專利名稱：一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高體細胞胚發育同步化的方法。
背景技術：
水曲柳(Frax/"w wa"A/zwn'c" i^p"屬木犀科白蠟樹屬，是我國東北重要的 珍貴硬闊樹種之一。其樹干通直，樹齡長，木材材質優良，紋理美觀，廣泛應 用于軍工、建筑、機械、航空、車輛、居室裝修、運動器械制造等方面。水曲 柳種子具有深休眠特性，利用傳統的種子繁殖苗木存在種子處理時間長、幼苗 成型慢，繁殖周期長等問題，很難在短時間內得到大量的、具有特定優良性狀 的水曲柳優質苗木。植物組織培養技術中的體細胞胚胎發育技術以其繁殖數量 大、繁殖速度快、后代遺傳性狀穩定等優點受到人們的青睞，水曲柳體細胞胚 胎發育技術為解決水曲柳種子匱乏和水曲柳優良品系種質保存的問題提供了 一個重要的方法和手段。
目前，水曲柳體細胞胚胎發育技術中存在嚴重的體細胞胚胎發育不同步 化，即體細胞胚發育階段不一致、體細胞胚大小差異很大，體細胞胚發育的一
致性差(小于7%),導致體細胞胚再生植株的存活率低(小于12%);而且存在利
用化學調控，導致體細胞胚后期發育不正常、體細胞胚畸形(高達75%)的問題， 無法實現水曲柳體細胞胚的工廠化和自動化生產，不能滿足大面積造林的需要。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有水曲柳體細胞胚胎發育技術中存在體細胞 胚胎發育不同步化，體細胞胚發育的一致性差，導致體細胞胚再生植株的存活 率低以及利用化學調控，導致體細胞胚畸形率高的問題，而提供的一種提高水 曲柳體細胞胚發育同步化的方法。
提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以下步驟實現 一、將水曲柳外
植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為22 30°C、濕度為60% 70% 的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、將球形體細胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為22 30。C、濕度為60% 70%、每20 30天更換新 鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養40 60天，得成熟體細胞胚；三、
將成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無菌的空培養皿中，在溫度為 22 30°C、濕度為60% 70%的自然光照條件下干燥10 30min，然后接種于 萌發培養基中，在溫度為22 3(TC、濕度為60°/。 70%、每天光照14 18h、 光照強度為1500 2000Lux、每20 30天更換新鮮萌發培養基的條件下培養 60 80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細胞胚發育同步化*,其中 步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L體細 胞胚誘導培養基中還包含400 700mg的酸水解絡蛋白、40000 70000mg的 蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-芐基氨基嘌呤和6000 7000mg 的瓊脂，pH值為5.8;步驟二中同步化調控培養基是以MS1/2培養基為基本 培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟三中萌發培養基是以MS1/2培養基為基本 培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg 的酸水解絡蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和6000 7000mg的瓊脂，pH值為 5.8。
本發明成本低、操作簡單，通過調節同步化調控培養基中的蔗糖濃度，可 調節培養基的滲透壓，進而實現對水曲柳體細胞胚同步化發育的物理調控，避 免了化學調控可能帶來的體細胞胚后期發育不正常、體細胞胚畸形的問題，使 體細胞胚畸形率降低到50%以下，體細胞胚發育的一致性達80%以上；本發 明采用的干燥可提高水曲柳體細胞胚再生植株的存活率，存活率高達64% 81%，并且干燥后的體細胞胚萌發后其植株抗性明顯增強，移栽到土壤介質中， 則90%以上均可成活，且后期生長幾乎不受影響。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以 下步驟實現 一、將水曲柳外植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為
22 30°C、濕度為60% 70%的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、 將球形體細胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為22 30°C、濕度為 60% 70%、每20 30天更換新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養40 60天，得成熟體細胞胚；三、將成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無
