一種用ACCα基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法

專利名稱：：一種用ACCα基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法
技術領域：
：本發明屬于動物分子遺傳學領域，特別涉及一種采用分子標記檢測雞腹脂量的方法。(二)
背景技術：
：肉雞經過各國育種者多年的選育，其生產性能有了顯著提高。在肉雞早期生長速度得以明顯提高的同時，肉雞自身生理適應能力等方面也出現了一系列亟待解決的問題。快大型肉雞體脂(尤其是腹脂)蓄積過多已成為一個特別突出的問題。肉仔雞體內沉積過多的脂肪有諸多不利(1)明顯降低飼料轉化效率，因為沉積單位重量的脂肪組織比沉積單位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴體瘦肉對脂肪組織的比例，因而降低了分割肉產量；(3)加工者和消費者將肉仔雞體內沉積的這些脂肪的很大一部分(腹脂墊、肌胃周圍脂肪、嗉囔脂肪及腸系膜脂肪等)丟棄，這不僅增加了加工者和消費者的負擔，而且增加了廢物及處理水中的脂肪含量，從而污染環境。由此看來，肉仔雞體內沉積過多的脂肪將會給生產者、加工者和消費者造成顯而易見的經濟損失。同時肉種雞過肥也將會嚴重影響產蛋率、受精率和孵化率，并且會誘導脂肪肝綜合癥的發生，從而加大了產蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在雞體內的過多蓄積，進一步提高肉雞的飼料轉化效率和胴體質量是我國急需研究解決的重大問題。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)屬于分子間羧化轉移家族成員。乙酰輔酶A羧化酶有兩種同型物乙酰輔酶A羧化酶a(ACCcc)和乙酰輔酶A羧化酶P(ACC(3)。ACC可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪合成的限速調節酶。丙二酸單酰輔酶A作為長鏈脂肪酸合成的前體,在脂肪酸的合成中作為2碳單位的供體，并目.在脂肪酸的氧化中作為線粒體穿梭系統的調節因子，同時還可以作為一種信號分子通過調節下丘腦來對攝食和能量平衡進行調控。在哺乳動物中，對兩種類型的ACC基因的功能已經有了較為深入地研究。ACCcx與ACC(3分別位于胞質和線粒體膜上，由他們催化產生的丙二酸單酰輔酶A位于兩個相對獨立的區域，不會混合。位于胞質中的丙二酸單酰輔酶A用于進行脂肪酸的從頭合成，而位于線粒體附近的丙二酸單酰輔酶A則調節肉毒堿棕櫚酰轉移酶I的活性，從而調控對脂肪酸的氧化(Abu-Elheiga，2005)。因此，脂肪酸的合成與氧化過程不是同時發生的。在鳥類和哺乳動物的脂肪合成組織中，ACCcx基因的轉錄水平受營養和激素雙重調節。處于饑餓狀態的雞其肝臟中ACCa的轉錄水平是很低的，而當飼喂高碳水化合物、低脂肪的飼料時ACCa基因的轉錄水平能夠提高11倍(Hillgartner等，1996)。體外培養原代雞胚肝細胞時，加入激活型T3(三碘甲腺原氨酸)，能夠使ACCot基因的轉錄效率提高5-7倍(Zhang等，2001)。Mooney等(2008)在研究山羊豆堿為什么會導致小鼠體重減少時發現，其主要途徑為山羊豆堿能抑制ACC的活性，ACCot與ACC(3的活性降低能使脂肪合成減少，同時脂肪酸氧化加快，從而影響小鼠的體重性狀。Liang等人(2006)的研究表明，ACCoc在脂肪代謝中具有重要的作用，ACQx功能異常可以導致肥胖、II型糖尿病等疾病，將ACCct作為藥物的靶基因治療肥胖等相關疾病有著重要意義。Abu-Elheiga等(2005)指出敲除大鼠ACCa基因后，大鼠產生胚胎致死現象，可以看出ACC(x對胚胎的早期發育非常重要。Takai等人(1987)在雞的肝臟組織中分離出ACCa。ACCcc基因位于雞19號染色體，CDS全長6974bp，DNA序列由50個外顯子和49個內含子組成，全長92409bp，編碼2324個氨基酸。雞、小鼠、人的ACCa的氨基酸序列非常相似,其同源性約為90y。。在哺乳動物中，ACCa基因主要在肝臟和脂肪組織中表達。本課題組的研究表明ACCa基因在雞腹脂、肝臟、脾臟、腺胃、肌胃中均有表達。
