專利名稱：：乙醇發酵厭氧高溫菌培養基,其制備方法和其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體地，涉及用豆腐渣或與豆腐渣成分類似的物質為乙醇發酵厭氧高溫菌培養基營養物質的微生物培養基，及其制作方法、培養方法以及利用上述方法的乙醇發酵技術，豆腐渣及含其的培養基在生產乙醇和培養乙醇發酵厭氧菌中的應用。
背景技術：
：微生物培養基是{生物生長繁殖所需的一組人工配制的營養物質，它必需含有微生物生命活動所必需的水分、碳源、氮源和無機鹽類等基本營養物質。部分乙醇發酵高溫厭氧菌，如熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)和嗜熱乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus)等屬于生長因子異養型微生物(auxoheterotrophs)。它們除需要上述的基本營養物質外還必需添加某些特殊的生長因子才能使其正常生長繁殖并生物合成特定的代謝產物。目前主要以蛋白胨和酵母抽提物作為氮源和生長因子，得以,其微生物的生長繁殖和乙醇發酵的代謝活性。但是由于酵母提取物和蛋白胨的原料來源有限、不易取材、價格昂貴等原因，不適合作為工業發酵培養基的原料。探索利用廉價且容易取材的原料，開發一種經濟可行、適合于大規模工業發酵的乙醇發酵高^R氧菌的培養基，并利用該培養基開發低成本的乙醇發酵高MM氧菌的培養方法和乙醇生產的技術具有重要的應用前景。迄今，現有乙醇發酵高MM氧菌的培養技術中未有利用豆腐渣作為培養基原料的報道。
發明內容本發明的目的是提供一種用豆腐渣為培養基營養物質的微生物培養基，乙醇發酵高,氧菌的培養基及其制作方法、培養方纟去以及利用上述方法的乙醇發酵技術，豆腐渣及含其的培養基在生產乙醇和培養乙醇發酵厭氧菌中的應用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案乙醇發酵厭氧高溫菌培養基，用豆腐渣或與豆腐渣成分類似的物質為乙醇發酵厭氧高溫菌培養基營養物質。所述豆腐渣包括豆腐渣原有的成分和豆腐渣的固體或液體成分的任何部分。豆腐渣在培養基溶液中的重量比濃度范圍為(1)添加含水量65-85%的豆腐渣原液時基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-6.0%;(2)添加經干燥處理的豆腐渣時，按豆腐渣干重換算后在基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-1%。所述豆腐渣包括未經任何處理的豆腐渣原料和利用下列(D-③方法之一進行預處理的豆腐渣；O)物理法預處理:干燥、研磨、粉碎、加熱、蒸氣爆破等；②化學法:酸處理、堿處理和酸堿分步處理；③進行結合上述化學法和物理法進行的綜合性預處理。所述與豆腐渣成分類似的物質包括但不限于豆腐、豆乳。所述的乙醇發酵厭氧高、溫菌培養基，在常規基礎培養基上添加含水量65-85%的豆腐渣原液，使其在基礎培養基中的重量比濃度范圍為O.1-6.0%;或添加經^P燥處理的豆腐渣，按豆腐渣干重換算后在基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-1%。所述的乙醇發酵厭氧高溫菌培養基，每升培養基中各組分的含量為蛋白胨0-10g;微結晶纖維素或葡萄糖2-100g;六水氯化鎂0.5-2g;二水氯化鋅0.075-0.3g;六水硫酸亞鐵0.62-2.5mg;磷酸二氫鉀0.75-3.0g;磷酸氫二鉀1.5-6.0g;鹽酸半胱氨酸O.25-1.0g;刃天青O.25-2.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，分別配制為含有豆腐渣0.1-6.0%重量比濃度的培養基。所述的乙醇發酵厭氧高溫菌培養基，每升培養基中各組分的含量為蛋白胨10g;微結晶纖維素或葡萄糖5g;六水氯化鎂lg;二水氯化l丐0.15g;六水硫酸亞5鐵1.25mg;磷酸二氫鉀1.5g;磷酸氫二鉀3.0g;鹽酸半胱氨酸0.5g;刃天青1.0mg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，分別配制為含有豆腐渣O.5%-4%重量比濃度的培養基。本發明乙醇發酵厭氧高纟顯菌培養基在培養乙醇發酵厭氧菌中的應用。本發明乙醇發酵厭氧高溫菌培養基在生產乙醇中的應用。