專利名稱：：人肝素酶cDNA表達載體在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及人肝素酶cDNA表達載體的新用途，特別是涉及人肝素酶cDNA表達載體在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用。
背景技術：
：硫酸肝素，即線形陰離子糖胺聚糖，廣泛存在于各種細胞表面，介導蛋白質之間的相互作用，如參與細胞因子(FGF-1，2、HGF、TGFP、PDGF)與受體的結合，調節抗凝血酶與凝血酶之間的作用，并且還是細胞間質和血管內皮下基底膜的重要組成部分。在腫瘤形成過程中，細胞外間質包裹腫瘤形成的與正常組織的分隔，以及血管內皮下的基底膜構成了阻止腫瘤向相鄰組織浸潤和血行轉移的生理屏障。肝素酶(h印aranase)—0-1，4葡萄糖苷內切酶，特異性地作用于硫酸肝素的特定位點，將其降解為小分子片段(HulettMD，FreemanC，HamdorfBF，etal.Cloningofmammalianh印aranase，animportantenzymeintumorinvasionandmetastasis.淑層7卿,.5仍；VlodavakyI，FriedmannY，ElkinM，etal.Mammalianheparanase:genecloning,expressionandfunctionintumorprogressionandmetastasis.7fet#et/7999,'5.'。有關肝素酶的研究已二十余年，研究表明肝素酶對機體的發育、炎癥過程、血管生成、腫瘤轉移均有重要的作用(EcclesSA.Heparanase:breakingdownbarriersintumors,船t#ec^799^."5"-扮。目前被人們普遍關注的是惡性腫瘤的發生和發展均伴有肝素酶的高表達，這意味著①基底膜的完整性遭到破壞，腫瘤細胞將突破局限轉移至它處或穿透基底膜進入血管。②肝素酶促血管生成作用為侵襲、轉移的腫瘤細胞提供了定居、生長所需營養。因此，肝素酶對腫瘤的發生、發展具有重要作用。肝素酶降解血管基底膜中的硫酸肝素，使基底膜通透性增加，是肝素酶參與炎癥反應的機理，當肝素酶超表達時將引發自身免疫性疾病。由此可見，肝素酶與腫瘤的發生、發展及轉移以及自身免疫性疾病密切相關。目前，國內外尚無有關檢測血清中肝素酶水平的報導，對腫瘤組織中肝素酶表達水平的檢測尚處在研究階段，因此建立一種靈敏的肝素酶水平檢測方法凸顯重要。此外，以肝素酶單抗作為導向的抗腫瘤藥也正處于研發之中。實現上述目的的關鍵是制備高特異性的肝素酶抗體。現今，商品化的肝素酶抗體生產方法均為用蛋白免疫獲得的多克隆抗體及雜交瘤法生產的單克隆抗體。本發明提供了一種人肝素酶cDNA表達載體的新用途，即在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用。所述人肝素酶cDNA表達載體，是含有人肝素酶全長編碼cDNA的重組表達載體。所述人肝素酶全長編碼cDNA可插入到重組表達載體中。構建所述重組表達載體的出發載體，可為任意一種指本領域熟知的可進行外源基因表達的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定表達，任何載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。所述原核表達載體可為pET-32a、PET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表達載體可為pcDNA、pVAXl、pCMV5、pSilencel.0-U6(Ambion，Austin,TX，USA)、pEGFP-Nl、pSV40、pCI-neo(購于Promega公司)、pTEFl、pPICZa、pAM82或pAAh5等，優選為pcDNA3.1。其中，以pcDNA3.l為出發載體，構建的含有所述人肝素酶cDNA的重組表達載體為pcDNA3.1-HPSE。可采用本領域技術人員熟知的方法構建含有所述人肝素酶cDNA的重組表達載體，如體外重組DNA技術，DNA合成技術和體內重組技術等(Sambrook，etalMolecularcloing，aLaboratoryManual.Coldspringharborlaboratory.NewYork,1989)。所述人肝素酶cDNA的DNA序列可以有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA的合成。所述啟動子可為大腸桿菌的lac或trp啟動子、噬菌體啟動子、反轉錄病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。所述表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，所述表達載體還可包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型形狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性基因等。