專利名稱：枯草芽孢桿菌及其用于制備γ－聚谷氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種高產γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物菌株，以及將其用于制備γ-聚谷氨酸的方法。
背景技術：
γ-聚谷氨酸(Poly γ-glumatic acid，γ-PGA)是一種可以通過微生物合成的均氨基酸化合物。作為一種生物高分子材料，γ-PGA具有生物可降解性好、可食、對人體和環境無毒害的優點。因此，γ-PGA及其衍生物在食品、化妝品、醫藥和水處理等方面具有廣泛的用途。
目前合成γ-PGA的方法主要有化學合成法、提取法和微生物合成法等。但是化學合成法合成路線長、副產物多、收率低，并且產物的分子量小、難于滿足作為新型藥物載體材料的要求，沒有工業應用價值。而提取法由于γ-PGA濃度較低，且隨條件不同，含量變化大。因此，提取工藝十分復雜，生產成本甚高，同樣難以進行大規模的工業生產。
目前主要采用微生物發酵法生產γ-PGA。γ-PGA是1937年Ivanovics在Bacillus anthracis的莢膜中首先發現(Ivanovics G，Bruckner V.Immunitatsforch.1937，90，304～318)。韓國研究人員在2.5升發酵罐中對Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培養的方法，發酵35小時后可達到35g/L的最終產量(Yoon SH，DO JH，Lee SY.Biotechnol.Lett，2000，22585～588)。Ogawa對Bacillus subtilisMR 141的大規模生產進行的研究表明在30L的發酵罐中優化培養條件可使γ-PGA最大產量達到35g/L(Ogawa Y，YamaguchiF，Yuasa K.Biosci Biotec Biochem，1997，611684～1687)。Kubota在Osaka City University土壤中分離得到的一株Bacillus subtilis F201，該菌株在最佳發酵生產條件下可以達到50g/L的最高產量，這是文獻報道的最高產產量(Kubota H.Biosci Biotec Biochem，19931212～1213)。該菌株已被Meiji Seika Kaisha公司成功用于工業化大規模生產γ-PGA(Tanaka T，Yaguchi T，Hiruta O，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，1809～1810；Tanaka T，Hiruta O，Futamura T，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，2148～2153)。
雖然γ-PGA的發酵生產取得了較大的進展，但是仍然存在耗用原料較多，生產周期較長，生產效率低下，生產成本較高的問題，因此，高效、低成本生產γ-PGA仍有待于進一步研究。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高產γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物菌株，以及用該微生物菌株制備γ-聚谷氨酸的方法。
本發明的目的通過以下措施達到使用的微生物用于生產本發明所述γ-聚谷氨酸的微生物菌株是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtills)zju-7，該菌株系從醬油生產廢料中分離選育而得，于2004年11月15日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC No.1250。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7具有以下性質1.形態特征在蛋白胨瓊脂培養基上營養細胞為0.6～0.9×1.5～3.0μm大小的桿菌，40℃培養7天形成芽孢，芽孢大小為0.6～0.8×1.0～2.0μm，為長圓形或圓柱形。
2.在各種培養基上的特征(1)蛋白胨葡萄糖瓊脂平板培養30～40℃培養24小時可大量生長。菌落呈白色，菌落表面有菌膜，有皺褶，不透明，不閃光，邊緣不規則。
(2)蛋白胨葡萄糖瓊脂斜面培養30～40℃培養24小時可大量生長。菌落呈白色，菌落表面有菌膜，有皺褶，不透明，不閃光，邊緣不規則。
(3)蛋白胨葡萄糖液體培養在培養液表面形成菌膜。
(4)蛋白胨葡萄糖穿刺培養菌體在表面生長，底部不生長。
3.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7的生理生化性質見表14.通過細菌16s RNA比對，證明該微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtills)綜上所述，本發明使用的是好氣性芽孢桿菌，具體為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtills)zju-7。
表1 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7生理生化性質
利用枯草芽孢桿菌制備γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟1)將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化；培養基為葡萄糖1～10％，蛋白胨1～8％，谷氨酸2～6％，MgSO40.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO40.01～0.05％，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。活化8小時后，可見菌落生長。
2)配制培養基碳源1～10％，氮源1～8％，谷氨酸2～15％，MgSO40.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO40.01～0.05％，各組分的含量均為重量體積百分比，pH6～7，裝液量20～200ml/500ml搖瓶，滅菌后，冷卻，接入活化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為1～10％，20～40℃搖瓶培養，轉速100～400rpm，在上述條件下進行搖瓶發酵，培養24～72小時；或裝液于發酵罐中，滅菌，接入活化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為1～10％，通氣量為1.0～3.0vvm，于35～40℃溫度下培養24～72小時；3)離心去除發酵液中的菌體，用酸將上清液的pH值調至3～5，然后加入甲醇、乙醇或丙酮有機溶劑，加入量為上清液體積的2～5倍，沉淀，將沉淀物溶解于水中，過濾除去不溶物，透析除去小分子物質，干燥，得到γ-聚谷氨酸。
