專利名稱：檢測鴨病毒性腸炎的pcr方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬分子生物學領域，確切地說利用分子生物學檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法及試 劑盒，特別是鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株的檢測。
背景技術：
鴨病毒性腸炎(duck vi「al enteritis, DVE)，俗稱"鴨瘟"、"大頭瘟"或"爛腸瘟"。是鴨、 鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。流行廣泛傳播迅速，發病率高和死 亡率大。
近十多年來，我國養鴨業獲得迅速發展，據2002年根據聯合國糧農組織(FA0)統計， 我國鴨存欄約6. 61億只，占世界總量的69. 7%，可見我國是第一鴨生產大國。而且以每年10% 15%的速度遞增，新建的大規模養殖場逐漸增多，鴨產品的年產值己經接近300億元人民幣， 而且遠銷歐盟、東南亞、日本、韓國等地，隨著國民經濟的進一步發展，鴨產品空間還會不 斷擴大，所以養鴨業存在巨大的潛力。但由于各地多渠道引進種鴨或蛋，國內禽產品市場交 流頻繁，集約化飼養缺乏管理經驗，防疫工作措施不當，環境污染嚴重，導致鴨的各種疾病 不斷發生，而且越來越復雜，但危害較為嚴重的仍為病毒性傳染病，每年引起鴨死亡占到15% 20。/。，嚴重制約著我國養鴨業的持續穩定發展。截止目前，我國從國外引進種鴨(蛋)2000 萬只，鴨瘟是每次進出境種鴨(蛋)必檢的項目。
目前診斷鴨病毒性腸炎的常規檢測方法有1.臨床綜合診斷；2.病毒的分離和鑒定； 3.微量血清中和試驗；4.瓊脂糖凝膠沉淀試驗(AGP); 5.酶聯免疫吸附試驗(ELISA); 6. 免疫熒光或免疫酶檢測技術。而且一種方法難以確定診斷，最后要經過以上幾種方法試驗進 行綜合判斷。這些方法用于鴨瘟診斷耗時長，敏感性、特異性差，不利于快速、準確診斷該 病。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單、特異性強、敏感性高、成本低、適于大規模檢疫和 防疫監測的檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法及試劑盒。 檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法的引物 Pl (37154-37173): 5 ' — CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT—3 ' P2 (37580-37599): 5 ' — GAAGGCGGGTATGTAATGTACA—3 '。 檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法,包括以下步驟 (1)常規方法提取待檢樣品基因；
4(2) 將引物Pl、 P2與PCR混合液加入PCR反應管中混合后加入待檢樣品DNA，加入待 檢樣品基因；
(3) 將放入PCR反應管放入PCR檢測儀中進行反應；
(4) 取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳；
結果判定有擴增產物約446bp,核苷酸序如序列表SEQ IDNO. 1，為陽性；無擴增產物 約446bp為陰性；
步驟(2)所述的PCR混合物包括PCR緩沖液、dNTP 、 rTaq酶； 按引物P1 (10umol/L) luL 、 引物P2 (10umol/L) luL、
10XPCR緩沖液(10mraol/L) 5nL 、 dNTP (1O國ol/L) 4 u L、 rTaq酶(5U/uL) 0.25uL、 待檢病毒DNA模板 3 n L、
加純水至總體積50uL ;
本發明檢測鴨病毒性腸炎的PCR的方法，陽性對照品為鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株，質量濃 度選自0.07ixg/ uL的102 109倍倍遞增稀釋液。
步驟(3)按①溫度94。C、時間5min， 1個循環；②溫度94'C、時間30s ，溫度47'C、 時間30s ,溫度72"C、時間35s ， 35個循環，進行PCR反應； 檢測鴨病毒性腸炎的PCR的試劑盒它包括
