專利名稱：：一種轉化芽孢桿菌的方法
技術領域：
：本發明涉及一種轉化芽孢桿菌的方法。
背景技術：
：芽孢桿菌作為一個屬，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人們對芽孢桿菌的研究幾乎涉及到了革蘭氏陽性可生孢細菌的各個領域。尤其是在感受態、芽孢形成及其調控、遺傳操作、菌種改良、生物技術等領域進行了大量的工作。科學研究中應用最多的當屬枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌能發展成為芽孢桿菌中的第一個基因工程表達系統是與艽早期的遺傳學工作密切相關的。Spizizen于1958年發現枯草芽孢桿菌168菌株為可轉化菌株以來，枯草芽孢桿菌的遺傳學工作不斷深入和發展。美國俄亥俄州立大學BacUlus遺傳保藏中心(BGSC，http:〃ww.bgsc.org)至1999年保藏的168菌株的遺傳突變株就有890個。它牽涉到了諸多營養要求、各種酶、芽孢形成和發芽、感受態、Sigma因子、腿A重組與修復以及正負調控等各方面基因的突變體。70年代發明了DNA重組技術以后，特別是發現金黃色葡萄球菌的帶有抗性標志的質粒可作為枯草芽孢桿菌的載體以后，克服了枯草芽孢桿菌只有隱秘性質粒的困難，枯草芽孢桿菌基因工程的工作更是加速發展。迄今，已經在枯草芽孢桿菌及其近緣種中克隆和表達了大量的原核和真核基因，其中有的已應用于工業化生產，取得了不少成績。將攜有外源基因載體導入宿主細菌中是細菌基因工程表達系統的必要條件。大腸桿菌的氯化鈣轉化法對枯草芽孢桿菌無效，所以枯草芽孢桿菌基因工程表達系統中的宿主菌株用的最廣泛的就是在DNA重組技術發明之前就可以進行感受態轉化(Spizizen1958)的168菌株及其突變體。Spizizen感受態轉化的基本原理是細胞在Spizizen最低鹽培養基中形成一段饑餓、易于攝取外源DNA片段的時期。一般步驟是先將其在較為豐富的培養基中培養，然后轉接到貧瘠的培養基中，使其形成感受態(一般非常短暫)。以枯草芽孢桿菌感受態細胞為宿主進行轉化的轉化效率很低。細胞電穿孔具有普遍性，可用于動物、植物和微生物等各類細胞，且效率高、無殘余毒性、參數容易控制。但一般電轉化是將質粒直接導入宿主細胞。
發明內容本發明的目的是提供一種轉化芽孢桿菌方法。本發明所提供的芽孢桿菌轉化方法是以芽孢桿菌原生質體為轉化受體，用電穿孔3法將DNA分子導入芽孢桿菌原生質體中。其中，芽孢桿菌原生質體可以用現有的多種方法獲得。所述芽孢桿菌原生質體具體可按照如下方法制備的芽孢桿菌在PAB培養液培養，收集所述芽孢桿菌，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶獲得芽孢桿菌原生質體；所述PAB培養液為25。/。(體積百分含量)4XPAB培養液，所述4XPAB培養液由如下物質組成5-7g/L牛肉膏、5-7g/L酵母膏、18-22g/L蛋白胨、4.3-6.5g/LKH2P04、13-15g/LNaCl、17.5-20.3g/LK2HP04*3H20、3-5g葡萄糖；所述菌體保護液由如下物質組成19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XS麗培養液，所述2XS麗培養液含有3.8-5.0g/L馬來酸、7.5-9.0g/LMgCl26H20，1.8-2.2M蔗糖，p服.2-6.8。所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。所述電穿孔法為在25uF電容，400Q電阻，0.3-0.5kV電擊電轉液中的枯草芽孢桿菌原生質體。或者，所述電穿孔法為在25"F電容，400Q電阻，0.6-0.8kV電擊電轉液中的地衣芽孢桿菌原生質體。所述電轉液由如下物質組成19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、47%-55%(體積百分含量)2XS麗培養液、20-28%(體積百分含量)4XPAB培養液。本發明的芽孢桿菌轉化方法以枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌原生質體為受體，將重組質粒導入枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中，轉化效率達到60%，對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因工程表達系統具有重要的意義。另外，地衣芽孢桿菌的轉化在一般情況下是很難進行的，本發明的芽孢桿菌轉化方法對于地衣芽孢桿菌的轉化也是很有效的。具體實施例方式實施例l、枯草芽孢桿菌轉化一、枯草芽孢桿菌原生質體的制備枯草芽孢桿菌(i^w7^^w力"7/WCICC10157(購于中國工業微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養液中，37t:搖床培養過夜。次日按照2.5ral/100ml轉接入新鮮的PAB培養液中培養4小時，至對數生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyrae，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養60分鐘，即形成原生質體。PAB培養液100ml4XPAB培養液加入300ml滅菌水。4XPAB培養液由如下物質組成:6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gK,、14gNaCl、19.5gK2HP043H20和4g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XS應培養液。2XS麗培養液4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、枯草芽孢桿菌以原生質體為受體轉化當95%的細胞變成原生質體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預冷的電轉液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS麗培養液、25%(體積百分含量)4XPAB培養液)洗兩次，之后用500ul電轉液重懸原生質體，使原生質體濃度為108cfu/mL;將原生質體以每管120uL分裝，加入0.3ugpBCJ164.3(購自美國俄亥俄州立大學菌種保存中心，」fed7^/sGeneticStockCenter(BGSC)TheOhioStateUniversity)后冰置上5分鐘；然后轉移至預冷的電擊杯中，設置25uF電容，400Q電阻，以不同電壓(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8kv)電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉液，轉移至EP管中，37°C，lOOrpm搖床培養12小時；然后涂于含氯霉素4.0ug/mlDM3培養基上篩選。