專利名稱：利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速、高密度的培養曱烷氧化細菌生產曱烷氧化 菌素的方法。
背景技術：
曱烷氧化細菌是自然界中一類能夠以曱烷為唯一碳源和能源進行 生長的特殊的微生物。曱烷氧化細菌的典型特征是含有曱烷單加氧酶。曱烷氧化 細菌首先通過曱烷單加氧酶催化將甲烷氧化為曱醇，生成的曱醇可進一步氧化為 甲醛，曱醛再轉化為細胞生物物質或深度氧化為曱酸，最后經過曱酸脫氫酶催化 的反應生成二氧化碳，曱烷氧化細菌在此過程中獲得生長所需的碳骨架和能量。銅在曱烷氧化細菌中扮演著重要的生物學角色。曱烷氧化細菌的生長和曱烷 單加氧酶的合成都受到銅的調節，同時銅還參與了曱烷單加氧酶活性中心和內膜 系統的構建。甲烷氧化細菌能夠分泌對銅具有強親和力的曱烷氧化菌素捕捉周圍 環境中的銅，與銅結合的甲烷氧化菌素會被曱烷氧化細菌識別而重新回到細胞中 從而起到富集銅的作用。由于甲烷氧化菌素與銅結合后具有較強的超氧化物歧化酶活性，分子量小， 結構穩定，是非常有潛力的天然食品抗氧化劑資源。利用甲烷為碳源在低銅條件下發酵培養曱烷氧化細菌，使其向發酵介質中分 泌曱烷氧化菌素是獲得曱烷氧化菌素的主要途徑。然而， 一般情況下，由于曱烷在水溶液中的溶解度低，碳源不足導致曱烷氧 化細菌生長速度慢，發酵液中細胞密度低，細胞分泌到發酵液中的曱烷氧化菌素 的濃度也低。曱烷氧化的中間產物甲醇也可以作為甲烷氧化細菌的碳源和能源， 但曱烷氧化細菌對曱醇的耐受性差，直接添加體積百分含量為0.01% (v/v)的 液態曱醇就會導致曱烷氧化細菌迅速失活而無法生長。這些已成為限制曱烷氧化 菌素實際應用的瓶頸問題。因此，對甲烷氧化細菌進行快速、高密度培養來獲得曱烷氧化菌素具有著重 要的實用意義。
發明內容
本發明目的是提供一種工藝較為簡單、成本低廉、快速、高密度 的利用曱烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法。本發明目的是這樣實現的是在 常規培養曱烷氧化細菌的液體培養基中添加曱醇，在發酵液中獲得曱烷氧化菌 素。曱醇在液體培養基中的體積百分含量為0.01-1%。所使用的甲烷氧化細菌是 以曱醇蒸汽作為碳源首先對曱烷氧化細菌進行馴化培養，然后逐漸增加培養基液態曱醇濃度使其適應而得到的能耐受1%濃度曱醇的曱烷氧化細菌。在甲醇的體 積百分含量為0.01-1 %的液體培養基中培養甲烷氧化細菌過程中，釆用抽真空法 置換入曱烷-氧氣混合氣，對其進行曱烷-曱醇共培養，其中，曱烷和氧氣的體積比范圍為1:1-1:10。 5 、 一種利用曱烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法，其特 征在于權利要求1或權利要求2或權利要求3或權利要求4任一項所述方法培 養得到的曱烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的方法。為解決上述技術問題，本發明 采取以下技術方案 一種快速、高密度的培養曱烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的 方法，包括以下2個方面1、 以曱醇蒸汽作為碳源首先對甲烷氧化細菌進行馴化培養，然后逐漸增加 液態甲醇濃度使其適應，得到能耐受體積百分濃度為1%甲醇的甲烷氧化細菌。2、 在常規培養甲烷氧化細菌的液體培養基中添加甲醇，其它培養條件與常 規培養方法相同。用上述方法對曱烷氧化細菌進行培養時，只需將曱醇直接加入常規培養曱烷 氧化細菌的液體培養基中即可，其在培養基中的體積百分含量優選為0.01-1%。 此外，在上述的含甲醇液體培養基培養甲烷氧化細菌過程中，還要向所述液體培 養基中釆用抽真空法置換入曱烷-氧氣混合氣，對其進行甲烷-甲醇共培養，待發 酵液變黃后，可在發酵液中得到曱烷氧化菌素。本發明公開了一種快速、高密度培養甲烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的方 法。該方法是在釆用甲醇蒸汽對甲烷氧化細菌進行馴化使曱烷氧化細菌能耐受 1%濃度曱醇的的基礎上，在培養基中添加甲醇。在用本發明的方法對曱烷氧化細 菌進行培養時，甲醇在水中的高溶解度解決了碳源供應不足無法滿足細胞的大量 生長需要的問題。