從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法
【專利摘要】本發明公開了從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法,步驟如下：(1)將活化的枯草芽孢桿菌接種于普通馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，搖床培養3d，將培養液離心，取上清液，得到枯草芽孢桿菌發酵液；(2)將枯草芽孢桿菌發酵液離心取上清，調節pH為2.5?3.0，4℃放置過夜；(3)發酵液離心，沉淀用甲醇萃取2?3h；(4)將濃縮后的甲醇萃取液上葡聚糖凝膠G?100分離，得到對桑椹致腐真菌抑制率高且成分單一的抑菌物質。該方法工藝簡便，易于工業化規模生產。
【專利說明】
從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種活性物質的分離方法，具體地講是涉及一種提取枯草芽孢桿菌中抗真菌活性物質--泛革素(F engycins)的方法。
【背景技術】
[0002]枯草芽胞桿菌產生的拮抗物質主要有抗生素、抗菌蛋白及揮發性抗菌物質等，其中脂肽抗生素是一個較大的類群，具有抗性強，耐高溫，耐酸堿的特點，對蛋白酶也有很好的抗性。脂肽抗生素能夠廣譜抑制植物病原菌，同時具有低毒性并且能夠被微生物降解，具備開發為環保型生物源農藥的條件。
[0003]生防芽孢桿菌脂肽抗生素包括三大類群:表面活性素類(surfactins)、伊枯草菌素類(iturins)和泛革素類(fengycins)。泛革素類的分子量為1500左右，由10個氨基酸和長度為14-18個的碳鏈的脂肪酸相連。作為防治效果較好的枯草芽孢桿菌，可以代替一些農藥或添加劑的使用，更符合現代安全、高效、綠色環保的理念。對其活性成分的高效提取，可以讓枯草芽孢桿菌更好的發揮作用。脂肽類抗生素的分離純化主要是依據其理化性質，通常需要沉淀、萃取、層析、高效液相色譜等步驟。沉淀目的是將脂肽抗生素從細菌發酵液中沉淀下來O沉淀方法有多種，如硫酸錢(80% )沉淀、MnCl2(7OmmoI/L)沉淀、濃鹽酸(12moI/L)沉淀等。對于含有多種脂肽抗生素的樣品可以利用液質聯用(LC-MS)、基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)、源后衰變結合基質輔助激光解吸飛行時間質譜(PSD-MALD1-T0F-MS)等技術進行分析。譚廣秀等(2012)在《蠶業科學》報道從桑枝組織中分離出有抑菌作用的枯草芽孢桿菌ME，對大腸桿菌(Escherichia col i )、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蕈狀芽抱桿菌(Bacillus mycoides)和白僵菌(Beauveria bassiana)的體外抑制率分別為59.92%、75.70%,51.60%,87.25%和69.81%。進一步實驗表明，在平板抑菌實驗中，該枯草芽孢桿菌ME菌懸液對桑椹致腐菌中核盤菌屬(Sc IerotiniaSc Ierot1rum ,GA)和鏈格孢屬(Alternariasp，GE)抑制率可以達到77.88%和80.61%。在桑椹采后保鮮中，采用該枯草芽孢桿菌細胞懸液或發酵液處理后，可以降低桑椹的發霉腐敗。徐楊等(2009)在《中國生物防治》上報道海洋枯草芽孢桿菌3512A分泌抗真菌脂肽。目前，相關發明專利有:枯草芽孢桿菌抗菌胞外產物的制備(ZL201010577733.3)，產生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其農藥制劑應用(ZL201 3104666 2 5.2)，枯草芽孢桿菌抗菌肽及其分離純化方法、應用(ZL20 14 107060 1 3.0)，一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質的分離提取方法(ZL200710012540.1)等等。但現有對枯草芽孢桿菌脂肽類物質提取的方法均存在操作復雜，對設備要求高，適用于制備少量脂肽類物質，不適合大規模生產等問題。
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的是提供一種從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，快速，且所得脂肽類物質為泛革素(Fengycin)同系物，對桑椹致腐真菌抑制率高。
[0005]為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案是:
[0006]從枯草芽孢桿菌中分離、純化抑制桑椹致腐真菌的脂肽類物質的方法，包括以下步驟:
[0007](I)枯草芽孢桿菌發酵液制備:將活化的枯草芽孢桿菌接種于普通馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)中，28°C搖床培養3d，將培養液離心得發酵上清液；
[0008](2)枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的分離:取上述發酵液用鹽酸調節pH為2.5-3.0，4°C冷藏過夜，10000r/min離心15min。用發酵液體積I 的有機試劑萃取沉淀2-3h，1000r/min離心取上清，即得到脂肽類粗提物甲醇溶液；
[0009]所采用的鹽酸摩爾濃度是6M;
[0010]所述的有機試劑為甲醇；
[0011](3)枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的純化:將上述脂肽類粗提物溶液濃縮至原體積的1/8，濃縮液經葡聚糖凝膠G-100分子篩層析，以甲醇為洗脫液，按流速lml/min洗脫，體積是上樣量的20-30倍，收集脂肽類物質洗脫液。
[0012]經驗證，所得洗脫液主要為泛革素類物質，其對菌核盤菌屬(SclerotiniaSclerot1rum，GA)和鏈格抱屬的(Alternariasp，GE)具有良好的抑菌作用。
[0013]本發明采用的原料是枯草芽孢桿菌發酵液，不受時間、地域限制;采用葡聚糖凝膠G-100分子從枯草芽孢桿菌中分離出Fengycins，安全無毒，易于降解，對桑椹致腐真菌有較強的抑制作用。
【附圖說明】
[0014]圖1.實施例1中第10，11，I 2管收集洗脫液對桑椹致腐真菌核盤菌屬(ScIerotiniaScIerot1rum,GA,圖1A，平板背面)和鏈格抱屬(Alternariasp ,GE，圖 1B，平板背面)抑菌實驗結果圖。
[0015]圖2.純化后脂肽類抑菌物質基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALD1-TOF-MS)分析圖譜。
【具體實施方式】
[0016]以下將結合附圖和實施例具體說明本發明的技術方案。
[0017]實施例1
[0018]枯草芽孢桿菌ME-2產抗真菌物質的分離、純化的方法，步驟如下:
[0019]步驟1.枯草芽孢桿菌發酵液制備:將活化的枯草芽孢桿菌用接種環挑取2環于滅過菌的300ml錐形瓶中，培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，28°C，250rpm轉速搖床培養3d，將培養液3500r/min離心5min得發酵上清液。
[0020]所述PDA培養基含20%馬鈴薯濾液(馬鈴薯去皮、切塊，煮沸，煮到熟而不爛，8層紗布過濾)、2 %瓊脂、2 %葡萄糖，自然pH下，121°C高溫滅菌30min。
[0021]步驟2.枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的提取:取2000ml上述發酵液，用6MHCl調節pH為2.5-3.0，4°C冰箱放置過夜，10000r/min離心15min。用10_20ml甲醇萃取沉淀2-3h，1000r/min離心取上清，即得到脂肽類粗提物甲醇溶液約15ml。
[0022]步驟3.枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的純化:將脂肽類粗提物甲醇溶液用EYELA N-1OOO型號旋轉蒸發儀濃縮至原體積的1/8，濃縮液經葡聚糖凝膠G-1OO分子篩層析，用甲醇溶液洗脫，洗脫流速為lml/min，收集對真菌有較好抑制作用的洗脫液(驗證第10，11，12管)。
[0023]分子篩層析選用葡聚糖凝膠G-100，根據分子的大小分離樣品收集液。過程如下:
(I)樹脂的活化:稱取適量的葡聚糖凝膠G-100，加入10-20倍的蒸餾水，在沸水浴中保持2-3h，并間歇攪拌。(2)裝柱:裝柱過程保證無氣泡產生，凝膠均勻無間隙。上樣:將脂肽類粗提物甲醇溶液旋轉蒸發至2-3ml上葡聚糖凝膠柱子。洗脫:用甲醇，按流速lml/min洗脫。收集:每5min收集一管。
[0024]步驟4.分離純化物質的特征性質分析:
[0025]紫外光譜:將分離純化收集的樣品進行紫外掃描，檢測分離物質的吸收波長。
[0026]紅外光譜分析:將部分樣品濃縮，50 °C烘干，取Img樣品與200mg的KBr混合研磨，壓片，紅外檢測，分析分離物質中所含有的原子基團。
[0027]高效液相色譜檢測:根據紫外掃描的結果，選用特征吸收波長，高效液相色譜檢測分離物質的吸收峰，收集對桑椹致腐真菌抑制率較高的組分。柱子:Waters液相色譜柱SymmetryShieIdRPl8，波長= 254nm,流動相為水:甲醇=20:80，流速為0.8mL/min。
