專利名稱：：一種葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫學檢驗領域中的一種分析試劑，具體涉及一種用于測定葡萄糖含量的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑。
背景技術：
：在眾多的研究結果表明，全球糖尿病發病率增長迅速，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者已超過l.2億人，我國患者人群居世界第二。由于糖尿病是終身性疾病，對于已確診糖尿病的患者，為控制和延緩病情的發展、減少并發癥的發生，必須定期、不定期測量血糖，作為醫院血常規項目之一，如何快速、準確檢測血液中葡萄糖含量有著積極意義。血液中葡萄糖含量酶法測定方法主要有己糖激酶法、葡萄糖脫氫酶法、氧化酶法、酶電極、血糖儀等。其中，己糖激酶法、葡萄糖脫氫酶法試劑存在價格昂貴(氧化酶法的2-3倍)，不能在可見光范圍檢測；而酶電極法不普及,無法在臨床生化分析儀上組合檢測；而血糖儀雖然微量方便，但只能作定性檢測；葡萄糖氧化酶法經濟、準確，是目前應用最廣泛的測定血糖的方法，但常見的以苯酚為色原的葡萄糖氧化酶法混合試劑很不穩定，酶酚混合試劑在冰箱只能存放1個月(參考《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》，P360-361衛生部醫政司編制，東南大學出版社2006年11出版)，且適用波長范圍窄，因此，目前市面上實際應用的葡萄糖氧化酶法試劑常以凍干試劑或者液體雙試劑方式來延長保存期，但是，由于血糖為常規項目試劑用量大，更換頻率高，雙試劑占用儀器的試劑艙位多、容易錯位、另外儀器損耗引起雙試劑配比不平衡而造成試劑浪費較大，而凍干試劑復溶對醫院用戶帶來額外的工作量、復溶更容易二次污染等影響檢驗質量、效率，此外市面上含有苯酚的葡萄糖氧化酶法試劑對操作人員、設備、環境都會有較大的危害和污染。
發明內容本發明的目的是為了解決上述技術的不足之處，提供一種能以單一液體狀態存在并具有優良的穩定性和靈敏度、并具有檢測波長范圍廣的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑。為實現上述目的，本發明的技術方案是在本發明所采取的技術方案其為單一液體形式，且其組分與配比為葡萄糖氧化酶l-50KU/L;過氧化物酶0.5-50KU/L;4-氨基安替比林0.1-20mmol/L;硫酸鈉1-200g/L;3-嗎啉丙磺酸5-500mmol/L;高敏復合色原0.05-10g/L;防腐劑0.05-20g/L;緩沖液pH5.0-8.0。作為對上述方案的進一步補充，所述的高敏復合色原指在500-600nm的毫摩爾消光系數都能大于13升*毫摩爾"*厘米"，本發明可以是3，5-二氯-2-羥基苯磺酸鈉(DBHS)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉(T0PS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(了008)、^^二(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽(TODB)等水溶性顯色劑的中的兩種或兩種以上組合。本發明采用高敏復合色原替代傳統的葡萄糖氧化酶法試劑的苯酚，不僅避免了苯酚對操作人員、設備、環境都會有較大的危害和污染，而且還采用多種色原復合使得本發明的試劑檢測波長范圍相比于傳統的苯酚類的葡萄糖氧化酶法試劑更廣，提高了靈敏度和適應性，此外本發明結合高敏復合色原和硫酸鈉與3-嗎啉丙磺酸，可以使本發明的試劑以穩定地單試劑形式存在至少一年時間，克服傳統的葡萄糖氧化酶法試劑的穩定性不佳以及因雙試劑形式而存在的復配以及操作不便和易引起操作污染的缺陷。進一步設置是所述的緩沖液可以為但不限于磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、Good，S生物緩沖液，其pH為5.0-8.0。本發明優選采用磷酸鹽緩沖液作為緩沖液。進一步設置是所述的防腐劑可以是PROCLIN系列防腐劑、疊氮鈉、慶大霉素、氯霉素、對羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽、陽離子表面活性劑等，用量為0.0520g/L，在保質期內抑制微生物的生長，防止試劑失效。進一步設置是還可以含有蛋白穩定劑、多元醇、氨基酸、螯合劑、二價金屬離子、非離子表面活性劑。所述的多元醇、蛋白類穩定劑、氨基酸、螯合劑、二價金屬離子，可以是單獨使用，也可以是組合使用。其中多元醇可以是甘油、乙二醇、丙二醇、二甘醇等，用量為1500g/L，多元醇可以和水相互間形成堅強的氫鍵，降低水分子的活力，保持酶活性的三維結構。蛋白類穩定劑可以是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等，用量為1幽g/L，蛋白類穩定劑可以和試劑中酶分子作用，減少離解為亞基或變性失活。氨基酸可以是賴氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸等及其鹽，用量為0.1500g/L，氨基酸可以協助保護酶蛋白質氨基酸核心序列的構想完整性，提高穩定性。螯合劑有乙二胺四乙酸(EDTA)、亞氨基二乙酸、氮三乙酸和二乙基三胺五乙酸、2-環己二胺四乙酸、乙二醇雙(a-氨基乙酸)醚四乙酸、乙基乙二胺三乙酸等及其鹽類，用量為0.05100g/L，絡合試劑中微量重金屬，防止抑制酶活性。其中二價金屬離子可以是鎂、鈣、錳、鈉、銨、鉀、銅離子等，用量為0.01100g/L，作為酶的輔助因子，維持酶的構象。非離子表面活性劑可以是吐溫系列、TritonX系列等非離子表面活性劑，用量可以是0.01-10%，起到主要增溶、澄清、防止水溶液游離氧等作用。本發明的基礎葡萄糖氧化酶測定試劑的基本原理1、葡萄糖+02葡萄糖氧化醇>葡萄糖酸+112022、11202+4-氨基安替比林+高敏復合色原過氧化物醒〉紅紫色染料十H20將最終反應物置生化分析儀下檢測波長500-600nm處的吸光度變化，即可測算出葡萄糖含量。