實驗重復3次。結果如表1所示。DM3培養基由如下物質組成8g/L瓊脂、5g/L水解酪蛋白、5g/L酵母粉、1.5g/LKH2P04、3.5g/LK2HP04、45.5g/L山梨醇、10g/L淀粉、5g/L葡萄糖;0.09g/LBSA和0.02MMgCl2。表l.DM3培養基上篩選的陽性克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2、枯草芽孢桿菌轉化一、枯草芽孢桿菌原生質體的制備枯草芽孢桿菌(萬acj'Lws卯6^7^J)210CICC11210(購于中國工業微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養液中，37。C搖床培養過夜。次日按照2.5ml/100ml轉接入新鮮的PAB培養液中培養4小時，至對數生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養60分鐘，即形成原生質體。PAB培養液100ml4XPAB培養液加入300ml滅菌水。4XPAB培養液由如下物質組成5g牛肉膏、5g酵母膏、18g蛋白胨、4.3gKH2PO"13gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。菌體保護液19g/LBSA、1.8M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XSMM培養液。2XS應培養液:3.8g/L馬來酸、7.5g/LMgCl26H20，1.8M蔗糖，p朋.2。二、枯草芽孢桿菌以原生質體為受體轉化當95%的細胞變成原生質體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預冷的電轉液[19g/LBSA、1.8M蔗糖、47%(體積百分含量)2XSMM培養液、20%(體積百分含量)4XPAB培養液]洗兩次，之后用500ul電轉液重懸原生質體，使原生質體濃度為108cfu/mL;將原生質體以每管120yL分裝，加入0.5ugpBCJ164.3。后冰置上5分鐘；然后轉移至預冷的電擊杯中，設置25uF電容，400Q電阻，以O.3kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉液，轉移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養12小時；然后涂于氯霉素4.0iig/ralDM3培養基上篩選。實驗重復3次。DM3培養基上篩選后，平板上的菌落數為40個。實施例3、枯草芽孢桿菌轉化一、枯草芽孢桿菌原生質體的制備枯草芽孢桿菌Ssci^〃s幼Z^W^074(BF-7658)，CICC10074(購于中國工業微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養液中，37C搖床培養過夜。次日按照2.5ml/100ml轉接如新鮮的PAB培養液中培養4小時，至對數生長前期。5000卬ra離心IO分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養60分鐘，即形成原生質體。PAB培養液100ml4XPAB培養液加入300ml滅菌水。4XPAB培養液由如下物質組成7g/L牛肉膏、7g/L酵母膏、22g/L蛋白胨、6.5g/LK,、15g/LNaCl、20.3g/LK2HP043H20、5g葡萄糖。菌體保護液由如下物質組成22g/LBSA、2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XS畫培養液。2XSMM培養液:5.Og/L馬來酸、9.0g/LMgCl26H20、2.2M蔗糖，p朋.8。二、枯草芽孢桿菌以原生質體為受體轉化當95%的細胞變成原生質體時，4°C，6000rpra離心5分鐘后，用預冷的電轉液(22g/LBSA、2.2M蔗糖、55%(體積百分含量)2XS麗培養液、28%(體積百分含量)4XPAB培養液)洗兩次，之后用500ul電轉液重懸原生質體，使原生質體濃度為10"cfuAiL;將原生質體以每管120yL分裝，加入lugpBCJ164.3。后冰置上5分鐘；然后轉移至預冷的電擊杯中，設置25uF電容，400Q電阻，以O.5kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉液，轉移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養12小時；然后涂于氯霉素4.0ug/mlDM3培養基上篩選。實驗重復3次。DM3培養基上篩選后，平板上的菌落數為30個。實施例4、地衣芽孢桿菌轉化一、地衣芽孢桿菌原生質體的制備地衣芽孢桿菌69aci7^^乃'c力e/n7br肌'sJCICC10181(中國工業微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養液中，37。C搖床培養過夜。次日按照2.5ml/100ral轉接如新鮮的PAB培養液中培養4小時，至對數生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養60分鐘，即形成原生質體。PAB培養液100ml4XPAB培養液加入300ml滅菌水。4XPAB培養液由如下物質組成6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gKH2P(^、15gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XS醒培養液。