溶液1: 1比1比例的引物P1、 P2;
溶液2:包括5: 4: 0. 25比例的10XPCR緩沖液(1O鵬ol/L) 、 d, (10腦1/L)、 rTaq酶(5U/uL);
檢測鴨病毒性腸炎的PCR的試劑盒的使用方法
(l)將所述溶液l: 2uL與溶液2: 9.25nL加入PCR反管內混合后，分別加入待檢 樣品DNA溶液、陽性對照品、陰性對照、空白對照3uL，加純水至總體積50uL;
(2) 將加好樣品的PCR反應管按順序放入PCR檢測儀中；
(3) 按①溫度94。C、時間5min， 1個循環；②溫度94。C、時間30s ，溫度47'C、時間 30s ，溫度72。C、時間35s ， 35個循環，進行PCR反應；
(4) 取8 uL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳；
陽性對照應出現一條約446bp的DNA條帶，陰性對照和空白對照沒有核酸條帶，試驗成
卞-
待檢樣品經電泳出現約446bp的DNA條帶，核苷酸序如序列表SEQ ID N0， 1，可判為陽性。
待檢樣品未出現DNA條帶，或者出現的條帶不是約446bp判為陰性。
本發明根據GenBank中發表的有關鴨病毒性腸炎的序列，選定其中的基因(UL30、 UL31) 經過篩選，設計并合成一對特異性引物，對鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株、標準毒株以及各地野株 提取的病毒DNA為模板進行PCR擴增，均得到446bp的與預期大小相符的特異性條帶，擴增產物 經凝膠回收后，連接到pMD18-T載體上，并進行PCR鑒定和Hind III/EcoR I雙酶切鑒定測序， 序列測定結果與己發表UL30、 UL31區的進行比較，同源性達100%，沒有發現變異現象。
對7種鴨易感病原體(鴨病毒性肝炎、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鵝源禽流 感H5毒株、新城疫、小鵝瘟)，3種同類病毒(豬偽狂犬病毒、牛傳染性鼻氣病毒、馬立克氏 病病毒；均無反應；敏感性檢測表明，最小檢測量2. lfg (或拷貝)。
抗凝血、糞便、腦、心、肝、脾、肺、腎、腸等DNA提取物用所本發明建立的PCR方法 檢測，均擴增出大小約446 bp的DNA片段，適于臨床和口岸檢測。
本發明與常規的鴨瘟診斷以病毒分離和瓊脂擴散試驗、ELISA等血清學試驗進行綜合判 斷以及其它PCR方法相比，靈敏度高、快速特異、操作簡便、易標準化，與現有PCR方法相 比特異性強、靈敏度高，杜絕假陽性、假陰性的出現。以鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株做陽性對照 更安全。
組裝的標準化的試劑盒，性能穩定，操作方便、迅速，擴增產量高，并制定了準確的判 定標準。
圖l PCR電泳圖，其中h正常SPF雞胚2: CEF細胞對照；3:標準毒株目的基因擴增
片段；M: DL2000。
圖2標準毒株目的基因的PCR敏感性圖，其中1、 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11: 100-1010稀 釋模板；M: DL2000。
圖3特異性PCR電泳結果圖，其中l:鴨病毒性肝炎；2:鴨巴氏桿菌；3:鴨大腸桿菌； 4:鴨沙門氏菌；5:鵝源禽流感H5毒株；6:新城疫；7:小鵝瘟；8:標準毒株陽性對照；M:
DL2000
圖4同類病毒特異性結果圖，1:豬偽狂犬病毒，2:牛傳染性鼻氣病毒，3:馬立克氏病 病毒；4:標準毒株；M: DL2000
圖5已知毒株的檢測結果，種l, 2， 3:己知鴨病毒性腸炎病毒；4， 5， 6: 3株疫苗毒株。
6圖6疑似病料的PCR檢測結果，其中1， SP070405; 2: SP080325; 3: TM050211; 4: CC070322; 5: CC070326; 6: CC041217; 7:陰性對照；8:標準毒株對照；M: DL2000。
具體實施方式
實施例l
鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株，購自中國獸醫藥品監察所，寶生物工程(大連)有限公司的DNA 提取試劑盒提取DNA;