本發明在沒有添加任何維生素類和酵母提取物等生長因子、并降低蛋白胨含量的標準培養基中添加不同量的豆腐渣作為乙醇發酵高溫厭氧菌的培養基。本發明中作為培養基營養物質的豆腐渣可包括(1)使用豆腐制作過程中將豆漿過濾后分離的，含7jC分(一般含水量為70-80%)的豆渣原液成分。(2)使用上述豆腐渣的固體成分或液體成分。(3)使用經過下列①-③方法進行預處理的豆腐渣。①經過干燥、研磨、粉碎、加熱、蒸氣爆破等物理法預處理的豆腐渣;②經過:酸處理、堿處理和酸堿分步處理等化學法預處理的豆腐渣；③結合上述化學、法和物理法進行綜合性預處理的豆腐渣。(4)使用與豆腐渣成分類似的物質如豆腐、豆乳等。調整pH值為5-8的，培養基成分，通過煮沸驅氧、氣層置換等物理法或利用催化劑等化學方法制作厭氧培養基后分裝到厭氧試管或各種厭氧發酵罐中，高溫高壓滅菌處理，可作為乙醇發酵高溫厭氧菌的培養或高t顯乙醇發酵工業所使用。本發明在上述培養基中接種乙醇發酵高M^氧菌，在60攝氏度下厭氧培養96小時后測定菌體的600nm光密度(opticaldensity,0D柳)和培養液中的乙醇含量。并與用酵母提取物為營養成分的培養基進行了比較分析，評價了豆腐渣的促進效果。結果表明，豆腐渣對乙醇發酵高溫厭氧菌的生長繁殖和乙醇生成的促進效果等同或高于酵母提取物。證實了豆腐渣可以取代酵母提取物和蛋白胨作為乙醇發酵高MJ^氧菌的培養基的營養原料。通過本發明的技術方案，本發明達到了研制成功一種價格低廉、質量穩定、易于大量取材的培養基原料，從而提供乙醇發酵厭氧高溫菌的低成本培養基的審U作方6法以及利用該培養基的菌種培養和乙醇發酵技術的目的。由于豆腐渣中仍然殘留豐富的植物纖維、粗蛋白、礦物質、維生素類等營養物質，是一種含水量高、容易腐壞、不易儲存和運輸的食品副產物，能開發為工業發酵微生物培養基原料。因此本發明在嘗試了利用豆腐渣作為培養基營養物質的可適性研究的基礎上，經試驗結果表明，豆腐渣對該類微生物的乙醇發酵代謝和生長繁殖具有促進作用，可取代酵酵母粉和蛋白胨成為培養基的營養原料。本發明利用豆腐渣取代價格昂貴的酵母提取物和蛋白胨，開發為乙醇發酵高皿氧菌培養基的營養原料，不僅能降低高溫乙醇發酵工藝的培養基成本，還能夠{腿食品副產物的再利用，從而為推動環境友好型的循環經濟的發展。具體實施例方式以下所列舉的實施例是為進一步解釋本發明的內容及其效果，不應視為對本發明范圍的限制。實施例l:豆腐渣作為營養物質的培養效果豆腐渣營養原液的配制稱量20g豆腐渣(濕重)，加入80ml純水中，攪拌均勻后用適量的NaOH溶液將pH值調整為7，作為豆腐渣營養原液備用。本試驗使用的豆腐渣是未經任何加工或處理的原料，其水分含量為75%。乙醇發酵高溫厭氧菌的基本培養基的配制將下列組分溶解于l升純水中，用NaOH溶液將pH值調整為7，作為高溫菌培養試驗的基礎培養基溶液備用。培養基組分蛋白胨(p印tone):10g;酵母提取物(Yeastextract):Og;微結晶纖維素(Avicel)或葡萄糖(Glucose):5g;六水氯化鎂(MgCl2'6H20):lg;二水氯化鋅(CaCl2'2H20):0.15g;六水硫酸亞鐵(FeS(V6H20):1.25mg;磷酸二氫鉀(KH2P04):1.5g;磷酸氫二鉀(K2HP04):3.0g;鹽酸半胱氨酸(Cysteine-HC1'H20):0.5g;刃天青(Resazurin):lmg。■7在基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，分別配制為豆腐渣重量比濃度為含有0.5%、1%、2%、4%的培養試驗用培養基溶液，經過煮沸驅氧和銅柱除氧法將10ml培養基分裝到螺口厭氧試管中，然后用高壓滅菌鍋在攝氏12(TC條件下進行滅菌處理30分鐘。將其作為高溫菌培養試驗的厭氧培養基。將指數生長期的熱纖梭菌(ClostridiumthermocellumATCC27405)和嗜熱乙醇桿菌(ThermoanaerobacterethanolicusATCC31550)培養液各0.2ml分別接禾中到以微結晶纖維素或葡萄糖為碳源的上述培養試驗用培養基中，在6(TC恒溫培養箱中靜直培養96小時。培養液供ODJ及光度的觀l淀和乙醇生成量(mM)的分析。結果如表1所示。如表1所示，培養基中的豆腐渣的重量比高于0.5%時，具有明顯促進細菌的生長繁殖并提高乙醇轉換率的效果。但是，將培養基中的豆腐渣的濃度(比重量)從0.5%提高到4%時，培養夜中菌體ODJ直和乙醇生成量都沒有顯著的變化。