一種檢測類鼻疽的基因液相芯片及其檢測方法

專利名稱：一種檢測類鼻疽的基因液相芯片及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測類鼻疽(B"HywWen'a戸ei/cfowa〃" 5./ )的基因液相 芯片及其制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的 方法。
背景技術：
液相芯片檢測是近幾年發展起來的新興技術，具有快速、特異、敏 感的特點。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏 色，作為IOO種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5pm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據 不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。
類鼻疽菌為革蘭陰性，雙極，需氧，有動力，棒狀無芽孢桿菌。類 鼻疽菌引起熱帶和亞熱帶地區人和動物的類鼻疽病，感染人可通過過呼 吸道、皮膚等多途徑進入人體內，潛伏期一般為3~5天，少數也有數年 后發病，即所謂"潛伏型類鼻疽"，甚至20年以上。本病有急性敗血癥 型、亞急性、慢性及亞臨床型3種表現，臨床癥狀不典型，不易診斷。 亞急性或慢性類鼻疽典型表現是類似結核病的肺葉空洞，急性敗血癥患 者常伴多處化膿性損害，病情一般較為嚴重，如不及時治療，病死率很 高。
應用傳統的培養、生化鑒定的方法對類鼻疽做出^^斷通常需要1周的 時間才能獲得結果，且往往導致鑒定錯誤。利用直接免疫熒光、膠乳凝 集、ELISA等免疫學方法對培養物或標本中的抗原、外毒素等進行沖企測特 異性和敏感性都較好。分子生物學方法檢測類鼻疽菌已見諸多報道。

發明內容
本發明涉及一種改進的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯 片可以用于病原體類鼻疽的檢測。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。
經過深入和大量的研究和實驗，本發明以類鼻疽染色體標識序列為 靶序列，建立了類鼻疽的基因液相芯片和檢測方法，為該菌的檢測提供 一條可行的途徑。
本發明所述的基因液相芯片包括微球、捕獲探針、引物、PCR^ 應體系、鏈親和素一藻紅蛋白，該基因液相芯片可4企測類鼻疽。
本發明還涉及上述可檢測類鼻疽的基因液相芯片，該芯片包括熒 光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR^應體系、鏈親和素一藻紅蛋白。
本發明的PCR^應體系包括10xPCR緩沖液、dNTPs、 Taq DNA聚 合酶。
本發明的引物包括:
靶引物序列(5，畫3，)基因長產
組位置度物
織大 小
類Bp-FCGATCTCGTCAAGGTGTCGG染色體20
鼻 疽Bp-RCCCCAGTTCATCTGATACTTGC標識序 歹'J22150
其中，下游引物是5'生物素標記的Bp-R。
具體例如是Bp-R: 5，-生物素-CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
本發明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性
探針 名稱探針靶位探針序列(5，-3，)
Bp類鼻疽染色體標識序列 209-231 bpAGGTCAATTTCCCGAACAAGACT
本發明中，上面所述捕獲探針在合成時在5'端進行氨基修飾，并且 連接15-20個T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球 進行偶聯。
本發明的微球， 一般選擇熒光編碼的微球，例如來源于Luminex或
5其他代理公司的任何編號的微球，特異性探針與焚光編碼微球偶聯形成 檢測微球，由此構成檢測芯片。
本發明的鏈親和素-藻紅蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin , SA-PE ) 為一種熒光蛋白，能被液相芯片檢測系統中的綠色激光激發發光，由此 可以進行定性或定量檢測。
本發明涉及上述基因液相芯片的制備方法，該方法包括
1. 選取編碼微球，取適量例如約1.25x 106個于離心管內，離心棄上清 后，加入例如0.1 mol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液使之重懸；
2. 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針(即捕獲探針Bp)稀釋，加至微球 懸浮液中，振蕩混勻；