發明內容本發明的目的在于提供一種分子生物學技術，即采用PCR-RFLP的方法檢測雞ACCa基因外顯子19中G—A變異位點，操作簡單、費用低、精確度高，可進行快速檢測的一種用ACCa基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法。本發明的目的是這樣實現的1、根據雞ACCot基因序列設計一對引物G2292AF和G2292AR,其中下游引物3'端最后一個堿基G為人為設計堿基(不與基因組序列配對)，目的是為了在突變堿基附近產生一個強制性酶切位點G2292AF:5'-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA-3'G2292AR:5'-CCCCATCCTCCACCACATG-3，2、禾U用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增片段長度為186bp;3、利用限制性內切酶MwoI消化擴增的PCR產物；4、使用質量比14。/。的聚丙烯酰胺凝膠對消化后的PCR產物進行電泳分離，檢測出ACCcx基因外顯子19屮的G—A單堿基突變；—5、當雞ACCa基因外顯子19中變異位點為堿基G時，會產生限制性內切酶MwoI的酶切位點(GCTTATC/CAGC)，MwoI消化PCR產物后會產生2個片段(165bp、21bp)，將其命名為GG基因型；該位點為堿基A時(GCTTATCCAAC)，則不存在MwoI酶切位點，MwoI消化PCR產物后產牛1個片段(186bp)，將其命名為AA基因型；該位點為G/A雜合時，MwoI消化PCR產物后會產生3個片段(186bp、165bp、21bp)，將其命名為AG基因型(其中酶切后產生的21bp片段跑出凝膠，膠圖中未顯示該片段，利用186bp、165bp兩條片段對該突變位點分型不影響結果)。本發明還包括這樣一些技術特征1、所述的分析基因多態性的方法是通過檢測堿基的突變而分類的基因型。2、所述的用丁-分析基因多態性的部位是外顯子。3、所述的用于分析基因多態性的部位是由G2292AF和G2292AR表示的引物擴增的外顯子區。4、所述的用于分析多態性的位點選自雞ACQx基因如下序列中第464位的G—A的堿基突變。5、所述的雞腹脂量指的是雞的腹脂重和腹脂率。6、所述的用于消化PCR產物的限制性內切酶是MwoI。7、所述的PCR-RFLP分析中的聚丙烯酰胺凝膠質量比濃度為14%。本發明設計了一對強制性酶切位點的引物，采用PCR-RFLP的方法檢測雞ACCa基因外顯子19中G—A變異位點，操作簡單、費用低、精確度高，可進行快速檢測。本發明根據雞ACCa基因序列設計一對引物；利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增，并利用限制性內切酶MwoI消化擴增的PCR產物，然后使用14%的聚丙烯酰胺凝膠對消化后的PCR產物進行電泳分離，檢測出ACCa基因外顯子19屮一個G—A的單堿基變異位點；分別對雞ACQx基因該位點兩種純合型及雜合型進行命名。7周齡實驗結果表明具有AA基因型個體的腹脂重和腹脂率分別比GG基因型個體腹脂重和腹脂率高6.03克和0.25%。利用本發明的分子標記方法對雞腹脂性狀進行選擇，不僅為雞育種工作中標記輔助選擇提供了一個更為有效、簡便易行的分子標記方法，同時也為雞的腹脂性狀改良提供了一種有效的分了標記育種手段，從而可以加速低脂肉雞的育種進程。實驗證明具有AA基因型個體的腹脂重和腹脂率極顯著高于具有GG基因型雞的腹脂重和腹脂率(PO.Ol)。在本發明所研究的群體中，具有AA基因型個休的腹脂重比GG基因型個體的腹脂重高6.03克；具有AA基因型個體的腹脂率比GG基因型個體的腹脂率高0.25%。(四)圖1是ACQx基因G2292A酶切位點分析圖譜。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的描述一、實驗材料1.實驗動物和性狀測定東北農業大學高、低脂系第八世代、第九世代、第十世代、第十一IU;代資源群體，分別選取了374、362、624和477只雞；7周齡時翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱量活重之后屠宰，稱量屠體重、腹脂重等性狀。2.藥品和酶三羥甲基氨基甲垸(Tris)，SigmaChemicaLsCo;Tris飽和酚，北京鼎國生物技術發展中心；蛋白酶K(ProteinaseK)，MMERCKCo;DL2000、dNTP(dATP;dTTP;dCTP;dGTP)、Taq酶，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，原平皓公司。3.主要儀器PTC-200PCR儀(PERKINELMER)、Biometra梯度PCR儀、UVP多功能成像系統、ULtrospec1000紫外分光光度計、BECKMAN冷凍離心機、MiLLi-Q超純水儀、DYY—IH2穩壓電泳儀及配套電泳槽。二、實驗方法1.緩沖液與常用試劑的配制lMTris'Cl:121.14gTris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。TE緩沖液10mMTris'Cl,lmMEDTA,pH8.0,高壓滅菌。