專利名稱：檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒及檢測馬鈴薯類病毒的dna探針和探針序列①的制備方法
技術領域：
本發明檢測類病毒的試劑盒及檢測用DNA探針和探針序列的制備方法。
背景技術：
中國現有的馬鈴薯類病毒(PSTVd)檢測技術主要有兩種一種是R-PAGE方法(往 返雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法)，這種方法存在檢出靈敏度較低，操作比較復雜需要專業人 員進行實驗室檢測的缺陷；另一種為RT-PCR法，這種方法存在檢測成本高的問題。另外現 有檢測馬鈴薯類病毒所用的DNA探針皆為單體探針或者片段探針，這類DNA探針也造成了 檢測靈敏度低的缺陷。
發明內容
本發明是為了解決現有馬鈴薯類病毒檢測技術存在檢出靈敏度較低，操作比較復 雜需要專業人員進行實驗室檢測的缺陷，以及現有檢測馬鈴薯類病毒所用的DNA探針造成 了檢測靈敏度低的缺陷，而提供檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒及檢測馬鈴薯類病毒的DNA探 針和探針序列①的制備方法。 本發明檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒按照體積份數由1份的溶液I、l份的溶液VI、1份 的溶液VII、 1份的溶液VIII、 1份的溶液IX、 1份的溶液XI、 1份的溶液XII、 1份的溶液XIII和 1份的溶液X IV組成；其中溶液I由氯化鈉和檸檬酸三鈉混合溶液制成，溶液I中氯化鈉濃度 為3mol/L、檸檬酸三鈉濃度為0. 3mol/L，其pH值為7. 0 ;溶液VI中鮭魚精DNA的濃度為10mg/ mL ;溶液VII為溶液V與溶液IV按照體積比101 : 1比例混合組成的；每lOmL的溶液V由5mL 的甲酰胺、3. 5mL質量濃度為20%的十二烷基磺酸鈉溶液、0. 5mL的溶液II、0. 5mL的溶液III和 余量的NaCl濃度為5mol/L的水溶液組成；溶液II中N^HPC^的濃度為0. 684mol/L， NaH2P04的 濃度為0. 316mol/L ;溶液III中聚蔗糖-400的質量濃度為2%，聚乙烯吡咯烷酮-360的質量 濃度為2%， N， 0-雙三甲硅基乙酰胺的質量濃度為2% ;每40mL的溶液VII是由4mL的溶液I， 0. 4mL的質量濃度為10%十二烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；每40mL的溶液VI11由O. 2mL的 溶液I，O. 4mL的質量濃度為10%十二烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；溶液IX中順丁烯二酸 的濃度為0. lmol/L、NaCl的濃度為0. 15mol/L， pH值為7. 5 ;溶液X I中按照體積百分數由2% 的脫脂牛奶、2%的聚乙二醇辛基苯基醚和96X的溶液X組成；每100mL的溶液X由Tris-HCl 濃度為10mmol/L的溶液lmL， NaCl濃度為150mmol/L的溶液3mL， 50 ii L的TWeen-20和余量的 水組成；溶液X II是將0. 5 ii L的用地高辛標記的高氯酸銨溶于10mL溶液X I中配制而成的； 溶液XIII中Tris-HCl的濃度為0. lmol/L， NaCl的濃度為0. lmol/L， pH值為9. 5 ;溶液X IV是 將10 ii L CDP-Star溶于lmL的溶液XIII配制而成的。
檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針；雙體探針具有以下序列之一
①、TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCT
GCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGA
GGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGGGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAGGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGGGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGTGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAAGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGAGCTC ;②、序列①中的20% 35X的"T"被標記的Dig-dUTP隨機取代，且具有與序列①相同的馬鈴薯類病毒DNA探針功能； ③、序列①中50個以內堿基被隨機取代，且具有與序列①相同的馬鈴薯類病毒 DNA探針功能。 