專利名稱：一種肝炎基因Ly6c1及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與重癥肝炎早期診斷相關的基因Lymphocyte antigen 6 complex, locus C1 (Ly6cl)及其編碼的蛋白。
背景技術：
我國屬乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行國家， 一般人群的乙肝表面抗原(HBsAg) 陽性率為9.09%，全國現有乙型肝炎患者約3000萬人。美國的國家衛生研究所(NIH)估 計在全世界有4億人是HBV的慢性感染者。每年大約有500000人死于由HBV的長期感 染引起的慢性肝炎和肝癌，另外有40000人死于重癥乙型肝炎。
重癥肝炎是機體在多種致病因子作用下，肝組織在短期內出現大塊或亞大塊壞死， 導致肝功能衰竭的綜合征。當前國外的重癥肝炎病因以藥物、酒精等中毒所致的急性肝衰 竭為主，而我國的重癥肝炎多由肝炎病毒，尤其是乙型肝炎病毒所致(約占70%)。由HBV 引起的重癥肝炎仍是中國今后近百年甚至更長時間的常見病。該疾病病情篤重，發展迅猛， 發病機理不甚明了，目前臨床上缺乏特異、有效的治療靶點和干預手段，除非實施緊急肝 移植(國外以肝移植為主要治療手段，肝移植后1年存活率約為50% 60%)，絕大部分患者 預后不良，并發癥多，死亡率高達70-90%。因而嚴重威脅人民群眾的生命健康，極大地增 加患者家庭和社會的經濟負擔，影響社會穩定。
重癥肝炎療效差的主要原因之一是該病具有突發性和不可預見性的特點，患者送達醫 院搶救時往往已經失去最佳的治療時間，因此若能將診斷時間提前，在早期階段或者更早 一些時候，僅僅出現重癥肝炎病變趨勢時即給予積極處理，則有可能通過臨床干預防治疾 病的發生和進展，可大大提高治愈率。而且，重癥肝炎病程不同階段的臨床表現不同，治 療的側重點也不盡相同早期治療效果好，晚期則只能對癥治療，效果差；由于病程地準 確分辨有利于臨床醫師采取合適的治療手段，因此，早期診斷在重癥肝炎防治中具有特別 重要的意義。
篩選重癥肝炎發病早期即出現的特征性變化的基因，有利于建立重癥肝炎早期診斷技 術，可為重癥肝炎早期治療提供理論依據，最終能從根本上降低我國乙型重癥肝炎的發病率和死亡率。
高通量基因芯片日益被用作一種分析全基因組轉錄動態的工具。這種應用提高了以類 似的方法來確認早期重癥肝炎基因的特異性變化的可能性。這種基因的特異性變化可以作 為診斷的標準。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種肝炎基因Ly6cl編碼的蛋白質，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
本發明還同時提供了編碼上述蛋白質的基因，該基因具有SEQIDNO: l所示的核苷 酸序列。
本發明還同時提供了上述基因的用途，用于制備能早期診斷重癥肝炎的基因芯片。 本發明提供一種與重癥肝炎早期診斷相關的新基因，并分析該基因在小鼠模型體內的 表達情況，從而探索其在重癥肝炎發病時的作用，進而開發早期診斷重癥肝炎的診斷試劑。 本發明探明了該基因在ConA誘導的重癥肝炎模型中表達水平的變化。本發明的基因可作 為重癥肝炎的早期診斷的候選靶基因，為相關的診斷試劑盒的開發及研制提供可能。該基 因與重癥肝炎的病發和病變有關，為早期診斷提供了良好的耙基因。本發明的基因用于制 備能早期診斷重癥肝炎的基因芯片。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1 Ly6clcDNA及相應蛋白序列圖2 ConA誘導的重癥肝炎中Ly6cl基因表達水平的變化圖。
具體實施例方式
實施例1、肝炎基因Ly6cl cDNA的序列分析
Ly6clcDNA基因共有862個堿基，如SEQ ID NO: 1所示。超始密碼子ATG后第一 個堿基為G。 Ly6cl cDNA包含了一個完整的開放讀寫框(60-455)，相應的蛋白質由131 個氨基酸殘基組成。
實施例2、新基因開放閱讀框架的PCR擴增，結果測序
1、總RNA的提取
取正常Balb/C小鼠肝臟組織100mg，液氮冷凍后，在研缽內磨成粉末，力口lmlTrizol溶液(購自Invitrogen, Carlsbad, CA)中，充分混勻后加150ul氯仿，劇烈震蕩，12000g 離心15分鐘，小心吸取透明上清液，加lml無水乙醇室溫沉淀30分鐘，12000g離心25 分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌，7500g離心5分鐘，棄上清，沉淀用DEPC水溶解。
