專利名稱：：5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法
技術領域：
：本發明涉及飼料工業和水體凈化劑一種枯草芽胞桿菌原藥(5，000億活芽胞/克)的制備方法，將在飼料工業和水產養殖方面上得到廣泛應用。隨著芽胞桿菌功能還在不斷地被發現，應用范圍也在不斷擴大，該產品將應用到如污染水體凈化、水果保鮮、垃圾除臭等新領域，在國內國際市場上有很強的競爭力。
背景技術：
：自20世紀50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進劑發揮了重大作用。然而，由于抗生素負面效果越來越嚴重，世界衛生組織己禁止在飼料中使用任何抗菌藥物，一些發達國家對獸用抗生素的使用也有明確規定。飼料和養殖業以添加抗生素預防和促進動物生長的飼養方式已經受到了很大沖擊，抗生素替代品的使用和推廣成為養殖業發展的必然方向。芽胞桿菌益生菌具備抗生素預防疾病和促進生長的特點，成為抗生素的替代品，將取得理想的應用效果，在養殖業中具有很大的開發潛力。益生菌又稱微生態制劑，是指有益微生物經過特殊馴化和加工制成的活菌制劑，益生菌可以改善動物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細菌性疾病的發生，能提高動物的飼料利用率、提高機體免疫力，促進生長和改善生產性能，得到安全無藥物殘留的動物產品。現已開發成商品制劑的益生菌有芽胞桿菌類、酵母、乳酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉等，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtillus簡稱Bs)是最重要的品種。目前，國內芽胞桿菌益生菌制品的生成工藝主要有兩種，即固體發酵法和液體深層發酵法。固體發酵法是把益生菌接種到固體培養基上進行發酵培養，其優點是相對管理比較粗放，具有生產工藝簡單，投資少的特點，但同時具易受雜菌污染，菌體含量不易控制、產品質量不穩定的缺點。目前我國大多數芽胞桿菌益生菌產品都是采用該生產方法。液體深層發酵法是采用現代發酵技術，將益生菌菌種接種到反應器中進行通風培養，對整個發酵過程都可以進行精細的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產品質量穩定的特點，但技術水平要求較高，相對固體發酵投資要高，但更適合工業化生產。其一般工藝流程為菌種接種培養一種子罐培養一發酵罐發酵培養一排放培養液—收集菌體—加入適量載體和保護劑一干燥一粉碎一過篩一稀釋混和一成品包裝—質檢—益生菌pfe口國內通常采用的固體發酵方式生產的枯草桿菌制劑(有效活菌數一般在200億cfWg左右)和部分廠家采用液體發酵生產的制劑(芽胞數一般為1000-2000億cfti/g)。
發明內容本發明的目的是在于提供了一種5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法，安全、高效優質，方法易行，由該工藝生產的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數達5,000億活芽胞/克。
發明內容包括安全的枯草芽孢桿菌益生菌的篩選；培養基優化及液體高密度補料發酵技術；高效的芽胞提取回收工藝；產品活芽胞數高。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施-1.Bs菌種的篩選從全國各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無菌水稀釋到100-200個芽胞/ml水，涂布在A,分離培養基上，于29-3rC溫控培養箱中培養3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態特征的菌株轉接到液體搖瓶發酵培養基中，29—3rC搖瓶培養后，選出生長迅速(發酵周期36小時以內)、生物量高(600nm可見光光密度OD6()Q>70)的菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4'C保種。2.Bs菌種的確認對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，測定KN-42菌株的16SrDNA共1421個有效堿基，根據枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結合系統發育資料及分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO.M208249。3.高產Bs的培養基優化采用Box-Behken設計的響應面實驗，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩選設計，利用合理的試驗設計，考慮碳源、氮源、無機離子等多個因素之間的協同作用，用于尋找臨近最大值的優化區域的最陡坡試驗(PathofSte鄰estascent),和用于優化響應面最大值的中心組合設計(CentralCompositeDesign)來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析，設計優化B49發酵培養基(葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物復合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L)。4.液體深層高密度補料發酵技術提高發酵生物量采用Box-Behken設計的響應面實驗優化的發酵培養基進行分批發酵動力學研究，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、pH、芽胞數為指標，確定各時期遲緩期、對數生長期和穩定期最佳營養平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關系。在分批發酵研究基礎上，優化高密度補料發酵工藝。5、高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2，升溫35。C，80目過濾，加3.18%。(質量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫20(TC，出口風溫85-87。C，原粉活芽胞數達5,000億/克。