本發明檢測馬鈴薯類病毒的探針序列①的制備是按以下方法制備的一、以 PSTVd陽性樣品提取的總核酸為模板，以5 ' -GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3 '為正 向引物、以5 ' -GAGCTCCCGGGAAACCTGGAGCGAACTGG-3 '為反向引物進行RT-PCR擴增；二 、 將步驟一的擴增產物回收后連接到pGM-T載體中，然后利用BamHI/Sac I雙酶切鑒定插 入情況，將陽性重組載體命名為pGM-T-PSTVcH^ ;三、以含有PSTVd的陽性馬鈴薯樣品進 行提取的總核酸，以提取產物為模板，以5 ' -TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3 '為 正向引物、以5 ' -GGATCCCCCGGGAAACCTGGAGCGAAC-3 '為反向引物進行RT-PCR擴增，產 物回收后連接到pGM-T載體中，進行Xba I/BamHI雙酶切鑒定，篩選反向插入的陽性克 隆并命名為pGM-T-PSTVd-M2 ;四、用BamH I/SacI雙酶切pGM-T-PSTVd_M2重組質粒，將 特異的酶切片段連接到BamHI/Sac I雙酶切的pGM-T-PSTVd-Mi載體上，構建PSTVd雙 體載體；五、通過Xba I/Sac I雙酶切鑒定篩選PSTVd雙體載體，陽性重組載體命名為 pGM-T-PSTVd-Md ;六、根據插入類病毒雙體的pGM-T-PSTVd-Md載體兩側的序列設計正向引 物5 ' -GCCGCGGGAATTCGAT-3 '和反向引物5 ' -TCCAACGCGTTGGGAGC-3 '，利用D i g-dUTP 為標記物，進行PCR擴增；即得到檢測馬鈴薯類病毒的雙體探針。
本發明的試劑盒具有以下優點1、操作簡單；2、靈敏度高，可以達到0. 05pg。
本發明檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針具有以下優點利用PCR技術，以地高辛標記 制備的PSTVd雙體cDNA探針，通過化學發光反應，進行結果判讀，其檢測靈敏度最高，可以 達到0. 05pg，是同等條件下單體探針檢測靈敏度的100倍，是片段探針檢測靈敏度的1000 倍，所制備雙體探針檢測靈敏度是Salazar等報道檢測靈敏度的500倍。
圖1為具體實施方式
十六的探針檢測馬鈴薯類病毒的結果圖，其中1代表靈敏度為5ng， 2代表靈敏度為500pg， 3代表靈敏度為50pg， 4代表靈敏度為5pg， 5代表靈敏度為 0. 5pg，6代表靈敏度為0. 05pg，7代表靈敏度為0. 005pg ;圖2為現有單體探針檢測馬鈴薯 類病毒的結果圖，其中1代表靈敏度為5ng，2代表靈敏度為500pg，3代表靈敏度為50pg ; 圖3為現有片段探針檢測馬鈴薯類病毒的結果圖，其中1代表靈敏度為5ng，2代表靈敏度 為500pg， 3代表靈敏度為50pg。
具體實施例方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一 本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒按照體積份數由1份的 溶液I 、 1份的溶液VI 、 1份的溶液VII 、 1份的溶液VI11 、 1份的溶液IX、 1份的溶液XI 、 1份 的溶液XII、 1份的溶液XIII和1份的溶液XIV組成；其中溶液I由氯化鈉和檸檬酸三鈉混 合溶液制成，溶液I中氯化鈉濃度為3mol/L、檸檬酸三鈉濃度為0. 3mol/L，其pH值為7. 0 ; 溶液VI中鮭魚精DNA的濃度為10mg/mL ;溶液VII為溶液V與溶液IV按照體積比101 : 1 比例混合組成的；每10mL的溶液V由5mL的甲酰胺、3. 5mL質量濃度為20%的十二烷基磺 酸鈉溶液、0. 5mL的溶液11、0. 5mL的溶液III和余量的NaCl濃度為5mol/L的水溶液組成； 溶液II中Na2HP04的濃度為0. 684mol/L， NaH2P04的濃度為0. 316mol/L ;溶液III中聚蔗 糖-400的質量濃度為2%，聚乙烯吡咯烷酮-360的質量濃度為2%，N，0-雙三甲硅基乙酰 胺的質量濃度為2X;每40mL的溶液VII是由4mL的溶液I，O. 4mL的質量濃度為10%十二 烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；每40mL的溶液VIII由0. 2mL的溶液I，O. 4mL的質量濃 度為10%十二烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；溶液IX中順丁烯二酸的濃度為0. lmo1/ L、 NaCl的濃度為0. 15mol/L， pH值為7. 5 ;溶液X I中按照體積百分數由2%的脫脂牛奶、 2%的聚乙二醇辛基苯基醚和96X的溶液X組成；每100mL的溶液X由Tris-HCl濃度為 10mmol/L的溶液lmL， NaCl濃度為150mmol/L的溶液3mL， 50 ii L的TWeen-20和余量的水 組成；溶液X II是將0. 5 ii L的用地高辛標記的高氯酸銨溶于10mL溶液X I中配制而成 的；溶液X III中Tris-HCl的濃度為0. lmol/L， NaCl的濃度為0. lmol/L， pH值為9. 5 ;溶 液XIV是將10 ii L CDP-Star溶于lmL的溶液XIII配制而成的。 本實施方式鮭魚精DNA的配制方法為稱取鮭魚精DNA 200mg置于50ml燒杯中， 加入20ml的TE Buffer混合均勻。
具體實施方式