本發明中使用的碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉或淀粉，以葡萄糖和蔗糖較為合適；氮源可以是有機氮源蛋白胨、酵母膏或玉米漿；也可以是無機氮源NH4NO3或(NH4)2SO4，上述氮源可以單獨使用，也可以混和使用。
上述培養基中，優選谷氨酸含量為7～12％，因為加入的谷氨酸太少，γ-聚谷氨酸生產量減少，甚至完全不生產；加入量過大，菌體生長變差，發酵液中的谷氨酸剩余過多，造成浪費。本發明中使用的谷氨酸也可以是其鹽的形式。優選NaCl含量為3～5％，因為發酵液中的NaCl含量過低，在發酵過程中產生大量泡沫；NaCl含量過高，會抑制菌體的生長。
本發明得到的γ-聚谷氨酸具有以下理化性質1)本產品溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑；2)本產品茚三酮反應呈陰性，用6MHCl水解后茚三酮反應呈陽性；3)6MHCl水解后用HPLC和薄層層析法檢測，發現水解物中生成單一的氨基酸谷氨酸。證明本產品為谷氨酸的高分子聚合物；4)通過SDS-PAGE和凝膠過濾色譜等方法證明本產物的分子量為200～1000KDa；本發明制備的γ-聚谷氨酸分子上具有大量的游離羧基，因而具有良好的吸濕性能和保濕性能，可以作為難溶性藥物載體、食品增稠劑、淀粉防老化劑和化妝品的保濕劑。
本發明與現有技術相比具有以下優點(1)本發明使用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7微生物菌株可以高效率的發酵生產γ-聚谷氨酸(2).枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7菌株培養條件粗放，可以使用多種不同的碳源及氮源；(3)培養基色澤較淺，有利于后期的產物分離純化；(4)通過對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7菌株培養條件的優化，特別是通過在培養基中加入谷氨酸及其鹽，使發酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高達50～60g/L，從而提供了一種高效廉價制備γ-聚谷氨酸的方法。
具體實施例方式
下面的實施例對本發明作詳細說明，但對本發明沒有限制。
實施例1將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7經37℃斜面活化，斜面培養基葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，谷氨酸3％，MgSO40.1％，NaCl 1％，K2HPO40.01％，活化8小時。
搖瓶培養基葡萄糖2％，蛋白胨1.5％，谷氨酸3％，MgSO40.1％，NaCl 1％，K2HPO40.01％，pH7，裝液量50ml/500ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘。
滅菌結束后，冷卻，接種上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為3％，37℃搖瓶培養，轉速200rpm，在上述條件下進行搖瓶發酵實驗，培養24小時。
發酵結束后，離心去除發酵液中的菌體，將發酵液中的菌體除去，用鹽酸將上清液的pH值調至4，然后加入4倍體積甲醇，沉淀。將沉淀物重新溶解在100倍體積水中，過濾除去不溶物，然后透析除去小分子物質，最后將溶液冷凍干燥得到白色粉末狀物質，此白色物質為γ-聚谷氨酸，產量可達到15g/L。
實施例2將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化，同實施例1；搖瓶培養基葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸5％，MgSO40.2％，NaCl 2％，K2HPO40.05％，pH7，裝液量30/250ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘。滅菌后冷卻，接種，接種量為3％，菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，37℃培養24小時，搖瓶轉速為200rpm。
發酵結束后，同實施例1分離純化γ-聚谷氨酸，產量可達到18g/L。
實施例3將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化，同實施例1；以葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸8％，MgSO40.1％，NaCl 2％，K2HPO40.05％為搖瓶培養基，pH7，裝液量30ml/200ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘，滅菌結束后，冷卻，接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為3％，37℃搖瓶培養，200rpm，培養24小時，發酵結束后，按照實施例1的方法分離純化γ-聚谷氨酸，其產量可達到23g/L。
實施例4同實施例3，將搖瓶培養基中的葡萄糖以蔗糖代替，結果得到發酵液中的γ-聚谷氨酸濃度為28g/L。
實施例5將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化，同實施例1；以葡萄糖10％，蛋白胨8％，谷氨酸15％，MgSO40.2％，NaCl 5％，K2HPO40.05％為培養基，pH7，裝液量50/500ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘。滅菌后冷卻，接入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，37℃培養24小時，搖瓶轉速為200rpm。
發酵結束后，離心去除發酵液中的菌體，按照實施例l所敘述的方法分離純化得到-聚谷氨酸，產量可達到54g/L。