發明的目的在于對篩選的生長迅速、生物量高、產芽胞同步率高的枯草芽胞桿菌菌株(菌種專利保護)，釆用培養基的優化和高密度發酵工藝、高效芽胞回收工藝，生產出活芽胞數達到5,000億/克的枯草芽胞桿菌安全原藥，遠高于國內通常采用的固體發酵方式生產的枯草桿菌制劑(有效活菌數一般在200億cfo/g左右)和部分廠家采用液體發酵產品(芽胞數一般為1000-2000億cfWg)。枯草芽胞桿菌KN-42(Bad〃縱wMfcKN-42)，CCTCCNO.M208249。一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原藥的制備方法，其步驟是1.Bs菌種的篩選從全國各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無菌水稀釋到100-200個芽胞/ml水，涂布在A,分離培養基上(蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，1216'C滅菌30min)，于29—3rC溫控培養箱中培養3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態特征的菌株轉接到液體搖瓶發酵培養基中，29—3rC搖瓶培養后，選出生長迅速(發酵周期36小時以內)、生物量高(600nm可見光光密度OD卿^70)的菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4'C保種。2.Bs菌種的確認對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，測定KN-42菌株的16SrDNA共1421個有效堿基，根據枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結合系統發育資料及分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO.M208249。3.高產Bs的培養基優化采用Box-Behken設計的響應面實驗，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩選設計，利用合理的試驗設計，考慮碳源、氮源、無機離子等多個因素之間的協同作用，用于尋找臨近最大值的優化區域的最陡坡試驗(PathofSteepestascent),和用于優化響應面最大值的中心組合設計(CentralCompositeDesign)。來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析，設計優化B49發酵培養基(B-49:為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物復合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L)。4.液體深層高密度補料發酵技術提高發酵生物量采用Box-Behken設計的響應面實驗優化的發酵培養基進行分批發酵動力學研究，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、pH、芽胞數為指標，確定各時期遲緩期、對數生長期和穩定期最佳營養平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關系。在分批發酵研究基礎上，優化高密度補料發酵工藝。5.高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2,升溫35。C,80目過濾，加3.18%。(質量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫200。C，出口風溫85-87°C，原粉活芽胞數達5，000億/克。6.活芽胞數檢測稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入100mL，濃度為0.85%(質量比)水的生理鹽水，猛烈搖動混合均勻。再把混合瓶放在磁力攪拌器(CU-4上海君竺儀器制造有限公司)平臺上混合30min后，放入超聲波水浴器(KQ-600B昆山市超聲儀器有限公司)中超聲15min，然后再放在勻質器(Bagmixer400W/P/VW)中混合10min。將處理好的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7(TC水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到l(T取O,lmL到每個營養瓊脂培養基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養箱中培養16hr20hr。計平板上的菌落數，計算試樣中枯草芽胞桿菌的芽胞數。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果(1)處理方法能有效分散粉劑中粘結集聚的芽胞、殺滅熱穩定性和生物活性不穩定的無效芽胞，準確的檢測出產品中有效活芽胞的數量；(2)重復性好；(3)檢測過程不需要特殊昂貴的儀器；(4)成本低；(5)可以同時檢測7-8個樣品；(6)操作簡單便于推廣。具體實施例方式一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原藥的制備方法，其步驟是1.BS菌種的篩選從全國各地不同土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺上，稱取樣品l.Og裝入小三角瓶中，加入9mL無菌水，充分振蕩后靜置，取上清液做濃度梯度稀釋(lx10、1X1(T，，1X1(T，1X1(T，1X1(T)。用移液槍吸取稀釋液100ul均勻涂布在分離培養基上，于30'C溫控培養箱中培養3—5d后，挑出芽胞同歩率高(芽胞形成率》90%)的菌株，經革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態特征的菌株轉接到液體搖瓶發酵培養基中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉速為200rpm，30。C搖瓶培養后，選出生長迅速(發酵同期36小時以內)、生物量高(600nm可見光光密度OD,》70)的菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4'C保種。