二 本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針；雙體探 針具有以下序列之一①、TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCT
GCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGA
GGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAA
GAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGG
GTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGGGTGGTCCTGCGG
GCGCGAGGAAGGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCG
GCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGC
CAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGGGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCC
GCCTTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAAC
CACGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACC
CTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCT
TCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCG
AGGTGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAAGACACCCGAAGAAAGGAAGG
GTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCT
CCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGAGCTC ; ②、序列①中的20% 35X的"T"被標記的Dig-dUTP隨機取代，且具有與序列① 相同的馬鈴薯類病毒DNA探針功能； ③、序列①中50個以內堿基被隨機取代，且具有與序列①相同的馬鈴薯類病毒 DNA探針功能。
具體實施方式
四本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針；雙體探 針具有以下序列①、TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCT
GCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCC
GAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCA
AAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACC
GGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGGGTGGTCCTGC
GGGCGCGAGGAAGGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTT
TCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTAT
TGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGGGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGA
GCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGG
AACCACGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAAC
ACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGA
GCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGG
GCGAGGTGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAAGACACCCGAAGAAAGGA
AGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGC
GCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGAGCTC 。
具體實施方式
五本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針，探針序 列中的20% 35%的"T"被標記的Dig-dUTP隨機取代，且具有與具體實施方式
四中的序 列①相同的馬鈴薯類病毒DNA探針功能。
具體實施方式