使用人肝素酶cDNA表達載體制備抗人肝素酶免疫抗體，可包括以下步驟1)用人肝素酶cDNA表達載體作為免疫原免疫動物；2)從免疫動物的腹水液或血清中分離并純化出抗人肝素酶免疫抗體。在上述抗人肝素酶免疫抗體的制備方法中，步驟l)中用于制備抗人肝素酶免疫抗體的免疫動物可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動物，優選為小鼠。免疫方案可為用質粒濃度為200—300ug/mL的150ul人肝素酶cDNA表達質粒溶液注射小鼠臀部肌肉，然后將電極針插入小鼠注射部位肌肉，給予6次單脈沖電刺激(電壓250V，電容10uF)，14天后進行二次相同劑量的免疫，共免疫6次。本發明的抗人肝素酶免疫抗體可用于人肝素酶水平的免疫檢測中。所述人肝素酶水平的免疫學檢測方法可為放射免疫法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、夾心式免疫法、免疫沉淀或熒光免疫法等。上述檢測方法中，待測樣品的選擇可以是多樣的，如對于實體瘤患者，可為來自患者腫瘤組織的活檢物、組織切片等，對于非實體瘤患者，可為來自患者的血清、淋巴液、尿液等，此外，還可使用細胞系作為標本來源。所述單克隆抗體與樣品發生相互作用的條件，可依據檢測方法進行確定。本領域技術人員知曉，對于固相反應而言，可以將本發明所述單克隆抗體固定于固相載體，也可以將待測樣品固定于固相載體上。反應通常在室溫下進行，檢測過程中需要洗滌不與本發明所述單克隆抗體結合的樣品的步驟。對于液相反應而言，通常可以向處在特定緩沖體系中的待測樣品中直接加入本發明的單克隆抗體，然后在適于抗原抗體發生相互作用的溫度下(如室溫)進行反應。所述檢測方法中第二抗體的選擇取決于本發明單克隆抗體的來源。本領域技術人員知曉如何根據單克隆抗體的來源選擇相應的第二抗體。所述第二抗體可以是放射性同位素標記的，包括但不限于使用選自32P、"51、S、^等；也可以是非放射性同位素標記的，包括但不限于使用選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈霉親和素等標記。本發明所述檢測方法中使用的檢測劑，取決于檢測過程使用的第二抗體的標記物，本領域技術人員知曉如何選擇合適的檢測試劑。所述用ELISA法檢測細胞中的人肝素酶分子水平，可包括如下步驟1)用抗人肝素酶免疫抗體包被酶聯板，洗板；2)封閉經包被的酶聯板，洗板；3)加待測樣品，洗板；4)加兔抗人肝素酶多克隆抗體(商品化抗體)5)加酶標二抗，洗板；6)加底物顯色；7)終止反應；8)測定OD柳值。上述檢測方法中的反應條件及試劑均可按照常規方法進行選擇。步驟5)中的二抗可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶標記的抗鼠、抗羊或抗兔抗抗體。本發明還提供了一種檢測人肝素酶分子水平的試劑盒。本發明所提供的檢測人肝素酶分子水平的試劑盒，可包括上述抗人肝素酶免疫抗體。所述試劑盒還可包括與上述抗人肝素酶免疫抗體發生相互作用的第二抗體。所述第二抗體可為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等。所述第二抗體可為經過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶等標記酶標記的，優選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯在抗體上。試劑盒中還可包括顯色液A液和顯色液B液，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲溶液，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺溶液。為方便使用，所述試劑盒還可包括檢測用的洗滌液，如PBST等常規的洗滌試劑;封閉液，如10%小牛血清等；抗體稀釋液，如50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)等。本發明提供了人肝素酶cDNA表達載體的一種新用途，即在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用。檢測結果表明用本發明的人肝素酶cDNA表達載體獲得的免疫血清具有針對肝素酶的免疫特性，純化出的抗人肝素酶免疫抗體可用于科研和臨床上，如病人血清、腫瘤組織中肝素酶的定性及定量檢測，有助于相關疾病的臨床診斷和預后判斷。