2、 cDNA第一鏈合成
總RNA(lpgto 15嗎)和d 2pLof 50pM T7-01igo(dT)引物在0.2mL PCR管中混合，加入 無RNA酶水至12pL。輕打管子幾下混勻溶液，然后離心收集底部的反應物和產物。隨后， 加入4pL of 5X 1st Strand Reaction Mix, 2pL of 0.1 M DTT, lpL of 10mM dNTP (均購自 Promega公司)并輕彈幾下徹底混合后立刻放置到42°C環境中。加入Superscript II (lpL) 到每個RNA樣品中至20nL。 RNA在42°C下孵育1小時。最后，樣品在4°C下冷卻2分 鐘。
3、 PCR擴增
根據新基因閱讀框架的起始密碼子和終止密碼子外側設計引物，由上海生物工程公 司合成，上游引物P1: 5， CCCTTCTCTGAGGATGGACA 3 ，，下游引物P2: 5， CAGGAAAGAGTGGTTGCACA3，。反應混合物包括上下游引物各20pmo1、 l^Lof lOmM dNTPs、 1.5mmol/LMgC12、 5pL of 10X Buffer和2.5u TAq聚合酶(均購自Promega公司)。 反應條件為94。C變性40s， 64。C退火35s,72。C延伸40s,完成35個循環，最后72。C延伸5min。 PCR產物經測序分析，序列如SEQIDNO: l所示。 實施例3 、 ConA肝損傷模型的構建
給小鼠進行ConA靜脈注射可以引起淋巴細胞向肝臟的轉移，引起暴發性自身免疫性 肝損傷，造成肝細胞的壞死和凋亡，而對其他的臟器影響不大，是一種比較理想的研究重 癥肝炎的常用實驗模型。以這樣方式可以模擬重癥肝炎，同時結合高通量基因芯片技術就 能獲得相關基因的表達情況進而以基因的角度推斷重癥肝炎的發病機制。
本實驗用Balb/C小鼠30只(購于浙江省醫學科學院動物中心)，尾靜脈注射ConA20 mg/kg，分別在0h、 lh、 3h、 6h、 12h、 24h、 72h將動物斷頭處死，取血經離心分離血清， 測定ALT和AST水平。取小鼠肝臟，部分保存于液氮中備用，部分浸于福爾馬林液中， 固定后作肝臟病理切片，常規HE染色，觀察肝臟損傷情況。
肝臟病理切片結果顯示小鼠注射ConA后6小時即出現壞死，并隨著時間的延長加重。 結果顯示ConA肝損傷模型構建成功。
實施例4 、 Ly6cl在重癥肝炎小鼠模型診斷中的應用1、總RNA和mRNA提取
用Balb/C小鼠尾靜脈注射ConA20mg/kg，分別在0h、 lh、 3h、 6h將動物斷頭處死， 取小鼠肝臟，保存于液氮中備用。肝組織用液氮勻漿后加Trizol溶液(購自Invitrogen, Carlsbad, CA)中。總RNA的提取按說明書操作，然后用Qiagen Mini kit RNA純化試劑盒 (購自QIAGEN, Valencia, CA)純化。用瓊脂糖凝膠電泳或LAB-ON-A -CHIP系統對樣品總 RNA進行質量檢測和定量。最后RNA溶解在無RNA酶的水儲存在-80。C備用。
2、第一條cDNA的合成
總RNA(l昭to 15嗎)和d 2nL of 50pM T7-01igo(dT)引物在0.2mL PCR管中混合，加入 無RNA酶水至12pL。輕打管子幾下混勻溶液，然后簡短離心收集底部的反應物和產物。 隨后，加入4pL of 5X 1st Strand Reaction Mix, 2^L of 0.1M DTT, l^L of lOmM dNTP (均購 自Promega公司)并輕彈幾下徹底混合后立刻放置到42°C環境中。加入Superscript II (l^L) 到每個RNA樣品中至20nL。 RNA在42°C下孵育1小時。最后，樣品在4°C下冷卻2分 鐘。得第一條的cDNA合成鏈。 3、第二條cDNA的合成
在管中加入無RNA酶水91pL, 30(iL of 5X 2nd Strand Reaction Mix, 3jiL of 10mM dNTP， lpL of E. coli DNA連接酶，4pL of E. coli DNA聚合酶I, and l^L of RNA酶H (均購自 Promega公司)后輕彈幾下混勻。簡短離心收集底部固體。加入上述第一條cDNA合成鏈。 輕打幾下混勻溶液后樣品經簡短離心收集底部反應物和產物。cDNA在16°C孵育5分鐘 上。最后加入10pL0.5MEDTA。得第二條的cDNA合成鏈。
4、 生物素標記的cRNA合成
取6pL上述cDNA進行體外轉錄(IVT)，加10XIVT緩沖液4pL， IVT標記NTP12pL， IVT標記酶混合物4nL，無RNase水加至總體積40|aL (Affymetrix公司)。小心混勻后簡 短離心，37。C孵育16小時，即獲得生物素標記的cRNA。
