲基因 crySAx在殺滅銷翅目農業害蟲大猿葉甲，馬鈴馨甲蟲中的應用。
[0014] 所述應用是將殺蟲基因 crySAx轉化到植物中，使植物表達對農業害蟲的抗性，或 者是將殺蟲基因 crySAx表達的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分殺滅農業害蟲。
[0015] 本發明人從黑龍江省安達市附近±壤中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株3-1- 曰，其保藏編號為CGMCC No. 12440,該菌株生物學特性為在生長周期中可W產生芽胞，并且 同時產生有毒殺銷翅目農業害蟲大猿葉甲殺蟲活性作用的伴胞晶體;從該菌株中得到一個 新基因的陽性克隆，即祀B-C巧8Ax(見圖4)，對其進行測序分析，在NCBI網站上應用BLAST并 應用DNAMAN等生物軟件進行分析，分析結果證明所克隆的基因是crySAx基因，該基因編碼 框是由大小為2217bp，編碼738個氨基酸殘基，與CrySAb的氨基酸相似度為80.2 %，所W該 基因應屬于第二等級的新基因。
[0016] crySAx基因可按生物技術的常規方法轉化微生物、植物，表現出對相關銷翅目害 蟲毒性。
[0017] 將上述基因轉化菌株，表達得到的蛋白可W制成生物農藥用于殺死銷翅目害蟲。 同時，可W轉入植物構建抗蟲轉基因植物，用于害蟲的防治。
[0018] 本發明分離克隆的化crySAx基因序列及其基因表達產物能夠對農業害蟲大猿葉 甲有一定的毒殺力，crySAx可擴大對銷翅目害蟲大猿葉甲，馬鈴馨甲蟲的殺蟲譜。通過應用 于轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉 基因植物抗藥性的產生。
[0019] 蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a，保藏信息：
[0020] 菌種分類命名：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)
[0021] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0022] 保藏日期:2016年5月13日
[0023] 保藏編號:CGMCC No.12440
【附圖說明】
[0024] 圖1光學顯微鏡下觀察菌株3-1-a菌體的形態，
[0025] 圖2 crySAx基因全長PCR結果，
[0026] 圖3 crySAx基因在大腸桿菌中表達蛋白的SDS-PAGE，
[0027] 其中：1 .Bt 3-1-a蛋白質組分M:高分子量蛋白Marker; 2 :C;ry8Ax蛋白組分，3 : 化y8化蛋白組分4:祀B空載體組分
[002引圖4重組載體祀B-cry8Ax的結構圖，
[0029] 圖5序列同源性分析。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明
[0031] 實施例1、分離得到蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a
[0032] 本
【申請人】的實驗室工作人員從黑龍江省安達市±壤中分離的得到一株蘇云金芽 胞桿菌，蘇云金芽胞桿菌的芽胞由外向內依次為芽胞外壁、芽胞衣、皮層、芽胞內壁，原生質 膜和原生質體。其中皮層的主要成分是膚聚糖，不含營養細胞的多聚糖憐壁酸，它保持著芽 胞的脫水狀態和耐熱性，另一方面，芽胞形成過程中，會產生大量DPA-Ca藝合物，使得芽胞 中的生物大分子形成耐熱凝膠，在80°C下熱處理20min，蘇云金芽胞桿菌芽胞也不會死亡并 且休眠的芽胞在75°C的亞致死溫度下處理15min，活化效果最好，不但促其快速萌發，還可 提高芽胞的成活率(喻子牛1990)。依據運一特性，可實施溫度篩選化nowles B H，Ellar D J.Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J].Biochimica et bio地ysica acta,1987,924:509-518.;戴蓮韻，王學聘等.中國八個自然保護區森林± 壤中蘇云金芽胞桿的分布[J].微生物學報，1994,30(2)117-121)。
[0033] 1、1菌株的分離
[0034] 1)取分裝的±樣加入到50ml大離屯、管中，至錐形管錐形處。
[00巧]2)加滅菌水至15ml處，放入玻璃珠5~10顆。
[0036] 3)用振蕩器將±樣打碎。
[0037] 4)放入水浴鍋中80°C，20分鐘。
[003引 5)取1.5ml的EP管，每個管中加1ml滅菌水，再從50ml管中取10微升菌液加入到EP 管中混勻。
[0039] 6)從EP管中取100微升噴至ljl/2LB培養基中，涂勻。
[0040] 7)放入到30°C溫箱中培養2~3天。
[0041] 8)鏡檢觀察。
[0042] 晶體觀察
[0043] 光學顯微鏡：