菌的空培養皿中，在溫度為22 30°C、濕度為60% 70%的自然光照條件下 干燥10 30min，然后接種于萌發培養基中，在溫度為22 3(TC、濕度為60% 70%、每天光照14 18h、光照強度為1500 2000Lux、每20 30天更換新鮮 萌發培養基的條件下培養60 80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體 細胞胚發育同步化；其中步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為 基本培養基，且每1L體細胞胚誘導培養基中還包含400 700mg的酸水解絡 蛋白、40000 70000mg的蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的 氨基嘌呤和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟二中同步化調控培養基 是以MSl/2培養基為基本培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟三中萌發培養基 是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解絡蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和 6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8。
本實施方式步驟一中是將水曲柳種胚上的胚根和胚軸切去后取單片子葉 做為水曲柳外植體。
本實施方式步驟一中MS1/2培養基為所有元素含量都減半的MS培養基。 本實施方式步驟一中體細胞胚誘導培養基經過12rC滅菌20min，自然冷卻。
本實施方式步驟二中通過調節同步化調控培養基中的蔗糖濃度，可調節培 養基的滲透壓，進而實現對水曲柳體細胞胚同步化發育的物理調控，體細胞胚 發育的一致性達80%以上，體細胞胚畸形率降低到50%以下。
本實施方式步驟三中干燥是在無菌的超凈工作臺上進行，且無菌空培養皿 中的直徑為9.5厘米，每個培養皿中放10 20個體細胞胚。
本實施方式歩驟三中干燥可提高水曲柳體細胞胚再生植株的存活率，存活 率高達64% 81%，并且干燥后的體細胞胚萌發后其植株抗性明顯增強，移栽 到土壤介質中，則90%以上均可成活，且后期生長幾乎不受影響。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同是步驟一中在溫度 為25°C、濕度為65%的無光照條件下培養。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二的不同是步驟二中在溫度
為25。C、濕度為65%、每25天更換新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培 養50天。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同是步驟三中在溫度
為25°C、濕度為65%的自然光照條件下干燥20min。其它步驟及參數與具體 實施方式三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同是步驟三中在溫度
為25。C、濕度為65%、每天光照16h、光照強度為1800Lux、每25天更換新 鮮萌發培養基的條件下培養75天。其它步驟及參數與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以 下步驟實現 一、將水曲柳外植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為
25°C、濕度為70%的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、將球形體細 胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為25t:、濕度為70%、每30天更換 新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養60天，得成熟體細胞胚；三、將 成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無菌的空培養皿中，在溫度為28°C、 濕度為60。/。的自然光照條件下干燥10min，然后接種于萌發培養基中，在溫度 為25。C、濕度為70%、每天光照16h、光照強度為2000Lux、每30天更換新 鮮萌發培養基的條件下培養70天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細 胞胚發育同步化；其中步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為基 本培養基，且每1L體細胞胚誘導培養基中還包含400 700mg的酸水解絡蛋 白、40000 70000mg的蔗糖、1.0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-節基氨 基嘌呤和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟二中同步化調控培養基是 以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟三中萌發培養基 是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解絡蛋白、0.01 0.()5mg的奈乙酸和 6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8。
本實施方式中體細胞胚發育的一致性達81%，體細胞胚畸形率為10%，水曲柳小植株的存活率達80.2%，將小植株移栽到土壤介質中92%可成活。
具體實施方式
七本實施方式提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以 下步驟實現 一、將水曲柳外植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為