表l培養基添加豆腐渣為營養原料的皿添加豆腐渣的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨:5g;微結晶纖維素或葡萄糖50g;六水氯化鎂2g;二水氯化銬0.3g;六水硫酸亞鐵2.5mg;磷酸二氫鉀3.0g;磷酸氫二鉀6.0g;鹽酸半胱氨酸1.0g;刃天青2.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，配制為含有豆腐渣4.0%重量比濃度的培養基。實施例3:使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨10g;微結晶纖維素或葡萄糖100g;六水氯化鎂lg;二水氯化轉0.15g;六水硫酸亞鐵1.25mg;磷酸二氫鉀0.75g;磷酸氫二鉀5.Og;鹽酸半胱氨酸0.5g;刃天青1.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，配制為含有豆腐渣3.0%重量比濃度的培養基。實施例4:使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨4g;微結晶纖維素或葡萄糖20g;六水氯化鎂0.5g;二水氯化轉0.25g;六水硫酸亞鐵2.5mg;磷酸二氫鉀2.Og;磷酸氫二鉀3.Og;鹽酸半胱氨酸0.25g;刃天青0.5mg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，配制為含有豆腐渣2.0%重量比濃度的培養基。實施例5:使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨:3g;微結晶纖維素或葡萄糖40g;六7jC氯化鎂1.5g;二7j^氯化韓0.1g;六7jC硫酸亞鐵1.25mg;磷酸二氫鉀1.25g;磷酸氫二鉀1.75g;鹽酸半胱氨酸O.5g;刃天青1.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，配制為含有豆腐渣6.0%重量比濃度的培養基。實施例6:9使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨-4g;微結晶纖維素或葡萄糖20g;六水氯化鎂0.5g;二水氯化轉0.25g;六水硫酸亞鐵2.5mg;磷酸二氫鉀2.Og;磷酸氫二鉀3.Og;鹽酸半胱氨酸0.25g;刃天青0.5mg;在上述基礎培養液中加入豆腐營養原液，配制為含有豆腐2.0%重量比濃度的培養基。實施例7:使用的方法與實施例1相同，區別在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨:3g;微結晶纖維素或葡萄糖40g;六水氯化鎂1.5g;二水氯化轉0.lg;六水硫酸亞鐵1.25mg;磷酸二氫鉀1.25g;磷酸氫二鉀1.75g;鹽酸半胱氨酸0.5g;刃天青1.Omg;在上述基礎培養液中加入豆乳營養原液，配制為含有豆乳6.0%重量比濃度的培養基。實施例8:對比試驗例酵母提取物作為營養物質的培養效果酵母提取物原液的配制稱量10g酵母提取物(粉末)，加入90ml純水中，攪拌均勻后用適量的NaOH溶液將pH值調整為7，作為酵母提取物原液備用。乙醇發酵高溫菌的基本培養基的配制:將下列組分溶解于1升純水中，用NaOH溶液將pH值調整為7，作為高溫菌培養試驗的基礎培養基溶液備用。培養基組分蛋白胨(P印tone):10g;微結晶纖維素(Avicel)或葡萄糖(Glucose):5g;六水氯化鎂(MgCl2'6H20):lg;二7JC氯化轉(CaCl2'2H20):0.15g;六水硫酸亞鐵(FeS(V6H20):1.25mg;磷酸二氫鉀(KH2P04):0.15g;磷酸氫二鉀(K2HP04):7.0g;鹽酸半胱氨酸(Cysteine-HC1*H20):0.75g;刃天青(Resazurin):0.5mg。在基礎培養液中加入酵母提取物原液，分別配制成重量比含量為0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的培養試驗用培養基溶液，經過煮沸驅氧和銅柱除氧法將10ml培養基分裝到螺口厭氧試管中。然后用高壓滅菌鍋在攝氏12(TC條件下進行滅菌處理30^l巾。將其作為高溫菌培養試驗的厭氧培養基。