六本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針，探針序 列中50個以內堿基被隨機取代，且具有與具體實施方式
四中的序列①相同的馬鈴薯類病 毒DNA探針功能。
具體實施方式
七本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法 是按以下方法制備的一、以PSTVd陽性樣品提取的總核酸為模板，以5' -GGATCCCTGAA GCGCTCCTCCGAGCCG-3 '為正向引物、以5 ' -GAGCTCCCGGGAAACCTGGAGCGAACTGG—3 '為反 向引物進行RT-PCR擴增；二、將步驟一的擴增產物回收后連接到pGM-T載體中，然后利 用BamHI/Sac I雙酶切鑒定插入情況，將陽性重組載體命名為pGM-T-PSTVcH^ ;三、以5'-TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3'為正向引物、以5' -GGATCCCCCGGGAAACCTGGA GCGAAC-3 '為反向引物進行RT-PCR擴增，產物回收后連接到pGM-T載體中，進行XbaI/ BamHI雙酶切鑒定，篩選反向插入的陽性克隆并命名為pGM-T-PSTVd_M2 ;四、用BamHI/ Sacl雙酶切pGM-T-PSTVd-M2重組質粒，將特異的酶切片段連接到BamHI/Sac I雙酶切 的pGM-T-PSTVd-Mi載體上，構建PSTVd雙體載體；五、通過Xbal/Sac I雙酶切鑒定篩 選PSTVd雙體載體，陽性重組載體命名為pGM-T-PSTVd-Md ;六、根據插入類病毒雙體的 pGM-T-PSTVd-Md載體兩側的序列設計正向引物5 ' -GCCGCGGGAATTCGAT-3 '和反向引物 5' -TCCAACGCGTTGGGAGC-3'，利用Dig-dUTP為標記物，進行PCR擴增；即得到檢測馬鈴薯 類病毒的雙體探針。其它與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟一中的20 L 的PCR反應體系由5 ii L的5 X RT-PCR Buf f er、 1 y L的MgCl2、 1 y L的dUTP、0. 75 y L的正向 引物、0. 75 ii L的反向引物、0. 1 ii L的RNA抑制劑、2 y L的RNA模版、1 P L的Taq酶以及余量 的重蒸餾水組成；擴增反應條件為反轉錄50°C 30min，預變性95t: 15min，變性94t: lmin、 退火55°C lmin、延伸72°C lmin共30個循環，延伸72°C 10min。其它步驟及參數與具體實 施方式七相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟二中的20 ii L 鑒定體系由lPL的lOXBuffer k、2 y L的含有N， 0-雙三甲硅基乙酰胺質量濃度為0. 1% 的溶液、0. 7 ii L的BamH I、0. 5 y L的Sac I、 15 y L的載體質粒(pGM-T-PSTVd-M》以及余量 的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電泳鑒定。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。 本實施方式中鑒定后的片段大小為364nt。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟三中的 20 ii L的PCR反應體系由5 ii L的5 X RT-PCR Buffer、1 ii L的MgCl2、l ii L的dUTP、 0. 75 ii L的正向引物、0. 75 ii L的反向引物、0. 1 y L的RNA抑制劑、2 y L的RNA模版、5 y L 的5Xsolution(Q)、liiL的Taq酶以及余量的重蒸餾水組成；擴增反應條件為反轉錄 50°C 30min，預變性95。C 15min，變性94。C lmin、退火55。C lmin、延伸72°C lmin共30個循 環，延伸72t: 10min。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
具體實施方式
i^一 本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟三中20 ii L 鑒定體系由liiL的lOXBuffer k、lyL的Xba 1、liiL的BamH 1、5yL的載體質粒 (pGM-T-PSTVd-M2)以及余量的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電 泳鑒定。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