本發明的優點在于1、可以以穩定的單一試劑形式存在至少穩定一年，而且操作簡單不用復配，手工上機都能方便適用，降低試劑浪費和環境污染，避免了傳統的雙試劑占用儀器的試劑艙位多、容易錯位、另外儀器損耗引起雙試劑配比不平衡而造成試劑浪費較大等缺點。2、靈敏度好，且檢測波長范圍廣(500-600nm)，可適用于各種生化檢測儀器，提高儀器利用率。說明書附圖圖1本發明具體實施例1與對照例數據分析圖。具體實施例方式下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發明做進一步描述。只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。實施例l主要成分濃度磷酸鹽緩沖液(pH7.0)100mmol/L葡萄糖氧化酶12KU/L過氧化物酶5KU/L4-氨基安替比林0.5mmol/L疊氮鈉1.5g/L氯化鎂2g/L硫酸鈉5g/L3-嗎啉丙磺酸20mmol/LD朋S0.265g/LTOPS0.05g/L對照例主要成分濃度磷酸鹽緩沖液(pH7.0)50mmol/L葡萄糖氧化酶12KU/L過氧化物酶5KU/L4-氨基安替比林0.5mmol/L苯酚11mmol/L波長500nm測定方法終點法反應溫度37°C標本/試劑1:150反應時間10分鐘表一、臨床標本標本號標本中葡萄糖含量(mg/dL)實施例l對照例175.774.92119.9120.13175.9175.24111.7110.6122.1121.66285.4281.97273.7274.38256.4255.1969.066.31069.167.51172.671.51273.074.713264.5261.31499.5981572.971.516肌778.61773.972.61886.485.31990.090.62097.295.8從表一和說明書附圖1的結果，可以看出，本發明實施例的穩定組合和高敏復合顯色劑對測定結果沒有影響，與對照例(含苯酚試劑)有良好的相關性。表二、質控及穩定性7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表二結果本發明實施例有很好的穩定性(穩定12個月)可以滿足商業化需求，而對照例3個月測定結果已經明顯下降，結果超出質控靶值范圍。表三、吸光度范圍及靈敏度(lOOmg/dL葡萄糖標準品)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表三結果表明，本發明的復合色原在500-600nm處比對照例有更好的靈敏度，確保讀數的可靠性、適用光譜范圍寬，滿足不同生化分析儀及用戶程序設定要求，如可以選擇600nm波長避開樣品中膽紅素、血紅蛋白的吸收峰降低干擾。實施例2主要成分濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)50mmol/L葡萄糖氧化酶12KU/L過氧化物酶5KU/L4-氨基安替比林0.5mmol/LPROCLIN3000.5g/L硫酸鎂lg/L硫酸鈉20g/L3-嗎啉丙磺酸200mmol/LDHBS0.5g/LTODB0.1g/L調pH6.8實施例3主要成分濃度磷酸鹽緩沖液(pH6.8)50mmol/L葡萄糖氧化酶12KU/L過氧化物酶5KU/L4-氨基安替比林0.5mmol/LPROCLIN3000.5g/L硫酸鎂lg/L硫酸鈉1g/L3-嗎啉丙磺酸5mmol/LDHBS0.5g/LTODB0.1g/L調pH6.8表四、質控及穩定性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表四的結果，本發明的穩定方法比對照例穩定性得到了不同程度提高。從上述的結果可以表明本發明的試劑與對照例有良好的相關性和準確度；保存時間長，比對照例有更好的穩定性和靈敏度，滿足臨床診斷要求，權利要求1.一種葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其特征在于其為單一液體形式，且其組分包括有葡萄糖氧化酶1-50KU/L；過氧化物酶0.5-50KU/L；4-氨基安替比林0.1-20mmol/L；硫酸鈉1-200g/L；3-嗎啉丙磺酸5-500mmol/L；高敏復合色原0.05-10g/L；防腐劑0.05-20g/L；緩沖液pH5.0-8.0。2.根據權利要求1所述的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其特征在于.*所述的高敏復合色原為DHBS、TOPS、TOOS、TODB中的二種或者二種以上組合。3.根據權利要求1或2所述的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其特征在于所述的緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液或Good'S生物緩沖液。4.根據權利要求3所述的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其特征在于所述的防腐劑為PROCLIN系列防腐劑、疊氮鈉或慶大霉素或氯霉素、對羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽、季銨鹽陽離子表面活性劑中的一種或多種組合。5.根據權利4所述的葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其特征在于:還含有蛋白穩定劑、多元醇、氨基酸、螯合劑、二價金屬離子、非離子表面活性劑。全文摘要本發明公開了一種葡萄糖氧化酶單一液體測定試劑，其為單一液體形式，且其組分配比為葡萄糖氧化酶1-50KU/L；過氧化物酶0.5-50KU/L；4-氨基安替比林0.1-20mmol/L；硫酸鈉1-200g/L；3-嗎啉丙磺酸5-500mmol/L；高敏復合色原0.05-10g/L；防腐劑0.05-20g/L；緩沖液pH5.0-8.0。本發明具有能以單一液體狀態存在并具有優良的穩定性和靈敏度、并具有檢測波長范圍廣等優點。文檔編號C12Q1/54GK101503732SQ200910096830公開日2009年8月12日申請日期2009年3月13日優先權日2009年3月13日發明者肖洪武申請人:溫州東甌津瑪生物科技有限公司