選取GenBank (登錄號:EF417996)中UL30、 UL31 一段序列為模板，用Primer 5. 0軟 件設計并合成一對引物P1、 P2,理論擴增片段為446bp，引物的位置和序列如下 Pl (37154-37173): 5 一 一CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT—3 ' P2 (37580-37599): 5 ' —GAAGGCGGGTATGTAATGTACA — 3 '
由大連寶生物工程有限公司合成；
按表l的反應體系；
表1 PCR反應體系組成
溶液種類體積(ia)
10 X PCR緩沖液(10mmol/L)5
dNTP (10,1/L)4
引物P1 (10nmol/L)1
引物P2 (10umol/L)1
rTaq酶(5U/ u L)0.25
病毒DNA模板3
純H2。35. 75
總體積50
按表2的PCR反應條件;
表2 PCR擴增程序
循環階段循環數溫度(°c)時間
11945min
9430s
2354730s
7235s3 1 4'C 保存
同時用正常SPF雞胚和CEF細胞作陰性對照；
取8 UL上述的PCR產物于iy。瓊脂糖凝膠上電泳，鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株(簡稱鴨胚毒) 擴增產物約446 bp，結果大小相符；正常SPF雞胚和CEF細胞對照液均未檢出產物，電泳結 果見附圖l。
實施例2
將實施1中鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株(簡稱鴨胚毒)PCR產物，在1.0%低熔點瓊脂糖凝膠 上進行電泳，切下目的條帶，按微量凝膠回收試劑盒的使用說明回收目的DNA;將純化的目 的DNA 4. 5 u L、 T載體0. 5 U L和連接液5 P L混勻，16°C連接過夜，轉化DH5 a感受態 細胞，挑取白色菌落接種5 mL LB液體培養基，37°C水浴中搖振培養12 h;經堿裂解法提 取質粒，Hind III/EcoR I雙酶切鑒定為陽性質粒，送上海鼎安生物科技有限公司測序，測序 結果見序列表SEQ ID NO. 1。測序結果表明，PCR擴增片段長度為446bp,將所得序列與GenBank (登錄號EF417996)己發表的序列比較，二者的同源性為100%。
實施例3 敏感性試驗
將鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株雞胚培養物提取DNA，核酸測定儀上測定核酸質量濃度為 0.07ug/ uL，用配制的TE (pH8.0) 10倍遞增稀釋提取的DNA模板，每個稀釋度各取3 uL 模板DNA，按實施例l檢測，觀察陽性條帶，以出現陽性預期條帶所用模板量的最高稀釋度 計算其敏感性，結果最小檢出量為2.1 fg，見圖2。
實施例4
按實施例1方法，以鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株(簡稱鴨胚毒)作對陽性對照，分別對鴨病 毒性肝炎、巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鵝源禽流感H5毒株、新城疫、小鵝瘟，以及與 鴨病毒性腸炎病毒同類皰疹病毒豬偽狂犬病毒、牛傳染性鼻氣病毒、馬立克氏病病毒；鴨 病毒性肝炎、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鵝源禽流感H5毒株、新城疫、小鵝瘟 進行檢測，未能擴增出任何條帶，鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株(簡稱鴨胚毒)擴增出約446bp條 帶，見圖3，圖4。
實施例5
對本實驗室保存的3株已知鴨病毒性腸炎病毒和購買的3株疫苗毒株，按實施例1方法 檢測，結果6個樣品均觀察特異性擴增條帶，見圖5。