將指數生長期的熱纖梭菌(ClostridiumthermocellumATCC27405)和嗜熱乙醇桿菌(ThermoanaerobacterethanolicusATCC31550)培養液各0.2ml分別接禾中到以微結晶纖維素或葡萄糖為碳源的上述培養試驗用培養基中，在6CTC恒溫培養箱中靜直培養96小時。培養液供(XU吸光度的測定和乙醇生成量(mM)的分析。結果如表2所示。表2培養基添加酵母提取物為營養原料的效果添加酵母提取物的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表2所示，培養基中的酵母提取物濃度(比重量)高于0.2%時，具有明顯促進細菌的生長繁殖并提高乙醇生成量的效果。但是，將培養基中的酵母提取物濃度(比重量)從0.4%提高到1.6%時，培養夜的OD^值和乙醇生成量都沒有顯著的變化。本發明在實施例中所配帝啲以豆腐渣為營養原料的培養基具有等同或優越于目前普遍使用的以蛋白胨和酵母提取物(比較柳，具有促進乙醇發酵高^R氧菌的生長繁殖和提高乙醇生成量的效果。權利要求1、乙醇發酵厭氧高溫菌培養基，其特征在于用豆腐渣或與豆腐渣成分類似的物質為乙醇發酵厭氧高溫菌培養基營養物質。2、如權利要求1所述的培養基，其特征在于所述豆腐渣包括豆腐渣原有的成分和豆腐渣的固體或液體成分的任何部分。3、如權利要求1或2所述的培養基，其特征在于豆腐渣在培養基溶液中的重量比濃度范圍為(1)添加含水量65_85%的豆腐渣原液時基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-6.0%;(2)添加經TM處理的豆腐渣時，按豆腐渣干重換算后在基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-1%。4、如權利要求1至3之一所述的培養基，其特征在于所述豆腐渣包括未經任何處理的豆腐渣原料和利用下列(D-③方法之一進行預處理的豆腐渣；(D物理法預處理:干燥、研磨、粉碎、加熱、蒸氣爆破等；②化學法:酸處理、堿處理和酸堿分步處理；③進行結合上述化學法和物理法進行的綜合性預處理。5、如權利要求1所述的培養基，其特征在于所述與豆腐渣成分類似的物質包括但不限于豆腐、豆乳。6、如權利要求1所述的培養基，其特征在于在常規基礎培養基上添加含水量65-85%的豆腐渣原液，使其在基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-6.0%;或添力口經干燥處理的豆腐渣，按豆腐渣干重換算后在基礎培養基中的重量比濃度范圍為0.1-1%。7、如權利要求1所述的培養基，其特征在于每升培養基中各組分的含量為蛋白胨0-10g;微結晶纖維素或葡萄糖2-100g;六水氯化鎂0.5_2g;二水氯化銬0.075-0.3g;六水硫酸亞鐵0.62-2.5mg;磷酸二氫鉀0.75-3.Og;磷酸氫二鉀L5-6.0g;鹽酸半胱氨酸0.25-l.Og;刃天青0.25-2.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，分別配制為含有豆腐渣O.1-6.0%重量比濃度的培養基。8、如權利要求1或6所述的培養基,其特征在于每升培養基中各組分的含量為:蛋白胨10g;微結晶纖維素或葡萄糖5g;六水氯化鎂lg;二水氯化轉0.15g;六水硫酸亞鐵1.25mg;磷酸二氫鉀1.5g;磷酸氫二鉀3.0g;鹽酸半胱氨酸O.5g;刃天青1.Omg;在上述基礎培養液中加入豆腐渣營養原液，分別配制為含有豆腐渣0.5%-4%重量比濃度的培養基。9、權利要求l的乙醇發酵厭氧高溫菌培養基在培養乙醇發酵厭氧菌中的應用。10、權利要求l的乙醇發酵厭氧高溫菌培養基在生產乙醇中的應用。全文摘要本發明公開一種用豆腐渣為培養基營養物質的微生物培養基，提供利用豆腐渣作為培養基營養物質的乙醇發酵高溫厭氧菌的培養基及其制備方法，豆腐渣及含其的培養基在生產乙醇和培養乙醇發酵厭氧菌中的應用。添加含水量75％的豆腐渣在培養基中的重量比濃度不低于0.5％時，可取代目前培養技術中利用的蛋白胨和酵母提取物作為培養基營養物質，達到促進厭氧高溫菌的生長繁殖并提高乙醇發酵代謝的效果。提供適用于該類微生物的低成本培養基以及應用該培養基的微生物培養方法和乙醇生產的技術。文檔編號C12N1/20GK101497871SQ20091009416公開日2009年8月5日申請日期2009年3月9日優先權日2009年3月9日發明者伊日布斯,尚淑梅,李昆志,趙立峰,陳麗梅申請人:昆明理工大學