實施例6將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化，同實施例1；以葡萄糖1％，蛋白胨1％，谷氨酸2％，MgSO40.05％，NaCl 1％，K2HPO40.01％為培養基，pH7，裝液量50ml/500ml搖瓶，121℃滅菌20分鐘，滅菌結束后，冷卻，接入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為1％，37℃搖瓶培養，轉速100～400rpm，在上述條件下進行搖瓶發酵實驗，培養24小時。
發酵結束后，按照實施例1的方法分離純化γ-聚谷氨酸，其產量可達到15g/L。
實施例7將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化，同實施例1；以蔗糖5％，蛋白胨5％，谷氨酸5％，MgSO40.1％，NaCl 2％，K2HPO40.05％為搖瓶培養基，pH7，裝液量50ml/200ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘，滅菌結束后，冷卻，接入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為3％，37℃搖瓶培養，200rpm，培養48小時。
發酵結束后，按照實施例1的方法分離純化γ-聚谷氨酸，結果見表2。
實驗結果表明不加谷氨酸的對照瓶中不生成γ-聚谷氨酸，并且隨著谷氨酸及其鈉鹽加入量的增加，發酵液中γ-聚谷氨酸的含量隨之增加，在發酵培養基中谷氨酸的含量超過10％，培養液中最終生成50g/L的γ-聚谷氨酸。
表2 谷氨酸含量對γ-聚谷氨酸產量的影響
實施例8將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7經37℃斜面活化，斜面培養基為葡萄糖1％，蛋白胨2％，谷氨酸2％，MgSO40.05％，NaCl 1％，K2HPO40.01％，活化12小時。
在斜面上挑取單菌落至一級種子培養基中，一級種子培養基為葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸3％，MgSO40.05％，NaCl 1％，K2HPO40.1％，pH.7，裝液量10ml/100ml搖瓶，115滅菌15～30分鐘，滅菌結束后，冷卻，接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為3％，37℃轉速200rpm培養12h。
以蔗糖1％，蛋白胨1％，谷氨酸4％，MgSO40.1％，NaCl.0.5％，K2HPO40.05％為二級種子培養基，pH7，裝液量100ml/1000ml搖瓶，115℃滅菌20分鐘，滅菌結束后，冷卻，接入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為3％，37℃搖瓶培養，200rpm，培養12小時。
以蔗糖5％，蛋白胨5％，谷氨酸10％，MgSO40.1％，NaCl 3％，K2HPO40.05％為培養基，pH7，裝液量3L/5L發酵罐，115℃滅菌20分鐘，接入上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7的二級種子，接種量為1％，控制發酵液pH值為6.5~7.0，通氣量為3.0vvm，溫度為37℃，培養36h。
發酵結束后，按照實施例1的方法分離純化γ-聚谷氨酸，實驗結果表明，γ-聚谷氨酸產量達到51.3g/L，生產率達到1.425g·h-1·L-1。
權利要求
1.枯草芽孢桿菌，其特征是該菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtills)zju-7，于2004年11月15日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1250。
2.用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌制備γ-聚谷氨酸的方法，其特征是包括以下步驟1)將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培養基活化；2)配制培養基碳源1～10％，氮源1～8％，谷氨酸2～15％，MgSO40.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO40.01～0.05％，各組分的含量均為重量體積百分比，pH6～7，裝液量20～200ml/500ml搖瓶，滅菌后，冷卻，接入活化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為1～10％，20～40℃搖瓶培養，轉速100～400rpm，在上述條件下進行搖瓶發酵，培養24～72小時；或裝液于發酵罐中，滅菌，接入活化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju-7，接種量為1～10％，通氣量為1.0～3.0vvm，于35～40℃溫度下培養24～72小時；3)離心去除發酵液中的菌體，用酸將上清液的pH值調至3～5，然后加入甲醇、乙醇或丙酮有機溶劑，加入量為上清液體積的2～5倍，沉淀，將沉淀物溶解于水中，過濾除去不溶物，透析除去小分子物質，干燥，得到γ-聚谷氨酸。
3.根據權利要求2所述的制備γ-聚谷氨酸的方法，其特征是步驟2)培養基中的NaCl含量為3～5％，
4.根據權利要求2所敘述的方法，其特征是在培養基中L-谷氨酸含量為5～12％。
5.根據權利要求2所述的制備γ-聚谷氨酸的方法，其特征是培養基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉或淀粉。
6.根據權利要求2所述的制備γ-聚谷氨酸的方法，其特征是培養基中的氮源是有機氮源蛋白胨、酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉或玉米粉，或是無機氮源NH4NO3或(NH4)2SO4。
全文摘要
本發明提供了一種采用發酵制備γ－聚谷氨酸的方法，該方法將經過篩選得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtills)zju－7菌株，即CGMCC No.1250，在含有碳源、氮源、谷氨酸、MgSO
文檔編號C12P13/00GK1644677SQ200410010509
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者徐志南, 石峰, 岑沛霖 申請人:浙江大學