6個樣品的擴增產物按實施例2測序，將所得核苷酸序列與GenBank (登錄號EF417996)已發表的序列比較，同源性為100%。 實施例6按實例1方法，以正常健康鴨組織作為陰性對照，分別收集吉林省部分地區送檢的，經 臨床綜合診斷、病毒的分離和鑒定、微量血清中和試驗綜合診斷為鴨病毒性腸炎的病料6份 (SP070405， SP080325, TM050211, CC070322, CC070326, CC041217),均觀察到特異性擴增 條帶，而正常健康鴨組織無擴增條帶，見附圖6。6個樣品的擴增產物按實施例2測序，將所得核苷酸序列與GenBank (登錄號EF417996) 已發表的序列比較，同源性為100%。實施例7將鴨病毒性腸炎標準強毒DPV-F37 (購自中國獸醫藥品監察所)1000倍滅菌生理鹽水稀 釋后，按每只0.2mL劑量給健康北京鴨肌肉注射，共注射4只；另設2只對照，肌肉注射滅 菌生理鹽水，每只0. 2 mL;攻毒組4只北京鴨(人工感染)在攻毒后1周內全部死亡，分別采集抗凝血0. 5mL，分別 收集糞便、腦、心、肝、脾、肺、腎、腸0.5 g，加入10倍量滅菌PBS，研磨，反復凍融3 次，分別以3000r/min離心15min后取上清，按實例1方法檢測，觀察特異性擴增條帶；結 果見表5對照組2只北京鴨處死，和攻毒同樣方法采樣，按實例1方法檢測無特異性擴增條帶為 陰性，見表5。表5鴨組織病料PCR檢測結果組織類別攻毒鴨編號對照組編號12341 2抗凝血+++一 —糞++++— —腦++++一 —心++++— —肝++++一 —脾++++— —肺++— —腎++++一 一腸+十++— —9攻毒組擴增產物按實施例2測序，將所得核苷酸序列與GenBank (登錄號EF417996) 已發表的序列比較，同源性為100%。 實施例8對三個種鴨場，在鴨瘟雞胚化弱毒疫苗(簡稱鴨胚毒)免疫后的三個月后，隨機抽取30 只分別采集抗凝血0.5mL，加入10倍量滅菌PBS,研磨，反復凍融3次，分別以3000 r/min 離心15min后取上清，按實施例l方法進行檢測，均擴增出了擴增出約446 bp條帶。實施例9利用已建立的PCR方法，分別對來自10個不同地區的散養鴨采集的55份樣品，梅河口、雙 遼兩家大型種鴨場的100份樣品，以及近3年來進境檢疫保存的驗余樣品的30份隨機樣品分別 按實施例進行了測定，結果臨床樣品有3份出現特異性擴增條帶；見表6對3份出現特異性擴增條帶的擴增物按實施例2測序，將所得核苷酸序列與GenBank (登 錄號EF417996)己發表的序列比較，同源性為100%。表6采集樣品的檢測結果散戶/鴨場 樣品數 陽性數 陰性數德惠303磬石202四平1019長春16016圖們312臨江404長白615白城606前郭505雙遼某鴨場50050梅河口某鴨場50050本實驗室30030合計185318210SEQUENCE LISTING<110> 吉林大學〈120> 檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法及試劑盒<160> 1〈210〉 1〈211> 446〈212〉 DNA〈213> 鴨病毒性腸炎雞胚化弱毒疫苗株C-KCE 〈■> 1CMGGCTCTATTCGGTMTG ATCACAAAAC TTCGGAAGCTGTTTTAAAACGCTTTATTCC60AGAAACATACTGTGAGAGTG ACGAAACCGC AGCACTGCTATCTTCGGCCGGGTTTGCAGA120AGTGCGCTTGTACCCAGGGA TGCCACTCAG CGAGGAGGAGGAAAATCGTCAAAAGCTGCG180TAGAGCTTTCGATATTCTAG CAGAAGTTCC CCATCG嵐TTMGGTCGCACATTTTACAA240TAAATATCTTCMTACTTAT CTGTGGTACG CTGTCCACGTCAGTTTGCCGTTCGCGGTCG300CGCCTCACGACAAGTACGAA TGTAGMTGC CAAACATGAGCCATTAGACGGTATCCCCGG360CMGCAGATTTMGGCAGTC GATGAGACGA TAGTGTAGATGTACGGCATTTCCAGTAAAT420GGMTGTACATTACATACCC GCCTTC44權利要求
1、檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法的引物P1(37154-37173)5′-CAAGGCTCTATTCGGTAATGAT-3′P2(37580-37599)5′-GAAGGCGGGTATGTAATGTACA-3′。
2、 檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，包括以下步驟(1) 常規方法提取待檢樣品基因；(2) 將引物Pl、 P2與PCR混合液加入PCR反應管中混合后加入待檢樣品DNA，加入待 檢樣品基因；(3) 將放入PCR反應管放入PCR檢測儀中進行反應；(4) 取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳；結果判定有擴增產物約446bp,為陽性；無擴增產物約446bp為陰性。
