一種檢測布魯菌的基因液相芯片及其檢測方法

專利名稱：一種檢測布魯菌的基因液相芯片及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測布魯菌(^""ce〃a ^p.， Bn/)的基因液相芯片及其 制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。
背景技術：
液相芯片檢測是近幾年發展起來的新興技術，具有快速、特異、敏 感的特點。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏 色，作為IOO種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5nm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據 不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。
布魯菌是布魯菌病(brucellosic)的病原體，可感染人類、多種家畜和 野生動物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷，如發熱、流產與不育、十曼 性關節炎及神經損害等，而且引起的人類波狀熱、慢性感染至今無法根 治。因此，布病不僅損害人類健康，還影響著包括乳、肉及其制品、皮、 毛等在內的民生需求，導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題，是 傳統的生物戰劑之一。
布魯菌病的診斷除通過直接涂片染色鏡檢、分離培養外，也有免疫 學方法如正LISA、 cELISA等。近年來，布魯菌分子生物學檢測方法如 PCR、實時熒光PCR也飛速發展。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測布魯菌的基因液相芯片，該基因液相 芯片可以用于病原體布魯菌的檢測。本發明還提供利用所述的基因液相 芯片進行檢測的方法。
經過深入和大量的研究和實驗，本發明以布魯菌5CSi^基因特異序 列為耙序列，建立了布魯菌的基因液相芯片和檢測方法，為該菌的檢測提供一條可行的途徑。
本發明所述的基因液相芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引 物、PCIL良應體系、鏈親和素一藻紅蛋白。
本發明的PCR^應體系包括10xPCR緩沖液、dNTPs、 TaqDNA聚合酶。
本發明的引物包括:
耙組織引物序列(5，國3，)基因位 置長 度產物大 小
布魯菌Bru誦FTGGCTCGGTTGCCAATATCAABCSP3121223
Bru -RGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG20
其中，下游引物是5'生物素標記的Bru-R，具體例如是Ft-R: 5，-生物 素-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG
本發明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性:
探針 名稱探針靶位探針序列(5，-3,)
Bru布魯菌BC5P37基因的 842-864bpTTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT
本發明中，所述捕獲探針在合成時在5'端進行氨基修飾，并且連接 15-20個T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進行偶 聯。
本發明的微球， 一般選擇熒光編碼的微球，例如來源于Luminex或 其他代理公司的任何編號的微球，特異性探針與焚光編碼孩"求偶聯形成 檢測微球，由此構成檢測芯片。
本發明的鏈親和素-藻紅蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin ， SA-PE ) 為一種熒光蛋白，能被液相芯片檢測系統中的綠色激光激發發光，由此 可以進行定性或定量檢測。
本發明涉及上述基因液相芯片的制備方法，該方法包^^:
1. 選取編碼微球，取適量例如約1.25x 106個于離心管內，離心棄上清 后，加入一定量，例如0.1mol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液使之重懸；
2. 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針(即捕獲探針Bru)稀釋，加至微球 懸浮液中，振蕩混勻；
53. 加入例如10 mg/mL的EDC ( l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亞胺 鹽酸鹽)溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育例如30
分鐘；
4. 用例如0.02%的PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述孩t 球重懸于例如1 ml的0.1% SDS (即十二烷基磺酸鈉)中，洗滌，離
5. 移棄上清液，微球重懸于例如100itil的pH8.0TE中，振蕩懸起混勻， 得到偶聯好的檢測微球，即本發明的基因液相芯片，4。C避光保存。
另 一方面，本發明還涉及上述布魯菌檢測基因液相芯片的檢測方法， 該方法包括樣本核酸的提l^， PCR擴增，；險測病原體。本發明對上述 三個步驟的操作和條件進行了改進和優化。
本發明的樣本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核 酸。例如，具體步驟如下
1) 向每管樣本中加入6mol/LNal，振蕩混勻，煮沸；
2) 離心，轉上清液至另一含20%玻璃粉液的離心管中；
3) 充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上； 8000r/分鐘離心，小心傾去上清液；
4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/o乙醇l ml,充分混勻，離心， 小心傾去上清液；
5) 重復步驟(4)，然后置于37。C恒溫箱內干燥；
6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20jxlTE，充分混勻，65°C 加熱，離心，回收上清液備用。