本實施方式中鑒定后的片段大小為408bp。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟四中10 ii L 連接體系1 P L的pGM-T vector、 1 y L的10 X T4連接酶Buf f er、 1 y L的T4連接酶、1 y L的 特異的酶切片段以及余量的無菌去離子水組成；連接反應條件為16t:條件下，反應12h。其 它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟五中20 ii L 鑒定體系由2ii L的lOXBuffer k、lyL的Xba 1、lyL的Sac 1、5yL的載體質粒 (pGM-T-PSTVd-Md)以及余量的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電泳鑒定。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
本實施方式中鑒定后的片段大小為726bp。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
七的不同點是步驟六中的 20ii L的PCR反應體系由2ii L的10XPCR BF、1 ii L的MgCl2、l ii L的DIG_dUTP、0. 5 ii L的 正向引物、0. 5ii L的反向引物、1 ii L的pGM-T-PSTVd-Md、0. 5ii L的Taq酶以及余量的重蒸 餾水組成；擴增反應條件為預變性94°C 2min，變性94°C 30s、退火57°C 30s、延伸72°C 30s、 共30個循環，延伸72°C 10min。其它步驟及參數與具體實施方式
七相同。
具體實施方式
十六本實施方式檢測馬鈴薯類病毒的雙體探針的序列為 CAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGAGGA
ACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAA
AGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTA
GTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGGGTGGTCCTGCGGGCG
CGAGGAAGGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCG
GGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAG
TTCGCTCCAGGTTTCCCGGGGGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCC
TTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCAC
GAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTC
GCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCA
GTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAG
GTGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAAGACACCCGAAGAAAGGAAGGGT
GAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCC
CCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGAGCTC 。 用本實施方式制備的雙體探針對馬鈴薯類病毒進行檢測，檢測按照如下步驟進 行(1)尼龍膜處理A、用鉛筆在尼龍膜上劃1. 2cmX 1. 2cm方格；B、用無菌水浸泡5分鐘， 用溶液I浸泡30min干燥膜；C、探針變性探針在99°C ，變性5_10分鐘，立即放在冰中10分 鐘；D、樣品變性樣品在99t:，變性5 10分鐘；E、點樣、固定將3 4ii L樣品點在尼龍 膜方格中，點樣后的尼龍膜放在紫外交聯儀上正反面各交聯1分鐘，能量為1200 ; (2)預雜 交A、將固定后的尼龍膜放在三面封口的雜交袋中；B、加入68t:的溶液VI5mL，排除氣泡， 封口，放在68t:水浴震蕩雜交1.5小時；(3)雜交將雜交袋從水浴中取出，剪去一角并排 除雜交袋中的溶液VI，取溶液VI5mL加入變性探針(l-3iil/膜)，混勻，加入雜交袋中，封 口。放在68t:水浴震蕩雜交過夜；(4)洗膜A、剪開雜交袋，取出尼龍膜，放入裝有溶液VI1 的平皿中，在室溫下震蕩洗滌2次，每次5分鐘；B、將尼龍膜轉放入5(TC的溶液VIII中， 55t:水浴震蕩洗滌2次，每次15分鐘；C、將尼龍膜轉移到裝有20mL溶液IX的平皿中震蕩 洗滌5分鐘；(5)信號檢測，所有孵育過程都在15 25t:攪拌下進行A、在溶液IX中浸泡 5分鐘；B、在20 30mL溶液X I中孵育30分鐘；C、在10mL溶液X II中孵育30分鐘；D、 在20 30mL溶液IX中洗滌2次，每次15分鐘；E、在15mL溶液XIII中平衡2 5分鐘； F、將尼龍膜夾在兩層保鮮膜中間，將上層保鮮膜提起，沿尼龍膜的一邊加入新配置的溶液X IV0.5-lmL，然后緩緩放下保鮮膜，使溶液X IV均勻覆蓋膜表面。于室溫靜止5分鐘；G、用鑷子將保鮮膜輕輕提起，讓多余的溶液X IV流出，并用濾紙吸干膜外的溶液X IV，在暗室中 用X光片壓片進行暴光、顯影、定影共計15 30分鐘(以上檢測過程中所設計的溶液1、溶
液vi、溶液vii、溶液viii、溶液ix、溶液x 1、溶液x n、溶液x ni和溶液x iv溶液成分