3、 根據權利要求2所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，其特征在于步驟(2)所述的 PCR混合物包括PCR緩沖液、dNTP 、 rTaq酶；按引物P1 (10nmol/L) luL、 引物P2 (10umol/L) 1 y L、10XPCR緩沖液(10咖ol/L) 5uL 、 dNTP (10mmol/L) 4 P L、 rTaq酶(5U/ti L) 0. 25 y L、 待檢病毒DNA模板 3uL、加純水至總體積50uL 。
4、 根據權利要求2所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，其特征在于陽性對照品為鴨 瘟雞胚化弱毒疫苗株，質量濃度選自0. 07 w g / w L的102 109倍倍遞增稀釋液。
5、 根據權利要求2、 3所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，其特征在于步驟(3)按 ①溫度94'C、時間5min， 1個循環；②溫度94。C、時間30s ，溫度47。C、時間30s ，溫度 72°C、時間35s ， 35個循環，進行PCR反應。
6、 根據權利要求5所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，其特征在于所述的擴增產物 約446bp，其核苷酸序如序列表SEQ ID NO. 1。
7、 檢測鴨病毒性腸炎的PCR試劑盒它包括溶液l: 1比1比例的引物P1、 P2;溶液2:包括按5: 4: 0. 25比例的10X PCR緩沖液(10mmol/L) 、 dNTP (10mmol/L)、 rTaq酶(5U/nL)。
8、 根據權利要求6所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR試劑盒，其特征在于陽性對照品為 鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株，質量濃度選自0. 07 Pg / wL的102 109倍倍遞增稀釋液。
9、 檢測鴨病毒性腸炎的PCR試劑盒的使用方法(O將所述溶液h 2uL與溶液2: 9.25uL加入PCR反管內混合后，分別加入待檢樣 品DNA溶液、陽性對照品、陰性對照、空白對照3wL，加純水至總體積50uL;(2) 將加好樣品的PCR反應管按順序放入PCR檢測儀中；(3) 按①溫度94T:、時間5min, 1個循環；②溫度94。C、時間30s ，溫度47。C、時間 30s ，溫度72。C、時間35s , 35個循環，進行PCR反應；(4) 取8 uL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳；陽性對照應出現一條約446bp的DNA條帶，陰性對照和空白對贈沒有核酸條帶，試驗成待檢樣品經電泳出現約446bp的DNA條帶，可判為陽性；待檢樣品未出現DNA條帶，或者出現的條帶不是約446bp判為陰性。
10、根椐權利要求9所述的檢測鴨病毒性腸炎的PCR試劑盒的使用方法其特征在于所 述的約446bp的DNA條帶，其核苷酸序如序列表SEQ ID NO. 1。
全文摘要
本發明公開了檢測鴨病毒性腸炎的PCR方法，選擇鴨病毒性腸炎UL30、UL31基因片段，經過篩選確定一對引物，對標準毒株以及各地野株提取的病毒DNA為模板進行PCR擴增，均得到約446bp條帶，序列測定結果與已發表UL30、UL31區的進行比較，同源性達100％，沒有發現變異現象，對6種鴨易感病毒、3種同類病毒均無反應；各種組織DNA提取物用所建立的PCR方法檢測，均擴增出大小約446bp的DNA片段，最小檢測量2.1fg(或拷貝)，適于臨床和口岸檢測，本發明靈敏度高、快速特異、操作簡便、易標準化；組裝的標準化試劑盒，性能穩定，操作方便、迅速，擴增產量高，以鴨瘟雞胚化弱毒疫苗株做陽性對照更安全并制定了準確的判定標準。
文檔編號C12Q1/70GK101514374SQ20091006658
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月2日 優先權日2009年3月2日
發明者劉靜波, 玉 周, 潘風光 申請人:吉林大學