20xSET緩沖液3MNaCl，1MTris'Cl(pH8.0),20mMEDTA(pH8.0),高壓滅菌。5xTBE緩沖液54gTris堿，27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。50x丁AE緩沖液242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA(pH8.0),加水至1L。lMTris'Cl:12U4gTris堿溶于800n]l雙蒸水中，用鹽酸調pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。0.5MEDTA:186.1gEDTA溶于800ml雙蒸水中，用NaOH調pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。3MNaAc(pH5.2):408.1gNaAc'3H20溶于800ml雙蒸水中，用冰乙酸調pH至7.0，定容至1000ml。200ml銀染液:NH3-H202ml;3.6%NaOH4.2ml;20%AgN033.6ml,加去離了水至200ml。200ml顯色液1%檸檬酸鈉lml;甲醛100ul;加去離于水至200ml。禽血裂解液10mMTris'Cl(pH8.0)，0.1MEDTA(pH8.0)，0.5%SDS。2.引物的設計與合成以下引物由上海博亞生物公司合成G2292AF:5'-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA陽3'G2292AR:5，-CCCCATCCTCCACCACATG-3'3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20^1抗凝血液，加入500W禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200"ig/ml，混勻55'C消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團塊。(2)將溶液冷卻至室溫，加入5MNaCl至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復顛倒離心管混勻lOmin。(3)12，000rpm，室溫離心10min。取上清，加等休積氯仿混勻10min。(4)12，000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。(5)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70%乙醇洗1次。(6)7,500rpm,室溫離心5min，棄上清。(7)將DNAT燥后(注意不能太干)溶于200WTE中。方法二(1)將全血加入裝有700WlxSET的1.5ml離心管中，輕輕混勻。(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200嗎1和10%的SDS至終濃度0.5%，55°C消化12h。(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個離心管中，棄去有機相。重復第三和第四步驟一次。(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24:23:1)，混合10min。12，000rpm.，離心10min，移出水相到另一個離心管。(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23:1)，來回顛倒混合10min，12，000rpm，離心10min，移出水相到另一個離心管。(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來冋顛倒，沉淀DNA。(8)將DNA挑ll',放到1.5ml離心管中，用70%乙醇洗1次。(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。(10)加入200pl的TE，置5(TC水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20"C備用。4.PCR反應(1)以雞DNA為模板進行PCR擴增，10uL反應體系中包含以下溶液或試劑1OxPCRreactionbuffer1|_iLdNTPMixture(各2.5mM)0.8(iL引物l(lOpM)O.ljaL引物2(10nM)O.ljiLEX-Taq(5U/pL)0.1pL去離子水6.9jliL;基因組DNA(50ng/|_iL)l.Oj^L(2)將上述溶液混合并按以下條件進行PCR反應。