同具體實施方式
一中相應的溶液成分，即使用具體實施方式
一訴述試劑盒進行檢測)。 定影如圖1所示，從圖1中可以看出本實施方式的檢測探針的靈敏度高， 從圖1與圖2(單體探針檢測)以及圖l與圖3(片段探針檢測)的對比看出， 本實施方式的雙體探針的靈敏度明顯高于現有技術。 序列表 〈110〉黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所 〈120〉檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒及檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針和探針序列①
的制備方
法 〈160>7 〈210>1 〈211>28 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根據以PSTVd類病毒陽性基因設計的正向引物。 〈400〉 1 ggatccctga agcgctcct ccgagccg 28 〈210>2〈211>29 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根據以PSTVd類病毒陽性基因設計的反向引物。 〈400>2 gagctcccgg gaaacctgga gcgaactgg 29 〈210>3 〈211>30 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉提取含有PSTVd的陽性馬鈴薯樣品總核酸所用的正向引物。 〈400>3 tctagatccc tgaagcgctc ctccgagccg 30 〈210>4 〈211>27
〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉提取含有PSTVd的陽性馬鈴薯樣品總核酸所用的反向引物。 〈400>4 ggatcccccg ggaaacctgg agcgaac 27 〈210>5 〈211>16 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根據插入類病毒雙體的pGM-T-PSTVd-Md載體兩側的序列設計正向引物。 〈400>5 gccgcgggaa ttcgat 16 〈210>6 〈211>17 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉根據插入類病毒雙體的pGM-T-PSTVd-Md載體兩側的序列設計反向引物。 〈400>6 tccaacgcgt tgggagc 17 〈210>7 〈211>726 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉用于檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①。 〈400>7 tctagatccc tgaagcgctc ctccgagccg ccttcttttt aggtgtg朋c cac3gg朋cc 3cgagttteg ttccgagg朋 te朋caccct cgccccg朋g c朋3g朋3g3 teg3g朋3朋 ttgtttctac cgggtagtag ccgaagcgac agcgcaaagg ggcgcgagga 3gg3cacccg朋g朋3gg朋gggtg朋朋c tcctgtcggc cgctgggcgc tccccaccgt ccttattgcc ggggatccct gaagcgctcc tccgagccgc cttctttttt ggtgtg朋cc 3C3gg朋cca cgagtttegt tccgagg朋c 3朋c3ccctc gccccg朋gc 3朋g朋3g3t 3g3g朋3朋g tgtttctacc gggtagtagc cgaagcgaca gcgcaaaggg
tcttttctgctcaggaggtc60
ccaactgcggttccaagggc120
gcggttctcgggagcttcag180
gggcg鄉ggtggtcctgcg240
cctgtttcggcggg朋ttec300
agttcgctccaggtttcccg360
cttttctgctcaggaggtca420
caactgcggttccaagggct■
cggttctcgggagcttcagt540
ggcg鄉tgtggtcctgcgg600
gcgcgagg朋3g3C3cccga 3g朋3gg朋g ggtg朋朋cc ctgtttcggc ggg朋ttect 660 cctgtcggcc gctgggcgct ccccaccgtc cttattgcca gttcgctcca ggtttcccgg 720 gagctc 72權利要求