(1)A,分離培養基蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，12rC滅菌30min;(2)Bi液體搖瓶發酵培養基豆粕20g，玉米漿10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化鈉(NaCD3g，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g，七水硫酸鎂(MgS04.7H20)0.2g，七水硫酸亞鐵(FeS04.7H20)O.Olg，水lOOOmL，pH7.5，12rC滅菌30min。2.Bs菌種的確認對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，根據該菌株的16SrDNA序列進行分子分類。該菌株的16SrDNA共測定1421個有效堿基，系統發育資料及分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定該菌株為枯草芽胞桿菌。該菌株于2008年12月09日在中國典型培養物保藏中心保藏，枯草芽胞桿菌KN-42(&cz7/船幼to'fcKN-42),CCTCCNO.M208249。(1)菌種鑒定理化實驗結果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)菌種16SrDNA序列測定結果①測序試劑盒BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PERKINELMER);②測序分析儀器ABIPRISM377DNASequencer;③測序引物16(+):5，GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，16(_):5，CGGCTACCTTGTTACGAC3，④序列，共計1421bp，如SEQIDNO.1所示3.高產Bs的培養基優化采用Box-Behken設計的響應面實驗，以芽胞數(cfo)為篩選指標，利用單因子實驗首先從眾多碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉)；氮源(水解植物復合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨)；微量元素(氯化鈷(CoCl2)、碳酸鈣(CaC03)、硫酸鎂(MgS04)、磷酸二氫鉀(KH2P04)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeS04)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuS04)、硫酸鋅(ZnS04))因子中選擇重要的部分因子篩選設計，利用合理的試驗設計，考慮重要碳源(葡萄糖和玉米淀粉)、氮源(蛋白胨、豆粕和玉米漿)及無機離子(磷酸二氫鉀(KH2P04)和氯化鈉(NaCl))等多個因素之間的協同作用，用于尋找臨近最大值的優化區域的最陡坡試驗(PathofSteepestascent),和用于優化響應面最大值的中心組合設計(CentralCompositeDesign)來擬合因素與響應值之間的函數關系得到回歸方程，通過對回歸方程的分析來設計優化培養基B-49，芽胞數為70億cfu/ml。(1)、碳源因子通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出葡萄糖和玉米淀粉為Bs最佳碳源需求因子。(2)、氮源因子通過單因子實驗，從水解植物復合氯基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選出蛋白胨、豆粕和玉米漿為Bs最佳氮源需求因子。(3)、微量元素因子通過單因子實驗，從氯化鈷(CoCl2)、碳酸轉(CaC03)、硫酸鎂(MgS04)、磷酸二氫鉀(KH2P04)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeS04)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuS04)、硫酸鋅(ZnS04)中篩選出磷酸二氫鉀(KH2P04)和氯化鈉(NaCl)為Bs最佳微量元素需求因子。(4)、利用PB實驗設計(Plackett-BurmanDesign)篩選影響Bs芽胞形成的重要因子，試驗表明葡萄糖、玉米槳和蛋白胨對Bs芽胞形成有極顯著的影響，因此增加它們的用量對促進Bs芽胞形成具有積極的意義。通過最陡坡試驗(PathofSteepestascent)最終確定葡萄糖用量為14.42g/L，玉米漿用量為18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L時Bs芽胞數最高。利用SAS軟件設計中心組合實驗(CentralCompositeDesign),最終得到Bs發酵最佳配方B-49:為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L,，豆粕3.88g/L，水解植物復合氨基酸3.91g/L，，磯酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L，采用該配方，發酵液活芽胞數達70億/ml。4.高密度液體補料發酵技術提高發酵生物量以響應面法優化的培養基配方B-49進行分批發酵動力學研究，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、pH、芽胞數為指標，確定各時期最佳營養平衡(以C/N表示)，及與芽胞數關系。在分批發酵配方上進行碳源和氮源濃度加倍，分析出現反饋抑制因素及濃度，進行分批補料發酵動力學研究，確定補料工藝為采用初始糖濃度10g/mL，通過補加葡萄糖，使發酵過程還原糖濃度保持0.5-1.0%(質量比)水平，發酵工程共用葡萄糖7%(質量比)；，發酵過程補加氨水，使pH控制在6.8-7.2范圍；發酵過程通過調節轉速控制溶氧水平不低于臨界氧(3ppm)。較分批發酵相比，雖然菌數和總耗量明顯增加，但采用補料工藝，不僅沒有出現底物反饋抑制，也沒有因對數期溶解氧不能維持在臨界氧之上而影響芽胞的形成。釆用此工藝，發酵液活芽胞數達100億/ml。5.高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2，升溫35'C，80目過濾，加3.18%。(質量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥,噴霧干燥進口風溫200'C，出口風溫85-87。