[0044] 將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色3min，清 水沖洗，lOOx油鏡進行鏡檢，石炭酸復紅染液配制方法參見文獻(Baroy F，Lecadet Μ M, Deleluse A.Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridium bifermentansU] .Gene, 1998,211: 293-295)。見圖 1所示。在1/化B培養基上 培養4她后形成單菌落，光學顯微鏡下觀察到菌株3-1-a菌體為長桿狀，芽胞為長圓棒狀，晶 體為雙錐形。
[0045] 電鏡顯微觀察：
[0046] 掃描電鏡制樣:抱晶混合液滴于玻璃片上，干燥，經餓酸固定，而后經酒精梯度脫 水，臨界點干燥，離子瓣射噴金(2nm厚），化W Bio-TEM H-7500掃描電鏡觀察拍照。如圖1B所 /J、- 〇
[0047] 生物學測定表明，對大猿葉甲的初篩生測結果為校正死亡率為80%。
[004引將該菌株保藏，其保藏編號CGMCC No. 12440。
[0049] 化菌株3-1-a產生的晶體形態，如圖1中光學顯微鏡下箭頭所示，從左到右依次為 球形晶體和芽胞；
[0050] 實施例2.獲得新基因
[0051] 通過全基因組測序，發現菌株化3-1-a基因組上含有一個與crySAbl相似度極高的 〇巧基因，設計全長引物84尸(5'4了644了46了6了417644了43'）和
[0052] 8AR(5'ATAAAGTGGTGAAAGATTAGTTGGS'),
[0053] 采用快速克隆方法對該菌株中的新cry 8Ax基因進行分離克隆。
[0054] 用時uDNA聚合酶，用如下體系進行PCR擴增。 KiyPCR buffer 5,uL ciNTP( lOmVi) 1 uL
[0055] 引物對(lOmM) 1μΙ7 個 模板 luL kodDNA 聚合酶口 υ/μ〇 0.5μΙ^
[0化6] 超純水補至50yL，混勻離屯、。
[0057]擴增循環:94°C變性1分鐘，54°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，25個循環，最后72°C 延伸10分鐘。如圖2所示。
[0化引2.2連接方案 載體 0.1-0,2 μ g 目的片段DNA 0.5-1.0 μ g
[0化9] 5 X Ligation BulTor 2 \xL· T4 DNA Ligasc 1 μL^
[0060] 用超純水補足體積到lOyL，充分混勻，16°C連接4h或4°C連接過夜。
[0061] 設計crySAx類基因的全長引物，擴增得到全長基因，將其與載體祀B(公開載體，本 所實驗室有保存，可W對外公開發放)載體進行連接，轉化入感受態JM109中，經抗性篩選、 PCR鑒定分析，篩選出含有crySAx基因的陽性重組質粒見圖4。圖3 PCR鑒定結果。將純化片 段與載體祀B連接轉化大腸桿菌JM109,得到陽性轉化子。對插入片斷進行測序分析，得到序 列SEQ ID NO 1，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示。由PCR擴增得到了大小正確的目的條 帶，將目的條帶進行純化并測序。測序結果顯示，3-1-a菌株中的crySAx基因大小為2217bp， 編碼738個氨基酸殘基，與crySAbl的氨基酸相似度為80.2%。見圖5
[0062] 2.3轉化方案
[0063] 2.3.1大腸桿菌轉化
[0064] 1.挑取單菌落于5ml LB震蕩培養過夜；
[0065] 2.按1 %接種量接種于LB液體培養基中，37°C，230巧m培養2-2.化r，（0化日日=0.5- 0.6);
[0066] 3.4°C，4,000rpm離屯、lOmin;
[0067] 4.棄上清，加入預冷的O.IM化Cl2 50ml懸浮細胞，置于冰上30minW上；
[006引 5.4°C，4，000巧m離屯、lOmin，回收細胞；
[0069] 6.用2-4ml冰預冷的0.1M CaCb重懸細胞，分裝成200μ1/0.5血離屯、管中，于4°C保 存(可保存一周）。
[0070] 7.取20化1感受態細胞與化L連接產物充分混勻，冰浴30min。
[0071] 8.42°C 熱激 1.5min，冰浴 3min。
[0072] 9.加入800μ1 LB 培養基 37°C 培養 45min。
[0073] 10.取200μ 1涂板，加入相應的抗生素，及IPTG，X-ga 1，37 °C培養。
[0074] 實施例3、基因表達與活性測定
[00巧]3.1.1在上述克隆提取質粒DNA，轉入受體菌Rosetta(DE3)中，獲得表達菌株。
[0076] IPTG誘導表達后，進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測。
[0077] 誘導表達過程如下：
[007引 1)活化菌種(371：、1化'）；
[00巧]2) 10 %接種于LB培養基中（37 °C、2虹）；
[0080] 3)加入誘導物 IPTG，150 巧m，18-22°c 低溫誘導 4-20h;
[0081] 4)離屯、收集菌體，加入lOmM Tris · Cl(pH 8.0)懸浮；
[0082] 5)破碎菌體(超聲波破碎完全）；
[0083] 離屯、12,000rpm lOmin 4°C ;
[0084] 收集上清及沉淀各10-1化L，分別電泳檢測。