94。C變性7min;94。C30sec，56°C30sec，72。C30sec，33個循環;72。C延伸7min。(3)反應結束后，取PCR反應液GjiL)進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物，4"C保存。5.PCR-RFLP反應體系及條件酶切體系如下MwoI內切酶1OUZpL0.8pL10xBuffer:lpLPCRProduction0.8^加去離子水至10|iL將上述反應液混勻，于37'C水浴中消化4小時。6.聚丙烯酰胺凝膠分析以質量比濃度為14%、體積為25ml，厚度為O.lcm的膠為例。(1)清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8%瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。(2)在100ml燒杯內加入30%丙烯酰胺11.7ml，5xTBE5ml，10%過硫酸銨0.175ml，TEMED8pl，去離子水8.1ml，混勻后迅速灌膠。(3)當澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時停止灌膠，插入梳了，室溫聚和半小時，多余的丙烯酰胺4'C保存。隨時觀察凝膠聚合情況，并補加丙烯酰胺。(4)凝膠聚合好后，向電泳槽加入lxTBE，用注射器沖洗加樣孔。(5)預電泳10min，同時準備點樣。(6)取lOpl酶消化產物置于PCR管中，加5-6pl非變性上樣Buffer混勻，用微量注射器點樣。(7)180伏，電泳3-4h。7.硝酸銀染色方法(1)電泳結束后關上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。(2)雙蒸水洗膠2遍，每次2min，去除殘留乙醇。(3)用200ml染色液染色30min。(4)雙蒸水洗膠3遍，每次2min。(5)用200ml顯色液顯色，約10-30min，當DNA帶的強度合適時，倒掉顯色液。(6)去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。8.統計模型建立根據資源群體的特點構建合適統訃模型①Y，+G+L+GE+G*L+G*GE+F(L)+D(F,L)+BW7+eY為性狀觀察值，p為群體均值，G為基因型固定效應，L為品系固定效應，GE為世代效應，G*L為基因型與品系的互作效應，G*GE基因型與世代的互作效應，F(L)為品系內家系的隨機效應，D(F,L)為家系與品系內母雞的隨機效應，BW7作為協方差變量，e為剩余值。使用統計軟件JMP4.0(SASInstituteInc.,Cary，NC)檢驗基因型與性狀間的相關程度，并估計性狀的最小二乘均值。三、實驗結論J雞ACQx基因的多態性與肉雞高、低脂雙向選擇品系第八、九、卜、十一共四個世代的合并世代(以下簡稱"合并世代")腹脂性狀的相關結合圖1，利用本發明的引物(G2292AF和G2292AF)對肉雞高、低脂雙向選擇品系雞只的基因組DNA進行PCR擴增，并利用MwoI限制性內切酶消化PCR產物，然后進行體積比14%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。共檢測到3種基因型，當雞ACOx基因外顯子19中變異位點為堿基G時，會產生限制性內切酶MwoI的酶切位點(GCTTATC/CAGC)，MwoI消化PCR產物后會產生2個片段(165bp、21bp)，將其命名為GG基因型；該位點為堿基A吋(GCTTATCCAAC)，則不存在MwoI酶切位點，MwoI消化PCR產物后產生1個片段(186bp)，將其命名為AA基因型；該位點為G/A雜合時，MwoI消化PCR產物后會產生3個片段(186bp、165bp、21bp)，將其命名為AG基因型(其中酶切后產生的21bp片段跑出凝膠，膠圖中未顯示該片段，利用186bp、165bp兩條片段對該突變位點分型不影響結果)。對ACCcx基因G2292A位點產生的3種基因型與合并世代1837個個體的腹脂重和腹脂率進行最小二乘分析，結果表明基因型對雞的腹脂重、腹脂率有極顯著影響(P<0.01)(表1)。表1合并世代腹脂性狀的最小-二乘分析結果(P值)腹脂重腹脂率基因型O.0001<0細1品系O.0001<0扁1世代O細l<0細1基因型與品系互作O.0001<0扁1基因型與世代互作O細l0扁1家系l細O1.0000母雞0.99860.9957體重(協變量)<0細1<0細1對3種基R型間合并世代雞只腹脂性狀的最小二乘均值進行多重比較，結果表明AA基因型個體的腹脂重和腹脂率極顯著高于AG型和GG型個體的腹脂重和腹脂率(PO.01);AA基因型個體的腹脂重和腹脂率比AG基因型個體的腹脂重和腹脂率分別高3.88克和0.14%;AA基因型個體的腹脂重和腹脂率比GG基因型個體的腹脂重和腹脂率分別高6.03克禾口0.25%(表2)。