C，原粉活芽胞數達5,000億/克。6.活芽胞數檢測稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入lOOmL，濃度為0.85克氯化鈉/100ml水的生理鹽水,猛烈搖動混合均勻。再把混合瓶放在磁力攪拌器(CJJ-4上海君竺儀器制造有限公司)平臺上混合30min后，放入超聲波水浴器(KQ-600B昆山市超聲儀器有限公司)中超聲15min，然后再放在勻質器(Bagmixer400W/P/VW)中混合10min。將處理好的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7(TC水浴鍋中水浴30mki，然后稀釋到10—9取0.1mL到每個營養瓊脂培養基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養箱中培養16hr20hr。計平板上的菌落數，按下式計算試樣中枯草芽胞桿菌的芽胞數。N=C/M*1010.........式中C----幾個有效平板的平均菌落數，單位為個；M----試樣的稱樣量，.單位為克(g);101G_—試樣稀釋倍數。兩次平行測定相對偏差不大于12%。SEQUENCELISTING〈110〉武漢科諾生物科技股份有限公司〈120>5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法〈130〉5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法<140>2009100629648<141>2009-07-03<160>1<170>Patentlnversion3.1.<210>1<211>1421<212>DNA<213〉枯草芽胞桿菌<400>1ttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgactctcgtgg60tgtgeicgggcggtgtgt￡LCa鄉cccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcga120ttactagcgattccagcttc3CgC3gtCgagttgcaga>ctgcgatccgaactgag犯cag1803tttgtggg8Lttggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcac240gtgtgtagccC3ggtC3t犯ggggcatgatgatttgacgtcatccccatccttcctccggt300ttgtcsccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaaga/tc卿ggtt360gcgctcgttgcgggactt肌cccaacatctC3cgac8cgagctgacgacaaccatgcacc420acctgtcsictctgcccccget鄉ggacgtcctatctctaggattgtcagagggLtgtC鄉■acctggteaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctcaccgcttgtgcgggc540ccccgtc犯ttcctttgagtttcagtcttgcgaxxgtactcccc郷cgg3gtgCtt肌t600gcgttagctgC3gca^ct肌ggggc卿咖CCCCt犯C3Cttagcactcatcgtttacgg660cgtggEicteicceigggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcag720ttaC3g￡lCCag卿gtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcacc780gctacacgtggELglttCCgLCtctcctcttctgcactc犯gttccccagtttcc犯tgaccc840tccccggttg鄉cgggggctttcacatcagactt犯g肌accgcctgcgagccctttac900gcccaat肌ttccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagt960tagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgtt1020cttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttc3tcactcacgcggcgttgctcc1080gtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggcc1140gtgtCtC3gtcccagtgtggccgatcaccctctc鄉tcggctacgcatcgtcgccttgg1200tgagccgttacctceiccaactagctaatgcgccgcgggtcC6ltCtgt犯gtggtogccg31260agccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaaca9/Ccatccggtattagccccggttt1320cccggagttatcccagtctttacccacgtgttactcacccgtccgccgct1380aacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgc314211權利要求1、一種枯草芽胞桿菌，其特征在于枯草芽胞桿菌KN-42(BacillussubtilisKN-42)，CCTCCNO.M208249。2、權利要求1所述的一種制備枯草芽胞桿菌原藥的方法，其步驟是A.Bs菌種的篩選從土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺上，稱取樣品裝入小三角瓶中，加入無菌水，振蕩后靜置，取上清液做10—2、10—3、10—4濃度梯度稀釋，用移液槍吸取稀釋液均勻涂布在分離培養基上，于29—3rC溫控培養箱中培養3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出有Bs形態特征的菌株轉接到液體搖瓶發酵培養基中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉速為200rpm,3(TC搖瓶培養后，選出生長迅速的菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4匸保種；(1)A,分離培養基蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，121。