與常規培養方法相比，本發明的方法可以極大程度地提高甲烷 氧化細菌的生長細胞密度，且培養方法簡單，發酵液中曱烷氧化菌素含量高，其 有較高的工業化應用可行性。基于上述優點，本發明將在曱烷氧化菌素的工業應 用中發揮巨大作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對木發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式是在常規培養甲烷氧化細菌的液體培養基中添加甲醇，在發 酵液中獲得甲烷氧化菌素。甲醇在液體培養基中的體積百分含量為0.01-1%。所 使用的甲烷氧化細菌是以甲醇蒸汽作為碳源首先對甲烷氧化細菌進行馴化培養， 然后逐漸增加培養基液態甲醇濃度使其適應而得到的能耐受1%濃度曱醇的甲 烷氧化細菌。在甲醇的體積百分含量為0.01-1 %的液體培養基中培養甲烷氧化細 菌過程中，采用抽真空法置換入曱烷-氧氣混合氣，對其進行甲烷-甲醇共培養， 其中，曱烷和氧氣的體積比范圍為1:1-1:10。 5 、 一種利用曱烷氧化細菌生產甲 烷氧化菌素的方法，其特征在于權利要求1或權利要求2或權利要求3或權利 要求4任一項所述方法培養得到的甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度如無特 別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度， 所有培養基中的溶劑均為去離子水。無機鹽培養基成分如下(g/L) : NH3C1: 0.5; K2HP04: 0.49; KH2P04 7H20: 0. 40;MgS04 ■ 7H20: 0. 3; CaCl2 . 2H20: 0. 02; KN03: 1. 6; NaCl: 0. 3; FeS04 7H20: 0. 004;MnS04 ,H20: 0. 0004; ZnS04 . 7H20: 0. 00034; Na2Mo04 '2H20: 0. 00024; CuS04 .7H20:0. 00001; pH7. 0。
實施例l 、曱烷氧化細菌的甲醇馴化
以甲烷氧4匕細菌"/cAo《/7or/wz7 IMV 3011為例，具體過程如
下
曱醇馴化在一個內部中心固定有玻璃管的500毫升三角瓶中進行，將IO毫升曱醇添加到三角瓶中心的玻璃管內，玻璃管頂端的小孔允許甲醇蒸汽擴散出來，將150毫升無才幾鹽培養基添加到三角瓶中，甲烷氧化細菌i/^力y/o;f/i7W; "/c力o^wW咖IMV 3011接種量為5%。接種后每隔24小時采用抽真空法置換入新鮮的曱烷-氧氣(l:lO, V/V)混合氣，32攝氏度，300轉/分鐘搖床培養，培養72~96小時后取培養物7.5毫升接入新鮮的150毫升無機鹽培養基中繼續馴化培養。反復操作11次后開始逐漸向培養基中添加從0, 01 % ( V/V)到1 % ( V/V )的液態曱醇繼續馴化培養，培養過程中每隔24小時換入新鮮的混合氣。經過馴化后最終得到可以在含有l'/。甲醇的液體培養基中生長的曱基彎菌乂fr/c力os/;or/咖IMV 3011。
實施例2、本發明的甲烷氧化細菌培養方法與曱烷氧化細菌常規培養方法的
比較
對甲醇馴化后的曱烷氧化細菌#e^r/^/"M打/c力o^oW咖IMV 3011進行本發明培養方法與甲烷氧化細菌常規培養方法的培養效果比較，具體過程如下
1. 甲烷氧化細菌^fe^^oy/i7^ "/c力M/;o/7咖IMV 3011的常規培養用常規方法對曱烷氧化細菌#"Ay/oW/zM m'c力o^wW咖IMV 3011進行培
養，具體方法為
將曱烷氧化細菌vJfe^^/f^// ^ "/c力o"oW咖IMV 3011以5%接鐘量接種在含有100毫升無菌液體培養基的500毫升密閉的三角瓶中，采用抽真空法將空氣置換為曱烷-氧氣(1:10， V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉/分鐘進行培養，每隔24小時取樣，采用光密度法，在SP-756P型分光光度計上測定波長600納米處的光密度值，并采用抽真空法置換入新鮮的甲烷-氧氣(1: 10, V/V)的混合氣，在相同條件下繼續培養，培養96-120小時后中止培養。