2XS羅培養液4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、地衣芽孢桿菌以原生質體為受體轉化當95%的細胞變成原生質體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預冷的電轉液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS麗培養液、25%(體積百分含量)4XPAB培養液)洗兩次，之后用500ul電轉液重懸原生質體，使原生質體濃度為108cfu/raL;將原生質體以每管120uL分裝，加入0.3PgpAXOI(購自美國俄亥俄州立大學菌種保存中心，fe"72w51GeneticStockCenter(BGSC)TheOhioStateUniversity)后冰置5分鐘；然后轉移至預冷的電擊杯中，設置25yF電容，400Q電阻，以0.6kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉液，轉移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養12小時；然后涂于含10iig/ml紅霉素的DM3培養基上篩選。實驗重復3次。DM3培養基上篩選后，平板上的菌落數為20個。實施例5、地衣芽孢桿菌轉化一、地衣芽孢桿菌原生質體的制備地衣芽孢桿菌6aciW^WcAwi/oiTZ^^CICC10181(中國工業微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養液中，37'C搖床培養過夜。次日按照2.5ml/100ml轉接如新鮮的PAB培養液中培養4小時，至對數生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10rag/mL，37°C，搖床培養60分鐘，即形成原生質體。PAB培養液100ml4XPAB培養液加入300ml滅菌水。4XPAB培養液由如下物質組成6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gKH2P04、15gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XS麗培養液。2XS腿培養液:4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、地衣芽孢桿菌以原生質體為受體轉化當95%的細胞變成原生質體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預冷的電轉液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS畫培養液、25%(體積百分含量)4XPAB培養液)洗兩次，之后用500ul電轉液重懸原生質體，使原生質體濃度為108cfu/mL;將原生質體以每管120yL分裝，加入0.3ygpAX0I后冰置上5分鐘；然后轉移至預冷的電擊杯中，設置25uF電容，400Q電阻，以O.8kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉液，轉移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養12小時；然后涂于含10ug/ml紅霉素的DM3培養基上篩選。實驗重復3次。畫3培養基上篩選后，平板上的菌落數為30個。權利要求1、一種轉化芽孢桿菌的方法，是以芽孢桿菌原生質體為轉化受體，用電穿孔法將DNA分子導入芽孢桿菌原生質體中。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌原生質體是按照如下方法制備的芽孢桿菌在PAB培養液培養，收集所述芽孢桿菌，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶獲得芽孢桿菌原生質體；所述PAB培養液為25。/。(體積百分含量)4XPAB培養液，所述4XPAB培養液含有5-7g/L牛肉膏、5-7g/L酵母膏、18-22g/L蛋白胨、4.3-6.5g/LKH2P04、13-15g/LNaCl、17.5-20.3g/LK2HP043H20、3-5g葡萄糖；所述菌體保護液含有19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養液，50%(體積百分含量)2XSMM培養液，所述2XS醒培養液含有3.8-5.0g/L馬來酸、7.5-9.0g/LMgCl26H20，1.8-2.2M蔗糖，p朋.2-6.8。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌。4、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌。5、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述電穿孔法為在25yF電容，400Q電阻，0.3-0.5kV電擊電轉液中的枯草芽孢桿菌原生質體。6、根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述電穿孔法為在25yF電容，400Q電阻，0.6-0.8kV電擊電轉液中的地衣芽孢桿菌原生質體。7、根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述電轉液含有19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、47%-55%(體積百分含量)2XSMM培養液、20-28%(體積百分含量)4XPAB培養液。全文摘要本發明公開了一種轉化芽孢桿菌的方法。該方法，是以芽孢桿菌原生質體為轉化受體，用電穿孔法將DNA分子導入芽孢桿菌原生質體中。本發明的芽孢桿菌轉化方法以枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌原生質體為受體，將重組質粒導入枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中，轉化效率達到60％，對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因工程表達系統具有重要的意義。另外，地衣芽孢桿菌的轉化在一般情況下是很難進行的，本發明的芽孢桿菌轉化方法對于地衣芽孢桿菌的轉化也是很有效的。文檔編號C12N15/87GK101481709SQ20091007764公開日2009年7月15日申請日期2009年2月10日優先權日2009年2月10日發明者楊建國,兵汪,瑾郭申請人:北京中天諾亞體育科技有限公司