[0085] 聚丙締酷胺凝膠配置如下。 分離膠8% (ml) 堆積膠5% (ml) Distilled waver 4.6 2.7 30% [)巧化sed Acrylamide 2.7 0.67 1.5M Tris(pH8.8) 2.5 LOOooJ l.OM Tris(pH6.8) 0.5 !0%SDS 0.1 0.04 !0%APS 0.1 0.04 TEMED 0.006 0.004
[0087] 上樣:上樣10-1化1，電泳：130-150V恒壓。
[0088] 染色與脫色：電泳后取出凝膠，用蒸饋水沖洗后，放入染色液中，6化pm振蕩染色 化r左右，脫色液中脫色化r左右，脫色至凝膠背景透明，清水中漂洗至蛋白帶清晰。
[0089] 將重組質粒祀B-cry8Ax，（見圖4)轉化到E.coli Rosetta(DE3)中，IPTG誘導表達， SDS-PAGE(12 % )凝膠電泳。結果表明，crySAx基因都能通過表達載體祀B在大腸桿菌中高效 表達大約為80kDa蛋白，而經IPTG誘導的轉入Rosetta(DE3)的祀B空載體沒有特異的目的條 帶產生(圖3)。
[0090] 3.2化菌株3-1-A及crySAx基因編碼蛋白的殺蟲活性測定
[0091] 將化菌株3-1-A及crySAx基因表達蛋白，用水稀釋到不同濃度，對大猿葉甲的殺蟲 活性，具體方法如下，量取10-20mL的待測樣品加入到滅菌培養皿中，然后選取新鮮的青菜 葉片，放入到培養皿中并均勻地浸入待測樣品溶液，10s。在試驗臺上事先鋪上一層保鮮膜， 將浸泡過樣品的葉片置于保鮮膜上室溫驚干，保證葉片兩面均驚干，分別置于培養皿中。用 毛筆輕輕地接入二齡幼蟲，每個培養皿中接30頭蟲，每處理重復Ξ次，接完蟲子后蓋好蓋 子，并用橡皮筋固定，防止幼蟲逃逸。將培養皿置于光照培養箱中，光照周期為14h，10h，培 養箱中放置水盆來調節濕度，并且需要每天來檢查葉片是否有干枯或腐爛的現象，是否有 水蒸氣凝結的現象。對供試昆蟲的培養條件為27°C，相對濕度在80% W上，9化后對大猿葉 甲進行調查死、活蟲數，并計算死亡率和LCso。、大黑觸金龜、暗黑觸金龜的殺蟲活性，具體方 法如下采用飼料混合法進行殺蟲生物活性測定。將制備好不同濃度梯度的表達蛋白樣品并 分裝于經過消毒的培養皿中，分別與飼料攬拌混勻，挑選活躍的初解幼蟲接于飼料上，每個 處理重復3次，每個重復為30頭試蟲。陰性對照為lOmmol/L Tris-Cl溶液作。試蟲的飼養條 件為相對濕度為70%-80%、溫度為27°C的光照培養箱中培養，飼育4她后調查死、活蟲數 量，計算死亡率。
[0092] W銷翅目昆蟲大猿葉甲（Colaphellus bowringi)初解幼蟲為測試昆蟲，利用誘導 表達的化y 8 Αχ蛋白對大猿葉甲進行生物活性測定初篩。生物活性測定結果顯示：當化y 8 Αχ 蛋白的濃度為l(K)yg/mL時，死亡率為62.5%，與對照組相比，校正死亡率為56.89%。對大猿 葉甲的LC50為83.329yg/mL(54.418-124.408)yg/血。對大黑觸金龜、暗黑觸金龜的殺蟲活 性比較低2(K)yg/mL時，分別為死亡率為24，36 %。
[0093] 本發明的有益效果:本發明分離克隆的化crySAx基因序列及其基因表達產物能 夠對鱗翅目產生毒力，特別對于大猿葉甲有一定的毒殺作用，可擴大對銷翅目害蟲昆蟲大 猿葉甲大黑觸金龜、暗黑觸金龜的殺蟲譜，通過應用于轉化微生物和植物，使它們表現出對 相關害蟲的毒性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
【主權項】
1. 蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a，其保藏編號為:CGMCC No. 12440。2. 權利要求1所述的蘇云金芽胞桿菌菌株3-1-a在殺滅農業害蟲中的應用。3. 殺蟲蛋白Cry8Ax，其氣基酸序列如SEQ ID N0:2所不。4. 殺蟲基因 cry8Ax，編碼權利要求3所述的殺蟲蛋白Cry8Ax。5. 權利要求4所述的殺蟲基因 cry8Ax，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。6. -種表達載體，其特征是含有權利要求4或5所述的Cry8Ax基因。7. 根據權利要求6所述表達載體，為pEB-cry8AX，其骨架載體為pEB，其結構如圖4所示。8. -種微生物轉化體，其特征是含有權利要求4或5所述的cry8Ax基因。9. 權利要求4或5所述的殺蟲基因 crySAx在殺滅鞘翅目農業害蟲中的應用。10. 根據權利要求9所述的應用，是將權利要求4或5所述的殺蟲基因 crySAx轉化到植物 中，使植物表達對農業害蟲的抗性，或者是將權利要求4或5所述的殺蟲基因 cry8Ax表達的 蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分殺滅農業害蟲。
【文檔編號】A01N63/00GK106011013SQ201610472022
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】李海濤, 高繼國, 劉榮梅, 張 杰
【申請人】東北農業大學