3. 加入10 mg/mL的EDC ( l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸 鹽)溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育例如30分鐘；
4. 用0.02。/。PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述微球重懸 于例如lml的0.1。/oSDS (即十二烷基磺酸鈉)中，洗滌，離心；
5. 移棄上清液，微球重懸于例如100(il的pH8.0TE中，振蕩懸起混勻， 得到偶聯好的檢測微球，即本發明的基因液相芯片。4。C避光保存。
另一方面，本發明還涉及上述類鼻疽檢測基因液相芯片的檢測方法， 該方法包括樣本核酸的提取，PCR擴增，檢測病原體。本發明對上述 三個步驟的操作和條件進行了改進和優化。
本發明的樣本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核 酸。例如，具體步驟如下
1) 向每管樣本中加入6mol/LNal，振蕩混勻，煮沸；
2) 離心，轉上清液至另一含20%玻璃^=分液的離心管中；
3) 充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上； 8000r/分鐘離心，小心傾去上清液；
4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75%乙醇1 ml,充分混勻，離心， 小心傾去上清液；
5) 重復步驟(4)，然后置于37。C恒溫箱內干燥；
6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混勻，65°C 加熱，離心，回收上清液備用。
本發明的PCR擴增例如是以上述核酸提取步驟中制備的上清液作為PCR反應的模板，PCR反 應體系以及反應條件。
本發明的PCR體系例如是
10xPCR緩沖液 3 jil
TaqDNA聚合酶 0.3jxl
dNTPs: 0.3nl
上游引物 0.3pl
下游引物 0.3|til
模板DNA: 2|il
雙蒸水ddH20: 補足30fxl 反應條件 預變性
94-96°C 10分4中 35個循環
94-96 。C 30-40秒
55-58°C 30-40秒
72 °C 30-40秒 延伸
72 °C 4-7分鐘 同時，PCR空白對照品為如下
10xPCR緩沖液 3^1
Taq酶 0牟
dNTPs: OJ)il
上游引物 0.3jil
下游引物 0.3^1
雙蒸水ddH20: ^卜足30^d
反應結束后以P/。的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。
本發明的^r測方法包括
1)取上述兩種偶聯微球混合，裝于PCR管中，根據微球計數結 果計算相應加入量，使每種微球的量相同，每次反應每種例如3000-5000個；
2) 向各管中加5-17pl上面的PCR擴增得到的產物，混勻；
3) 95°C變性10分鐘；隨后45 ~ 6(TC反應10 ~ 30分鐘；
4) 離心或抽濾去掉未結合的PCR產物；
5) 再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結合的SA-PE;
6) 再向各孔加入75|ilTE懸浮液，振蕩使微球重懸；
7) 反應結束后土 LUMINEX檢測儀器進行檢測。例如使用Bio-plex 檢測設備，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發微球基質的染料從 而對微球編號進行識別，綠色激光對結合體的熒光蛋白進行識別，實現 捕獲探針捕獲的PCR產物的定量分析。


附圖為用探針Bp檢測類鼻疽核酸的劑量-反應曲線，即模板DNA的 量與發生反應的焚光信號值MFI之間的對應關系；橫軸代表PCR反應體 系中模板DNA的濃度(fg/test),縱軸代表熒光信號值MFI。
具體實施例方式
實施例l、基因液相芯片的制備
1.選取編碼微球，如034號，取約1.25xl()6個置于離心管，14000g 下離心，例如離心3-5分鐘，小心^及出上清液；
2. 加入50 fxl 0.1mol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩混勻。
3. 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到0.1mmol/L;將lpl稀釋的 探針Yp加于034號微球懸浮液中，振蕩混勻。
4. 加入2.5nl新鮮配制的10 mg/mL的EDC溶液至凝J求與4笨針混和液 中，振蕩，室溫孵育30分鐘。
5. 用0.02% PBST lml洗滌1次，離心14000g 3-5分鐘。
6. 移棄上清液，微球重懸于1 ml 0.1%SDS中，洗滌，離心。