本發明的PCR擴增包括，以上述核酸提取步驟中制備的上清液作為 PCR反應的模板，采用PCR反應體系以及反應條件。 本發明的PCR體系例如是
10xPCR緩沖液 3^1
Taq DNA聚合酶 0.3^1
dNTPs: 0.3 (il
上游引物 0.3|ul
下游引物 0.3pl 模板DNA: 2jxl雙蒸水ddH20: 補足30inl
反應條件
預變性
94-96。C 10分鐘
35個循環
94-96°C 30-40秒 55-58。C 30-40秒 72 。C 30-40秒
延伸
72 °C 4-7分4中
同時，PCR空白對照品為如下
10xPCR緩沖液 3 pl
Taq酶 0.3|iil dNTPs: 0.3 |il
上游引物 0.3(^1 下游引物 0.3nl 雙蒸水ddH20: 補足30ji1
反應結束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。 本發明的檢測方法，優選是
1) 取上述兩種偶聯微球混合，裝于PCR管中，根據微球計數結 果計算相應加入量，使每種樣i球的量相同，每次反應每種 3000-5000個；
2) 向各管中加5-17pl上面的PCR擴增得到的產物，混勻；
3) 95。C變性10分鐘；隨后45 ~ 60。C反應10 ~ 30分鐘；
4) 離心或抽濾去掉未結合的PCR產物；
5) 再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結合的SA-PE;
6) 再向各孔加入75iiilTE懸浮液，振蕩使微球重懸；
7) 反應結束后上LUMINEX檢測儀器進行檢測。例如使用Bio-plex 檢測設備，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發微球基質的染料從 而對微球編號進行識別，綠色激光對結合體的熒光蛋白進行識別，實現 捕獲探針捕獲的PCR產物的定量分析。


附圖為用探針Bru檢測布魯菌核酸的劑量-反應曲線，即模板DNA 的量與發生反應的熒光信號值MFI之間的對應關系；橫軸代表PCR反應 體系中模板DNA的濃度(fg/test)，縱軸代表熒光信號值MFI。
具體實施例方式
實施例l、基因液相芯片的制備
1.選取編碼微J求，如025號，取約1.25xl()6個置于離心管，14000g 下離心，例如離心3-5分鐘，小心吸出上清液；
2. 加入50 (il O.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩混勻。
3. 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到O.lmmol/L;將lpl稀釋的 探針Bru加于025號微球懸浮液中，振蕩混勻。
4. 加入2.5^1新鮮配制的10 mg/mL的EDC溶液至孩U求與揮:針混和液 中，振蕩，室溫孵育30分鐘。
5. 用0.02% PBST lml洗滌l次,離心14000g 3-5分鐘。
6. 移棄上清液，微球重懸于1 ml0.1%SDS中，洗滌，離心。
7. 移棄上清液，微球重懸于lOOpl pH8.0 TE中，振蕩懸起混勻，即 得到偶聯好的檢測微球。
8. 用血球計數器計數微球的數量，換算出每種微球的單位濃度。
9. 把偶聯好的檢測微球放在4。C避光保存， 一般每種探針偶聯的微球 單獨保存，使用時，根據檢測項目選擇要混合的微球種類。
實施例2、樣本核酸的提取
采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。具體如下
1) 向每管樣本中加入6mol/LNal 100pl，振蕩混勻，煮沸30分鐘。
2) 將上述煮沸處理的樣本于10000r/分鐘離心5分鐘，將上清液轉 至另 一含20%玻璃粉液的離心管中。
3) 充分混勻，置室溫10分鐘，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上 清液。
4) 向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1 ml，充分混勻，洗滌玻璃 粉，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。5) 重復清洗一次后，放置于37。C恒溫箱使徹底干燥。
6) 向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混勻，65°C 加熱15分鐘。8000r/分鐘離心2分鐘，回收上清液備用。
實施例3、 PCR擴增
以回收的上清液作為PCR反應的模板，PCR反應體系以及反應條件: PCR體系
10 xPCR緩沖液
Taq酶
dNTPs:
上游引物
下游引物
模板DNA:
雙蒸水ddH20:
反應條件
預變性
94 。C
35個循環
94。C
58°C
72。C
延伸
72 °C
3 (il 0.3|nl 0.3 jil 0.3|til 0.3|ul
補足30j^1
10分鐘
30秒 30秒 40秒
7分鐘
同時設置PCR空白對照，如下
10xPCR緩沖液 3^1
Taq酶 0辜
dNTPs: 0.3 pi
上游引物 0.3nl
下游引物 0.3pl
雙蒸水ddH20: 補足30(al
反應結束后以1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。實施例4、檢測
1. 取偶聯微球025號各5000個混合，分裝于PCR管中(根據微球 計數結果計算相應加入量)
2. 向各管中加5 ~ 17^1上面的PCR產物使其終體積為50(1l。
3. 95。C變性IO分鐘。
4. 45 ~ 60。C反應10 ~ 30分鐘。
5. 轉移至濾板抽濾去捧未結合的PCR產物。
6. 再向各孔加75(il 4ng/|iil SA-PE，室溫避光孵育IO分鐘，抽濾 去掉未結合的SA-PE。
7. 再向各孔加入75inl懸浮液，振蕩使微球重懸。
8. 反應結束后上纟;U^測。
9. Bio-plex檢測系統，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發 微球基質的染料從而對微球編號進行識別，綠色微球對表面結 合的熒光染料進行識別，實現捕獲探針捕獲的PCR產物的定 量分析。
在檢測時，同時以PCR陰性對照進行檢測做為檢測本底。對于每個 檢測體系和檢測本底，儀器輸出的數據是相應反應體系內一種編號微球 群的焚光強度中位值(Median Fluorescence Intensity,MFI )，亦即讀取的這 種編號的微球群(IOO個或以上)的每個微球信號強度的統計平均值。結 果判斷當待檢測樣本孔的MFI值為本次檢測背景信號強度三倍以上時 即判為陽性。