甲烷氧化菌素定量測定采用Diaion HP-20大孔吸附樹脂層析后凍干稱重法。具體步驟如下將培養好的發酵液離心去除細胞，剩余介質以13000 xg二次離心20分鐘，上清液用Diaion HP-20大孔吸附樹脂層析，然后用體積比60%甲醇和4(^水的溶液洗提DiaionHP-20，洗提液進行真空冷凍干燥，得到甲烷氧化菌素固體。由于曱烷氧化菌素與銅結合后會變成黃色，在394-422nm處有最大吸收，也采用在該波長范圍內分光光度法進行定量測定。
2. 添加甲醇對甲坑氧化細菌ife^ yA^//7^ "/c力o^ or/V邁IMV 3011進行
培養將甲烷氧化細菌ife^r/os/zz^ "/c力o^or/咖IMV 3011以5%接鐘量接種在含有100毫升無菌液體培養基的500毫升密閉的三角瓶中，同時添加甲醇使其濃度達到0.2%,釆用抽真空法將空氣置換為曱烷-氧氣(l:10, V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉/分鐘進行培養，每隔24小時取樣進行細胞密度測定，采用抽真空法置換入新鮮的甲烷-氧氣(1:10， V/V)的混合氣并補加0. 2% (V/V)甲醇繼續，培養96~120小時后中止培養，進行曱烷氧化菌素含量測定，方法同上。
經甲醇蒸汽馴化的曱烷氧化細菌#e^Ar/os//2fW ^r/c力o"or/咖IMV 3011在甲烷和甲醇中共同培養的細胞的產量高于以甲烷單獨培養的細胞的產量，這主要是由于培養基中添加曱醇解決了曱烷在水中溶解度低導致的碳源供應不足，無法滿足細胞的大量生長需要的問題。用本方法培養120小時發酵液中甲烷氧化菌素含量為36. 8毫克/升。
結果如表1所示:
碳源培養120小時細胞密度 (毫克干細胞/毫升)培養120小時發酵液甲烷氧> (毫克/升)
曱醇+曱烷1. 5936. 8
甲烷0. 7417. 1
權利要求
1、一種利用甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法，其特征在于是在常規培養甲烷氧化細菌的液體培養基中添加甲醇，在發酵液中獲得甲烷氧化菌素。
2 、根據權利要求1所述的一種利用曱烷氧化細菌生產甲烷氧 化菌素的方法，其特征在于曱醇在液體培養基中的體積百分含量為 0.01-1 % 。
3 、根據權利要求1所述的一種利用曱烷氧化細菌生產曱烷氧 化菌素的方法，其特征在于所使用的曱烷氧化細菌是以曱醇蒸汽作 為碳源首先對曱烷氧化細菌進行馴化培養，然后逐漸增加培養基液態 甲醇濃度使其適應而得到的能耐受1 %濃度甲醇的曱烷氧化細菌。
4 、根據權利要求1或2所述的一種利用曱烷氧化細菌生產甲 烷氧化菌素的方法，其特征在于在甲醇的體積百分含量為0.01-1 %的液體培養基中培養甲烷氧化細菌過程中，采用抽真空法置換入曱 烷-氧氣混合氣，對其進行曱烷-曱醇共培養，其中，甲烷和氧氣的體 積比范圍為1:1-1:10。
5 、 一種利用曱烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法，其特征在 于權利要求1或權利要求2或權利要求3或權利要求4任一項所述 方法培養得到的曱烷氧化細菌生產曱烷氧化菌素的方法。
全文摘要
本發明涉及一種快速、高密度的培養甲烷氧化細菌生產甲烷氧化菌素的方法。其特點是是在常規培養甲烷氧化細菌的液體培養基中添加甲醇，在發酵液中獲得甲烷氧化菌素。甲醇在液體培養基中的體積百分含量為0.01-1％。所使用的甲烷氧化細菌是以甲醇蒸汽作為碳源首先對甲烷氧化細菌進行馴化培養，然后逐漸增加培養基液態甲醇濃度使其適應而得到的能耐受1％濃度甲醇的甲烷氧化細菌。在甲醇的體積百分含量為0.01-1％的液體培養基中培養甲烷氧化細菌過程中，采用抽真空法置換入甲烷-氧氣混合氣，對其進行甲烷-甲醇共培養，其中，甲烷和氧氣的體積比范圍為1∶1-1∶10。本發明的方法可以極大程度地提高甲烷氧化細菌的生長細胞密度，且培養方法簡單，發酵液中甲烷氧化菌素含量高，其有較高的工業化應用可行性。基于上述優點，本發明將在甲烷氧化菌素的工業應用中發揮巨大作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N9/08GK101519653SQ20091007172
公開日2009年9月2日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者周琦瓊, 靜 董, 辛嘉英 申請人:哈爾濱商業大學