7. 移棄上清液，微球重懸于lOOjil pH8.0 TE中，振蕩懸起混勻，即 得到偶聯好的檢測微球。
8. 用血球計數器計數微球的數量，換算出每種微球的單位濃度。
9. 把偶聯好的檢測微球放在4'C避光保存， 一般每種探針偶聯的微球 單獨保存，使用時，根據檢測項目選擇要混合的微球種類。
8實施例2、樣本核酸的提取
采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。具體如下
1) 向每管樣本中加入6mol/LNal lO(Hil，振蕩混勻，煮沸30分鐘。
2) 將上述煮沸處理的樣本于10000r/分鐘離心5分鐘，將上清液轉 至另 一含20%玻璃粉液的離心管中。
3) 充分混勻，置室溫10分鐘，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上 清液。
4) 向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1 ml，充分混勻，洗滌玻璃 粉，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。
5) 重復清洗一次后，放置于37。C恒溫箱使徹底干燥。
6) 向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20nlTE，充分混勻，65°C 加熱15分鐘。8000r/分鐘離心2分鐘，回收上清液備用。
實施例3、 PCR擴增
以回收的上清液作為PCR反應的模板，PCR反應體系以及反應條件 PCR體系
10 xPCR緩沖液:
Taq酶
dNTPs:
上游引物
下游引物
模板DNA:
雙蒸水ddH20:
反應條件
預變性
94°C
35個循環 94°C 58°C 72。C
3 |Lll
0.3|il 0.3|a1 O辜 0.3|iil
2|Lll
補足30pl
10分鐘
30秒 30秒 40秒延伸
72°C 7分鐘 同時設置PCR空白對照，如下
10xPCR緩沖液 3^1
Taq酶 0.3jil
dNTPs: 0.3jli1
上游引物 0.3|td
下游引物 0.3|xl
雙蒸水ddH20: 補足30)Li1
反應結束后以1%的瓊脂糖凝"交電泳4企查擴增情況。 實施例4、檢測
1. 取偶聯微球034號5000個混合，分裝于PCR管中(根據微球計 數結果計算相應加入量)
2. 向各管中加5 ~ 17|il上面的PCR產物使其終體積為50pl。
3. 95。C變性IO分鐘。
4. 45-60。C反應10~30分鐘。
5. 轉移至濾板抽濾去掉未結合的PCR產物。
6. 再向各孔加75(nl 4ng/nl SA-PE,室溫避光孵育IO分鐘，抽濾 去掉未結合的SA-PE。
7. 再向各孔加入75|11懸浮液，振蕩使微球重懸。
8. 反應結束后上枳i;險測。
9. Bio-plex檢測系統，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發 微球基質的染料從而對微球編號進行識別，綠色微球對表面結 合的焚光染料進行識別，實現捕獲探針捕獲的PCR產物的定 量分析。
在檢測時，同時以PCR陰性對照進行檢測做為檢測本底。對于每個 檢測體系和檢測本底，儀器輸出的數據是相應反應體系內一種編號微球 群的焚光強度中位值(Median Fluorescence Intensity，MFI)，亦即讀取的這 種編號的微球群(100個或以上)的每個微球信號強度的統計平均值。結 果判斷當待檢測樣本孔的MFI值為本次檢測背景信號強度三倍以上時即判為陽性。
實施例5、定量檢測
提取類鼻疽的基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀測定其濃度，進行 系列稀釋，PCR擴增后，同上面檢測步驟進行檢測，Bio-Plex Version 4.0 分析，擬合出劑量-反應曲線和曲線方程。樣本檢測值代入方程實現定量 檢測。 結果
針對類鼻疽的檢測，本發明設計了位于染色體標識序列的探針進行 檢測。提取類鼻疽基因組DNA測定濃度后進行10倍系列稀釋，9.6fg ~ 9.6xl06fg，按上述確定的方法進行PCR擴增和檢測，擬合曲線，得出曲 線方程
探針Bp的曲線方程FI =-2.20043 + (16806.9+ 2.20043)/((1 + (Cone
從標準曲線推算檢出限，本體系的檢出限為0.62pg/ test。 從上述結果可以得出，本發明的懸浮芯片和檢測方法具有以下優越
性
1. 靈敏較之于普通的多重PCR反應，本發明的靈敏度提高從以下 兩個方面體現1)檢測儀器存在信號的放大系統；2)PCR產物帶上的 生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結合的放大作用。
2. 特異采用核酸探針技術對標記上生物素的PCR產物進行特異性 的識別，而非傳統的電泳方法通過PCR產物片段大小進行識別。