[0028]質譜分析:分析枯草芽孢桿菌中抑制桑椹致腐真菌物質的組分，確定具體單一物質。
[0029]實驗例2分離物質的抑菌實驗
[0030]將TOA培養基平板上培養5d的菌核盤菌屬(SclerotiniaSclerot1rum，GA)和鏈格孢屬的(Alternariasp，GE)，用滅過菌的打孔器打出直徑為5mm的均勾圓形菌塊。在新的PDA培養基平板中間放上制備的GA、GE菌塊，再在距中心2.5cm的四角放置四個滅菌的牛津杯。吸取200μ1各洗脫管中的洗脫液，加入到牛津杯中。將平板置于28°C培養4d，通過觀察菌絲生長至各牛津杯的情況，判斷各洗脫管的抑菌活性。結果顯示，第10管對GA、GE抑制效果最佳，如圖1所示。
[0031 ]實驗例3純化后抑菌脂肽類物質的組分分析與鑒定
[0032]吸取ΙΟΟμΙ第10號洗脫管中的洗脫液，濃縮至5μ1。采用基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)分析純化后的抑菌物質。
[0033]說明:脂肽類抗生素根據其結構上的差異分為Surfactin、Iturin,FengycinA或B等三大家族和一些結構未知的環肽抗生素。
[0034]Surfactin是目前認為較好的生物表面活性素，有很強的抗病毒、細菌作用。Itur in家族的抗菌脂肽由七肽與8—氨基脂肪酸鏈通過酰胺鍵相連而成，主要分為Itur inA、B、C、D，Iturin對酵母菌和真菌有很強的抑制作用，而對細菌的抑菌活性是微弱的。Fengycin家族由β-羥基脂肪酸鏈(C14 一 C18)和10個氨基酸殘基的小肽組成的雙親分子，對絲狀真菌有很好的抑制作用，而對酵母和細菌無效。由圖2可以看出該分離純化物質主要為分子量在1435.5359道爾頓，1449.5511道爾頓，1463.5605道爾頓，1477.5714道爾頓等相差一個亞基的Fengycin A同系物，以及分子量為1491.5809道爾頓，1505.5884道爾頓，1519.5939道爾頓的Fengycin B同系物。說明該抑菌物質主要為有抑制真菌作用的泛革素類物質。
【主權項】
1.從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)枯草芽孢桿菌發酵液制備:將活化的枯草芽孢桿菌接種于普通馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，28 °C搖床培養72h，將培養液離心取上清液，得到枯草芽孢桿菌發酵液； (2)枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的分離:調節枯草芽孢桿菌發酵液的pH為2.5-3.0，4°C冷藏過夜，離心，用發酵液體積I 的有機試劑萃取沉淀2-3h，離心，取上清，即得到脂肽類粗提物甲醇溶液； (3)枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類物質的純化:將上述脂肽類粗提物溶液濃縮至原體積的I /8，濃縮液經葡聚糖凝膠G-1OO分子篩層析，收集洗脫液，即得。2.根據權利要求1所述的從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于，步驟(2)調節pH值所采用的是摩爾濃度為6M的鹽酸。3.根據權利要求1所述的從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于，步驟(2)所采用的有機試劑為甲醇。4.根據權利要求1所述的從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于所述的抗真菌物質主要為泛革素類物質，對菌核盤菌屬和鏈格孢屬的具有抑菌作用。5.根據權利要求1所述的從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于步驟(3)中，葡聚糖凝膠G-100分子篩層析采用甲醇為洗脫液，洗脫流速lml/min，體積是上樣量的20-30倍。6.從枯草芽孢桿菌中分離、純化抗真菌物質的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌ME-2(GenBank JQ900623)。
【文檔編號】C12P21/00GK105861602SQ201610221915
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月11日
【發明人】桂仲爭, 陳成, 賈俊強
【申請人】江蘇科技大學