實施例5、定量檢測
提取布魯菌的基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀測定其濃度，進行 系列稀釋，PCR擴增后，同上面檢測步驟進行檢測，Bio-Plex Version 4.0 分析，擬合出劑量-反應曲線和曲線方程。樣本檢測值代入方程實現定量 檢測。
結果
針對布魯菌的檢測，本發明設計了位于染色體5CS尸37基因的探針進行檢測。提取布魯菌基因組DNA測定濃度后進行10倍系列稀釋， 10fg~108fg,按上述確定的方法進行PCR擴增和檢測，擬合曲線，得出 曲線方程
探針Bru的曲線方程
FI =2.66921 + (2535.28-2.66921) / (1 + (Cone / 1.902E+006)畫28)
從標準曲線計算出檢出限，本發明的檢出限為24pg/test。
從上述結果可以得出，本發明的懸浮芯片和;f企測方法具有以下優越
性
1. 靈敏較之于普通的多重PCR反應，本發明的靈敏度提高從以下 兩個方面體現1)檢測儀器存在信號的放大系統；2)PCR產物帶上的 生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結合的^t大作用。
2. 特異采用核酸纟笨針^a術對標記上生物素的PCR產物進行特異性 的識別，而非傳統的電泳方法通過PCR產物片段大小進行識別。
3. 準確高效整合核酸體外擴增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素 標記、熒光檢測和流式細胞技術于一體，同時實現核酸樣品的檢測、鑒 定，使結果準確，工作高效。
4. 芯片制作方便只用設計好待檢目標菌的引物，優化PCR條件， 標記對應的探針于編碼微球，即可組裝成檢測體系。
5. 本發明涉及的方法同樣適用于其他病原體或目標物的核酸檢測。可 實現多重檢測，待檢目標靈活可調可根據不同檢測目標，選擇對應的 引物和微球，組成不同目標組合的檢測體系。
權利要求
1.一種檢測布魯菌(Brucella spp.，Bru)的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應體系、鏈親和素-藻紅蛋白。
2. 權利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括Bru-FTGGCTCGGTTGCCAATATCAABru -RGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG下游引物5，端經生物素標記Bru -R: 5，誦生物素-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG。
3.權利要求1所述的基因液相芯片，其中所述捕獲探針選自探針名稱4笨針序列(5，-3，)BruTTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT上面所述探針在合成時在5'端進行氨基修飾，并且連接15-20個T 或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進行偶聯。
4. 一種制備權利要求l-3任一項所述的基因液相芯片的方法，該方法包 括1) 選取編碼微球，取適量于離心管內，離心棄上清后，加入2-(n-嗎啉代) 乙磺酸溶液使之重懸；2) 用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針，即捕獲探針Bru稀釋，加至微球懸 浮液中，振蕩混勻；3) 加入EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育；4) 用0.02。/。PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述微球重懸 于0.1。/。SDS中，洗滌，離心；5) 移棄上清液，微球重懸于pH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯好 的檢測微球，得到所述基因液相芯片。
5. 利用權利要求1-3任一項所述的基因液相芯片檢測布魯菌的方法， 該方法包括樣本核酸的提取，PCR擴增，檢測病原體核酸。
6. 權利要求5所述的方法，其中所述樣本核酸的提取包括以下步驟1) 向每管樣本中加入NaI，振蕩混勻，煮沸；2) 離心，轉上清液至另一含20%玻璃粉液的離心管中；3) 充分混勻，室溫放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；離心，小心傾 去上清液；4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混勻，離心，小心傾去上 清液；5) 重復步驟4),然后置于37。C恒溫箱內干燥；6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加TE,充分混勻，65。C加熱，離心， 回收上清液備用。
7. 權利要求5或6所述的方法，其檢測步驟包括1) 取上述偶聯微球，裝于PCR管中，根據微球計數結果計算相應加入 量；2) 向各管中加5~17^1上面的PCR擴增得到的產物，混勻； 3 ) 95°C變性10分鐘；隨后45 ~ 60。C反應10-30分鐘；4) 離心或抽濾去掉未結合的PCR產物；5) 再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結合的SA-PE;6) 再向各孔加入75plTE懸浮液，振蕩使微球重懸；上檢測儀器進行檢測。
全文摘要
本發明涉及一種檢測布魯菌的基因液相芯片及其制備方法。本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。本發明以BCSP31特異基因為靶序列，建立了布魯菌液相芯片和檢測方法，為布魯菌的檢測提供一條可行的途徑。
文檔編號C12Q1/68GK101560563SQ20091008026
公開日2009年10月21日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者劉衡川, 孫肖紅, 文海燕, 宇 楊, 靜 王, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院