本發明將在抗人肝素酶免疫抗體的制備及醫學領域中發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為pcDNA3.1-HPSE的酶切鑒定結果圖2為免疫小鼠血清效價的ELISA法檢測結果具體實施例方式下述實施過程中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、抗人肝素酶抗體的獲得一、人肝素酶cDNA的克隆和真核表達載體的構建人肝素酶基因的cDNA全長1632bp，編碼543個氨基酸殘基(VlodavskyI，Friedmann，Y，ElkinM，etalMammalianheparanase:genecloning,expressionandfunctionintumorprogressionandmetastasisNatMed，1999，5:793-802)。從肝癌細胞株中純化出總RNA，然后反轉錄合成其cDNA，再以此cDNA模板，按照文獻報道的人肝素酶基因的cDNA全長序列設計克隆其全長cDNA的引物，并在引物中引入EcoRI和XbaI酶切位點，引物序列為gccggaattatgctgctgcgctcgaagc和cggtctagatcagatgcaagcagca。然后，用PCR法獲得人肝素酶基因的全長cDNA，PCR反應條件為先95。C2，；然后94。C30"，58°C30"，72°C2，共35個循環后；最后72。C7，。反應結束后，將PCR產物和表達質粒pcDNA3.l用限制性內切酶EcoRI禾口XbaI進行雙酶切，然后將酶切產物進行連接，使人肝素酶基因的全長cDNA連接到表達質粒pcDNA3.l中，得到攜帶有的重組表達質粒，命名為pcDNA3.l-HPSE。先用限制性內切酶EcoRI和XbaI對該重組質粒進行雙酶切鑒定，雙酶切鑒定結果如圖l所示(泳道l:pcDNA3.l-HPSEEcoRI/Xbal雙酶切；泳道3:pcDNA3.1-HPSE質粒；泳道4:MarkerDL2000)，經雙酶切可獲得1600bp和大約5000bp的DNA片段，與預期結果一致。再對該重組質粒用測序方法進行鑒定，測序結果表明插入片段與文獻報道序列完全一致，獲得了插入序列及位置均正確的攜帶人肝素酶全長cDNA的重組真核表達載體。二、小鼠免疫1、腹腔注射異戊巴比妥鈉(100mg/mL)，麻醉Balb/C小鼠。2、用75%的酒精消毒小鼠臀部肌肉，注射質粒濃度為200—300ug/mL的人肝素酶cDNA表達質粒pcDNA3.1-HPSE溶液150ul。3、將電極針插入小鼠注射部位肌肉，給予6次單脈沖電刺激(電壓250V，電容10uF)。4、將小鼠置于冰上1一2分鐘，消除電擊產熱對小鼠的傷害。5、將小鼠置于溫水袋上，使小鼠盡快蘇醒。6、14天后進行第二次相同劑量的免疫，用相同方法共免疫6次。三、血清鑒定1、用ELISA法鑒定免疫小鼠血清的效價，包括以下步驟1)包被抗原抗原為肝素酶，包被濃度為10ug/mL。2)陰性、陽性對照選擇陰性對照選擇未免疫的正常Balb/C小鼠血清；陽性對照為商品化單克隆抗體PM1319XL(AcrisantibodiesGmbH，Germany)。3)ELISA檢測小鼠尾靜脈取血50微升，離心取上清檢測，具體步驟如下a、用肝素酶第72-171位氨基酸表達片段包被酶聯板，4'C下放置18小時過夜，PBST洗滌三遍，拍干。b、每孔加150yl的lXBSA封閉，37。C下孵育30分鐘。c、棄掉封閉液，拍干，每孔加入100ul稀釋好的小鼠血清，同時設置陰陽對照，37'C下孵育60分鐘。d、PBST洗滌三遍，拍干，每孔加入100u1的HRP標記的羊抗鼠IgG(l:2000)，37。C下孵育30分鐘。e、PBST洗滌三遍，拍干；配制TMB反應液(常規方法)，每孔加入100ul的反應液，室溫放置5分鐘，用50ul2M的H2S04終止反應。f、檢測OD柳值。免疫小鼠血清效價的ELISA法檢測結果如圖2所示，結果顯示當小鼠抗血清稀釋至l:12，800時，0D45。為0.25，表明用本發明的人肝素酶cDNA表達載體獲得的免疫血清具有針對肝素酶的免疫特性和高效價，可用于小鼠免疫及抗人肝素酶免疫抗體的制備。實施例2、用含有抗人肝素酶免疫抗體的ELISA試劑盒檢測樣品中的人肝素酶水平一、含有抗人肝素酶免疫抗體的ELISA試劑盒的制備將實施例l制備的抗人肝素酶免疫抗體與商品化兔抗人肝素酶抗體及作為第二抗體的經過辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，顯色液A0.75%過氧化氫溶液，顯色液B(O.1M磷酸-檸檬酸緩沖液pH5.0，lmg/mL四甲基聯苯胺溶液9:l))，洗滌液PBST，封閉液10%小牛血清，抗體稀釋液O.1克BSA溶于O.15M磷酸酸鹽緩沖液(pH7.4)共同包裝，得到檢測人肝素酶水平的ELISA試劑盒。二、人肝素酶水平的檢測用步驟一制備的試劑盒對樣品中的人肝素酶水平進行測定，具體方法包括以下步驟(1)包被酶聯板用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)將實施例1制備的抗人肝素酶免疫抗血清稀釋200倍，每孔lOOiil，另加入陽性對照(M05,AbnovacoporationTaibei)4"C放置12-24小時，然后用10mMPBS-0.05%Tween20(pH7.4)洗三遍；(2)封閉已包被的酶聯板用10%的小牛血清封閉包被的酶聯板，150pl/孑L,37。