表2ACCa基因不同基因型對合并世代雞只腹脂性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>均值比較時同--列無相同字母者差異極顯著(A-Bp<0.01)a:加性效應，a=(GG-AA)/2d:顯性效應，d=AG-(AA+GG)/2D:顯性度D=d/a權利要求1、一種用ACCα基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征在于(1)根據雞ACCα基因序列設計一對引物，其中下游引物3’端最后一個堿基G為人為設計堿基，不與基因組序列配對G2292AF5’-TAGGTGGATGGTTGGGCTTGA-3’G2292AR5’-CCCCATCCTCCACCACATG-3’；(2)利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增；(3)利用限制性內切酶消化擴增的PCR產物；(4)使用聚丙烯酰胺凝膠對PCR產物進行電泳分離，檢測出ACCα基因外顯子19中1個G→A的單堿基突異位點；(5)當雞ACCα基因外顯子19中多態性位點為堿基G時，會產生限制性內切酶MwoI的酶切位點GCTTATC/CAGC，MwoI消化PCR產物后會產生2個片段165bp、21bp，將其命名為GG基因型；該位點為堿基A時GCTTATCCAAC，則不存在MwoI酶切位點，MwoI消化PCR產物后產生1個片段186bp，將其命名為AA基因型；該位點為G/A雜合時，MwoI消化PCR產物后會產生3個片段186bp、165bp、21bp，將其命名為AG基因型。2、根據權利要求1所述的一種用ACCa基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是所述的分析基因多態性的方法是通過檢測單堿基的突變而確定基因型。3、根據權利要求2所述的預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是所述的PCR擴增片段長度為186bp。4、根據權利要求3所述的一種用ACCct基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是所述的用于分析基因多態性的部位是由G2292AF和G2292AR表示的引物擴增的外顯子區。5、根據權利要求4所述的一種用ACCa基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是所述的用于分析多態性的位點選自雞ACCa基因如下序列中第464位的G—A的堿基突變6、根據權利要求l-5所述的一種用ACCa基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中雞腹脂量是雞的腹脂重和腹脂率。7、根據權利要求1-5所述的一種用ACOx基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于消化PCR產物的限制性內切酶是MwoI。8、根據權利要求l-5所述的一種用ACCa基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝膠質量比濃度為14%。9、根據權利要求6所述的一種用ACC(x基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝膠質量比濃度為14%。全文摘要本發明提供了一種用ACCα基因預示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法。根據雞ACCα基因序列設計一對引物；利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增，并利用限制性內切酶MwoI消化擴增的PCR產物。7周齡實驗結果表明具有AA基因型個體的腹脂重和腹脂率分別比GG基因型個體腹脂重和腹脂率高6.03克和0.25％。本發明操作簡單、費用低、精確度高，可進行快速檢測。利用本發明的分子標記方法對雞腹脂性狀進行選擇，不僅為雞育種工作中標記輔助選擇提供了一個更為有效、簡便易行的分子標記方法，同時也為雞的腹脂性狀改良提供了一種有效的分子標記育種手段，從而可以加速低脂肉雞的育種進程。文檔編號C12Q1/68GK101603086SQ20091007157公開日2009年12月16日申請日期2009年3月18日優先權日2009年3月18日發明者輝李,田建偉申請人:東北農業大學