3. 準確高效整合核酸體外擴增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素 標記、熒光檢測和流式細胞技術于一體，同時實現核酸樣品的檢測、鑒 定，使結果準確，工作高效。
4、 芯片制作方便只用設計好待檢目標菌的引物，優化PCR條件， 標記對應的探針于編碼微球，即可組裝成4企測體系。
5、 本發明涉及的方法同樣適用于其他病原體或目標物的核酸檢測。
6、 可實現多重檢測，待檢目標靈活可調可根據不同檢測目標，選擇 對應的引物和微球，組成不同目標組合的檢測體系。
權利要求
1.一種檢測類鼻疽(Burkholderia pseudomallei，B.p)的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應體系、鏈親和素-藻紅蛋白。
2. 權利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括<formula>formula see original document page 2</formula>下游引物5，端經生物素標記Bp-R: 5，-生物素曙CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
3.權利要求1所述的基因液相芯片，其中所述捕獲探針選自探針名稱探針序列(5，-3，)BpAGGTCAATTTCCCGAACAAGACT上面所述探針在合成時在5'端進行氨基修飾，并且連接15-20個T 或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進行偶聯。
4. 一種制備權利要求1任一項所述的基因液相芯片的方法，該方法包括(1) 選取編碼微球，取適量于離心管內，離心棄上清后，加入2-(n-嗎啉代) 乙磺酸溶液使之重懸；(2) 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針，即捕獲探針Bp稀釋，加至微球懸 浮液中，振蕩混勻；(3 )加入10 mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫 孵育30分鐘；(4) 用0.02。/。PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述《效球重懸 于0.1。/。SDS中，洗滌，離心；(5) 移棄上清液，微球重懸于pH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯好的檢測微球，得到所述的基因液相芯片。
5. 權利要求1-4任一項所述的類鼻疽檢測基因液相芯片的檢測方法， 該方法包括樣^4亥酸的提取，PCR擴增，4企測病原體核酸。
6. 權利要求5所述的方法，其中所述樣本核酸的提取包括以下步驟1) 向每管樣本中加入NaI,振蕩混勻，煮沸；2) 離心，轉上清液至另一含20%玻璃粉液的離心管中；3) 充分混勻，室溫放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；離心，小心傾 去上清液；4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混勻，離心，小心傾去上 清液；5) 重復步驟4)，然后置于37。C恒溫箱內干燥；6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中力口 TE，充分混勻，65。C加熱，離心， 回收上清液備用。
7. 權利要求4-6任一項所述的方法，其中所述檢測步驟包括1) 取上述偶聯微球，裝于PCR管中，根據微球計數結果計算相應加入量；2) 向各管中加5-17ji1上面的PCR擴增得到的產物，混勻； 3 ) 95°C變性10分鐘；隨后45 ~ 60。C反應10-30分鐘；4) 離心或抽濾去掉未結合的PCR產物；5) 再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結合的SA-PE;6) 再向各孔加入75(ilTE懸浮液，振蕩使微球重懸；上檢測儀器進行檢測。
全文摘要
本發明涉及一種檢測類鼻疽的基因液相芯片及其制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。本發明以類鼻疽染色體標識序列為靶序列，建立了類鼻疽液相芯片和檢測方法，為類鼻疽的檢測提供一條可行的途徑。
文檔編號C12R1/01GK101560561SQ20091008026
公開日2009年10月21日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者劉衡川, 孫肖紅, 宋亞軍, 文海燕, 宇 楊, 靜 王, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院