一種檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒，其特征在于檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒按照體積份數由1份的溶液I、1份的溶液VI、1份的溶液VII、1份的溶液VIII、1份的溶液IX、1份的溶液XI、1份的溶液XII、1份的溶液XIII和1份的溶液X IV組成；其中溶液I由氯化鈉和檸檬酸三鈉混合溶液制成，溶液I中氯化鈉的濃度為3mol/L、檸檬酸三鈉的濃度為0.3mol/L，其pH值為7.0；溶液VI中鮭魚精DNA的濃度為10mg/mL；溶液VII為溶液V與溶液IV按照體積比101∶1比例混合組成的；每10mL的溶液V由5mL的甲酰胺、3.5mL質量濃度為20％的十二烷基磺酸鈉溶液、0.5mL的溶液II、0.5mL的溶液III和余量的NaCl濃度為5mol/L的水溶液組成；溶液II中Na2HPO4的濃度為0.684mol/L，NaH2PO4的濃度為0.316mol/L；溶液III中聚蔗糖-400的質量濃度為2％，聚乙烯吡咯烷酮-360的質量濃度為2％，N，O-雙三甲硅基乙酰胺的質量濃度為2％；每40mL的溶液VII是由4mL的溶液I，0.4mL的質量濃度為10％十二烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；每40mL的溶液VIII由0.2mL的溶液I，0.4mL的質量濃度為10％十二烷基磺酸鈉溶液和余量的水組成；溶液IX中順丁烯二酸的濃度為0.1mol/L、NaCl的濃度為0.15mol/L，pH值為7.5；溶液X I中按照體積百分數由2％的脫脂牛奶、2％的聚乙二醇辛基苯基醚和96％的溶液X組成；每100mL的溶液X由Tris-HCl濃度為10mmol/L的溶液1mL，NaCl濃度為150mmol/L的溶液3mL，50μL的TWeen-20和余量的水組成；溶液X II是將0.5μL的用地高辛標記的高氯酸銨溶于10mL溶液X I中配制而成的；溶液XIII中Tris-HCl的濃度為0.1mol/L，NaCl的濃度為0.1mol/L，pH值為9.5；溶液X IV是將10μL CDP-Star溶于1mL的溶液XIII配制而成的。
2. —種檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針，其特征在于檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針；雙體探針具有以下序列之一① 、TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGGGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAGGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGGGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCGCCTTCTTTTTTCTTTTCTGCTCAGGAGGTCAGGTGTGAACCACAGGAACCACGAGTTTAGTTCCGAGGAACCAACTGCGGTTCCAAGGGCTAAACACCCTCGCCCCGAAGCAAAGAAAGATAGAGAAAAAGCGGTTCTCGGGAGCTTCAGTTGTTTCTACCGGGTAGTAGCCGAAGCGACAGCGCAAAGGGGGCGAGGTGTGGTCCTGCGGGCGCGAGGAAAGACACCCGAAGAAAGGAAGGGTGAAAACCCTGTTTCGGCGGGAATTACTCCTGTCGGCCGCTGGGCGCTCCCCACCGTCCTTATTGCCAGTTCGCTCCAGGTTTCCCGGGAGCTC ;② 、序列①中的20% 35X的"T"被標記的Dig-dUTP隨機取代，且具有與序列①相同的馬鈴薯類病毒DNA探針功能；③ 、序列①中50個以內堿基被隨機取代，且具有與序列①相同的馬鈴薯類病毒DNA探針功能。
3. 權利要求2所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①是按以下方法制備的一、以PSTVd陽性樣品提取的總核酸為模板，以5' -GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3'為正向引物、以5' -GAGCTCCCGGGAAACCTGGAGCGAACTGG-3 '為反向引物進行RT-PCR擴增；二、將步驟一的擴增產物回收后連接到pGM-T載體中，然后利用BamHI/Sac I雙酶切鑒定插入情況，將陽性重組載體命名為pGM-T-PSTVcH^ ;三、以含有PSTVd的陽性馬鈴薯樣品進行提取的總核酸，以提取產物為模板，以5' -TCTAGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3'為正向引物、以5' -GGATCCCCCGGGAAACCTGGAGCGAAC-3'為反向引物進行RT-PCR擴增，產物回收后連接到pGM-T載體中，進行Xbal/BamHI雙酶切鑒定，篩選反向插入的陽性克隆并命名為pGM-T-PSTVd_M2 ;四、用BamHI/SacI雙酶切pGM-T-PSTVd_M2重組質粒，將特異的酶切片段連接到BamHI/Sac I雙酶切的pGM-T-PSTVd-Mi載體上，構建PSTVd雙體載體；五、通過Xbal/Sac I雙酶切鑒定篩選PSTVd雙體載體，陽性重組載體命名為pGM-T-PSTVd-Md ;六、根據插入類病毒雙體的pGM-T-PSTVd-Md載體兩側的序列設計正向引物5 ' -GCCGCGGGAATTCGAT-3 '和反向引物5' -TCCAACGCGTTGGGAGC-3'，利用Dig-dUTP為標記物，進行PCR擴增；即得到檢測馬鈴薯類病毒的雙體探針。
4. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟一中的20ii L的PCR反應體系由5iiL的5XRT-PCRBuffer、liiL的MgCl"liiL的dUTP、0. 75ii L的正向引物、0. 75ii L的反向引物、0. 1 y L的RNA抑制劑、2ii L的RNA模版、1 P L的Taq酶以及余量的重蒸餾水組成；擴增反應條件為反轉錄50°C 30min，預變性95°C 15min，變性94。C lmin、退火55。C lmin、延伸72。C lmin共30個循環，延伸72°C 10min。
5. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟二中的20iiL鑒定體系由liiL的lOXBuffer k、2 y L的含有N，0-雙三甲硅基乙酰胺質量濃度為0. 1 %的溶液、0. 7 ii L的BamH I 、0. 5 y L的Sac I 、 15 y L的pGM-T-PSTVd,以及余量的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電泳鑒定。
6. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟三中的20 ii L的PCR反應體系由5 ii L的5XRT-PCRBuffer、 1 y L的MgCl2、 1 y L的dUTP、0. 75ii L的正向引物、0. 75ii L的反向引物、0. 1 y L的RNA抑制劑、2ii L的RNA模版、1 P L的Taq酶以及余量的重蒸餾水組成；擴增反應條件為反轉錄50°C 30min，預變性95°C 15min，變性94。C lmin、退火55。C lmin、延伸72。C lmin共30個循環，延伸72°C 10min。
7. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟三中20ii L鑒定體系由1 y L的lOXBuffer k、1 ii L的Xba 1、1 ii L的BamH I、5ii L的pGM-T-PSTVcH^以及余量的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電泳鑒定。
8. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟四中10 ii L連接體系1 y L的pGM-T vector、 1 y L的10 X T4連接酶緩沖液、1 P L的T4連接酶、1P L的特異的酶切片段以及余量的無菌去離子水組成；連接反應條件為16°C 12h。
9. 根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，，其特征在于步驟五中20ii L鑒定體系由2ii L的lOXBuffer k、 1 y L的Xbal、 1 y L的Sac 1、5yL的pGM-T-PSTVd-Md以及余量的重蒸餾水組成；鑒定反應條件為37°C 12h，采用1%瓊脂糖電泳鑒定。
10.根據權利要求3所述的檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針序列①的制備方法，其特征在于步驟六中的20ii L的PCR反應體系由2iiL的10XPCR BF、 1 y L的MgCl2、 1 y L的DIG-dUTP、0. 5 ii L的正向弓|物、0. 5 ii L的反向引物、1 ii L的pGM_T-PSTVd-Md、0. 5 y L的Taq酶以及余量的重蒸餾水組成；擴增反應條件為預變性94°C 2min，變性94°C 30s、退火57°C 30s、延伸72°C 30s、共30個循環，延伸72°C lOmin。
全文摘要
檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒及檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針和探針序列①的制備方法，它涉及了檢測類病毒的試劑盒及檢測用DNA探針和探針序列的制備方法。本發明解決了現有馬鈴薯類病毒檢測技術存在檢出靈敏度較低，操作比較復雜需要專業人員進行實驗室檢測的缺陷，以及現有檢測馬鈴薯類病毒所用的DNA探針造成了檢測靈敏度低的缺陷。本發明檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒由溶液I、溶液VI、溶液VII、溶液VIII、溶液IX、溶液X I、溶液X II、溶液XIII和溶液X IV組成。本發明檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針為雙體探針。本發明檢測馬鈴薯類病毒的試劑盒靈敏度高，操作簡單，本發明檢測馬鈴薯類病毒的DNA探針靈敏度為現有單體探針的500倍。
文檔編號C12R1/94GK101717831SQ200910073290
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者劉尚武, 呂典秋, 宿飛飛, 張抒, 李勇, 李學湛, 王亞洲, 王文重, 王紹鵬, 邱彩玲, 高云飛 申請人:黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所