C滅菌30min;(2)B,液體搖瓶發酵培養基豆粕20g，玉米漿10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化鈉3g，磷酸二氫鉀0.5g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸亞鐵0.01g，水1000mL，pH7.5，12rC滅菌30min;B.對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，測定KN-42菌株的16SrDNA共1421個有效堿基，根據枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結合系統發育資料及分類資料鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌；C.Bs的培養基采用Box-Behken設計的響應面實驗，以芽胞數為篩選指標，利用單因子實驗首先從碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子篩選設計，采用多元一次和二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系得到回歸方程，通過對回歸方程來設計培養基B-49,芽胞數為70億cfu/ml;(1)、碳源因子通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出葡萄糖和玉米淀粉為BS碳源需求因子；(2)、氮源因子通過單因子實驗，從水解植物復合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選出蛋白胨、豆粕和玉米漿為BS氮源需求因子；(3)、微量元素因子通過單因子實驗，從氯化鈷、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅、硫酸鋅中篩選出磷酸二氫鉀和氯化鈉為Bs微量元素需求因子；(4)、利用PB實驗設計篩選Bs芽胞形成的因子，確定葡萄糖用量為14.42g/L，玉米漿用量為18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L時Bs芽胞數，利用SAS軟件設計中心組合實驗，得到Bs發酵配方B-49為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，豆粕3.88g/L，水解植物復合氨基酸3.91g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鈉3g/L;D.高密度液體補料發酵技術提高發酵生物量采用Box-Behken設計的響應面實驗優化的培養基進行分批發酵，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、pH值、芽胞數為指標，確定營養平衡，及與芽胞數關系，在分批發酵配方上進行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度10g/ml,通過補加葡萄糖，使發酵過程還原糖濃度為0.5-1.0%質量比，發酵過程共用葡萄糖7%質量比；,發酵過程補加氨水，使pH控制在6.8-7.2范圍，發酵液活芽胞數達100億/ml;E.芽胞提取與回收工藝發酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2,升溫35°C，80目過濾，加3.18%。質量比硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。質量比黃血鹽，攪拌l分鐘，靜置15分鐘，離心菌槳進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫20(TC，出口風溫85-87°C，原粉活芽胞數達5,000億/克；F.活芽胞數檢測稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入100mL，0.85%質量比的生理鹽水，搖動混合均勻，再把混合瓶放在磁力攪拌器平臺上混合30min后，放入超聲波水浴器中超聲15min，然后再放在勻質器中混合10min，將處理的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7CTC水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到l(T取O.lmL到每個營養瓊脂培養基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養箱中培養16hr20hr。全文摘要本發明公開了一種5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法，其步驟是A.Bs菌種的篩選，從土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺上，稱取樣品裝入小三角瓶中，加入無菌水，靜置；B.Bs菌種的確認，根據16SrDNA序列進行分子分類，該菌株的16SrDNA共測定有效堿基，鑒定該菌株；C.Bs的培養基，采用Box-Behken設計的響應面實驗，以芽胞數為篩選指標，利用單因子實驗首先從眾多碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子；D.高密度液體補料發酵技術提高發酵生物量，以響應面法的培養基進行分批發酵，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、pH、芽胞數為指標；E.芽胞提取與回收工藝；F.活芽胞數檢測。由該工藝生產的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數達5,000億/克。文檔編號C12N1/20GK101619298SQ20091006296公開日2010年1月6日申請日期2009年7月3日優先權日2009年7月3日發明者娜余,劉華梅,青李,楊克華,王巧梅,程治國,繆華軍,翔謝,陳又香,陳振民,黃志遠申請人:武漢科諾生物科技股份有限公司