C保溫30分鐘；(3)在酶聯板上加肝素酶待測樣品，以PBS為對照，100pl/孔，37。C保溫1小時，然后用10mMPBS-0.05%Tween20(pH7.4)洗三遍.(4)加入兔抗人肝素酶抗體100ug/ml(AcrisantibodyGmbH,Germany),100|til/孔，37。C保溫l小時，然后用10mMPBS-0.05%Tween20(pH7.4)洗三遍.(5)加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(l:20，000)，lOOpl/孔，37"保溫30分鐘，然后用10mMPBS-0.05%Tween20(pH7.4)洗三遍；(5)將顯色液A、B混合加入，100|11/孔，37"C顯色15分鐘;(6)加2N貼0450inl/孔終止反應;(7)測定0D45。值。結果如表l所示，顯示小鼠血清抗肝素酶抗體在l:200的稀釋比例下，0D,5。值為0.124±0.004，與已知濃度的標準樣品進行比較，可檢出肝素酶含量約為20ng/mL，對照未檢測出人肝素酶，與預期結果相符，表明本發明的抗人肝素酶免疫抗體及含有該抗體的試劑盒可用于肝素酶的免疫檢測中。表1鼠抗肝素酶抗血清用于肝素酶檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、人肝素酶cDNA表達載體在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用。2、根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述人肝素酶cDNA表達載體，是含有人肝素酶肝素酶全長編碼cDNA的重組表達載體。3、根據權利要求2所述的應用，其特征在于以pcDNA3.l為出發載體，構建的含有所述人肝素酶cDNA的重組表達載體為pcDNA3.1-HPSE。4、制備抗人肝素酶免疫抗體的方法，其特征在于包括以下步驟-1)用人肝素酶cDNA表達載體作為免疫原免疫動物；2)從免疫動物的腹水液或血清中分離并純化出抗人肝素酶免疫抗體。5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟l)中用于制備抗人肝素酶免疫抗體的免疫動物為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢或馬。6、根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟l)中的免疫方案為用質粒濃度為200—300ug/mL的150ul人肝素酶cDNA表達質粒溶液注射小鼠臀部肌肉，然后將電極針插入小鼠注射部位肌肉，給予6次單脈沖電刺激，14天后進行二次相同劑量的免疫，共免疫6次。7、根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述抗人肝素酶免疫抗體可用于人肝素酶水平的免疫檢測中，其中，用ELISA法檢測細胞中的人肝素酶分子水平，包括如下步驟1)甩抗人肝素酶兔疫抗體包被酶聯板，洗板；2)封閉經包被的酶聯板，洗板；3)加待測樣品，洗板；4)加酶標二抗，洗板；5)加底物顯色；6)終止反應；7)測定0D45。值。8、一種檢測人肝素酶分子水平的試劑盒，可包括權利要求4所述的抗人肝素酶免疫抗體。9、根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括與抗人肝素酶免疫抗體發生相互作用的第二抗體，所述第二抗體為羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。10、根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括顯色液A液和顯色液B液，洗滌液，封閉液，抗體稀釋液，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲溶液，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺溶液。全文摘要本發明公開了人肝素酶cDNA表達載體的一種新用途，即在制備抗人肝素酶免疫抗體中的應用。所述人肝素酶cDNA表達載體，是含有人肝素酶肝素酶全長編碼cDNA的重組表達載體。檢測結果表明用本發明的人肝素酶cDNA表達載體獲得的免疫血清具有針對肝素酶的免疫特性，純化出的抗人肝素酶免疫抗體可用于科研和臨床上，如病人血清、腫瘤組織中肝素酶的定性及定量檢測，有助于相關疾病的臨床診斷和預后判斷。本發明將在抗人肝素酶免疫抗體的制備及醫學領域中發揮重要作用，應用前景廣闊。文檔編號C12N15/63GK101457232SQ20091007612公開日2009年6月17日申請日期2009年1月7日優先權日2009年1月7日發明者宋海峰,鋒宮,李素波,檀英霞,田曙光,虞立霞,新高,高紅偉申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所