25°C、濕度為70%的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、將球形體細 胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為25t:、濕度為60%、每30天更換 新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養60天，得成熟體細胞胚；三、將 成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無菌的空培養皿中，在溫度為25°C、 濕度為70n/。的自然光照條件下干燥30min，然后接種于萌發培養基中，在溫度 為25"、濕度為60%、每天光照16h、光照強度為2000Lux、每20天更換新 鮮萌發培養基的條件下培養70天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細 胞胚發育同步化；其中步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為基 本培養基，且每1L體細胞胚誘導培養基中還包含400 700mg的酸水解絡蛋 白、40000 70000mg的蔗糖、L0 1.5mg的奈乙酸、0.1 0.5mg的6-節基氨 基嘌呤和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟二中同步化調控培養基是 以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000 50000mg的蔗糖和6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8;步驟三中萌發培養基 是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000 25000mg的蔗糖、100 200mg的酸水解絡蛋白、0.01 0.05mg的奈乙酸和 6000 7000mg的瓊脂，pH值為5.8。
本實施方式中體細胞胚發育的一致性達85%,體細胞胚畸形率為15%， 水曲柳小植株的存活率達70%，將小植株移栽到土壤介質中90%可成活。
權利要求
1、一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法，其特征在于提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法按以下步驟實現一、將水曲柳外植體接種于體細胞胚誘導培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％的無光照條件下培養至得到球形體細胞胚；二、將球形體細胞胚接種于同步化調控培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％、每20～30天更換新鮮同步化調控培養基的無光照條件下培養40～60天，得成熟體細胞胚；三、將成熟體細胞胚從外植體上剝離出來后置于無菌的空培養皿中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％的自然光照條件下干燥10～30min，然后接種于萌發培養基中，在溫度為22～30℃、濕度為60％～70％、每天光照14～18h、光照強度為1500～2000Lux、每20～30天更換新鮮萌發培養基的條件下培養60～80天，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細胞胚發育同步化；其中步驟一中體細胞胚誘導培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L體細胞胚誘導培養基中還包含400～700mg的酸水解絡蛋白、40000～70000mg的蔗糖、1.0～1.5mg的奈乙酸、0.1～0.5mg的6-芐基氨基嘌呤和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8；步驟二中同步化調控培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L同步化調控培養基中還包含20000～50000mg的蔗糖和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8；步驟三中萌發培養基是以MS1/2培養基為基本培養基，且每1L萌發培養基中還包含20000～25000mg的蔗糖、100～200mg的酸水解絡蛋白、0.01～0.05mg的奈乙酸和6000～7000mg的瓊脂，pH值為5.8。
2、 根據權利要求1所述的一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法， 其特征在于步驟一中在溫度為25°C、濕度為65%的無光照條件下培養。
3、 根據權利要求2所述的一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法， 其特征在于步驟二中在溫度為25。C、濕度為65%、每25天更換新鮮同步化調 控培養基的無光照條件下培養50天。
4、 根據權利要求3所述的一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法， 其特征在于步驟三中在溫度為25°C、濕度為65%的自然光照條件下干燥 20min。
5、根據權利要求4所述的一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法，其特征在于步驟三中在溫度為25°C、濕度為65%、每天光照16h、光照強度為 1800Lux、每25天更換新鮮萌發培養基的條件下培養75天。
全文摘要
一種提高水曲柳體細胞胚發育同步化的方法，它涉及一種提高體細胞胚發育同步化的方法。它解決了現有水曲柳體細胞胚胎發育技術中存在體細胞胚胎發育不同步化，體細胞胚發育的一致性差，導致體細胞胚再生植株的存活率低以及利用化學調控，導致體細胞胚畸形率高的問題。方法一、外植體接種于體細胞胚誘導培養基中培養，得球形體細胞胚；二、球形體細胞胚接種于同步化調控培養基中培養，得成熟體細胞胚；三、成熟體細胞胚干燥后接種于萌發培養基中培養，得水曲柳小植株，即完成提高水曲柳體細胞胚發育同步化。本發明實現了對水曲柳體細胞胚同步化發育的物理調控，使體細胞胚畸形率降低到50％以下，體細胞胚發育的一致性達80％以上，存活率高達64％～81％。
文檔編號C12N5/04GK101503671SQ20091007155
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月16日 優先權日2009年3月16日
發明者宇 張, 玲 楊, 沈海龍 申請人:東北林業大學;沈海龍;楊 玲