5、 微列陣
生物素標記的cRNA在12個單獨的Affymetrix小鼠U4302.0芯片(購自Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)雜交。對3卯00轉錄物和變體，其中包括34000多個已被證實的小鼠基因 作產物分析。
6、 基因芯片雜交及雜交圖像分析
常規方法逆轉錄標記cDNA探針并純化，采用小鼠基因芯片(U4302.0)與合成的cDNA
6進行雜交，用Affymetrix Scanner3000激光共聚焦掃描儀對雜交后的芯片進行掃描，對雜交 信號值進行扣本底、標準化。以上基因芯片雜交分析由上海生物芯片有限公司完成。
結果顯示Ly6cl在ConA誘導的重癥肝炎的小鼠模型中的表達情況為一直上升，誘導 后lh、 3h、 6h小時后分別上升1.3、 1.9及3.8倍。結果如圖2所示。
因此我們認為，Ly6cl在重癥肝炎的開始和發展中起著重要的作用，可用于重癥肝 炎的基因診斷或一個早期重癥肝炎的診斷指標，作為重癥肝炎的診斷的候選靶基因，有重 要的臨床應用意義。針對該基因設計的引物可用于制備PCR診斷試劑盒；針對該基因設 計合成抗體可用于制備ELISA診斷試劑盒，用于重癥肝炎的診斷；上述內容均可按照目 前已知的常規方法進行制備。還可按照目前已知的常規方法制備能早期診斷重癥肝炎的基 因芯片。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直 接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。序列表
SEQIDNO: 1
1 atctgacaga acttgccact gtgcctgcaa ccttgtctga gaggaaccct tctctgagga 61 tggacacttc tcacactaca aagtcctgtg tgctcattct tcttgtggcc ctactgtgtg 121 cagaaagagc tcagggactg cagtgctacg agtgctatgg agtgccaatt gagacttcct 181 gcccagcagt tacctgccgc gcctctgatg gattctgcat tgctcaaaac atagaattga 241 ttgaggactc tcaaagaagg aaactaaaga cccgtcagtg cctttctttc tgccctgctg 301 gtgtgccaat caggga/tcct aacatcaggg agaggacttc ctgttgcagc gaagacctct 361 gcaatgcagc agttcccact gcaggtagca cctggacc已t ggcaggggtg cttctgttca 421 gcctgagctc agtcgtcctg cagaccttgc tctgatggtc cttccaatga cccccaccct 481 tttcctttta tcttcatgtg caaccactct ttcctggagt cctctagtga caaattatat 541 gttatagaag gtccaatgtg gggatagtgt gtggaacacc ctgtttcacc tttatagccc 601 ctgctgggta agtgcccgac tcctctctag ggctttcaaa tctgtacttc ttgcaatgcc 661 atttagttgt ggatttctat tcttggccct ggaggcatgt ggccagcaca tgcaaceiggc 721 agtattccaa ggtattatag tatcaccatc cacacataag tatctggggt cctgcagggt 781 tcccatgtat gcctgtcaat gacccctgtt gagtccaata aaagctttgt tctcccagcc 841
SEQIDNO: 2
Met Asp Thr Ser His Thr Thr Lys Ser Cys Val Leu lie Leu Leu 15
Val Ala Leu Leu Cys Ala Glu Arg Ala Gin Gly Leu Gin Cys Tyr 30
Glu Cys Tyr Gly Val Pro lie Glu Thr Ser Cys Pro Ala Val Thr 45
Cys Arg Ala Ser Asp Gly Phe Cys lie Ala Gin Asn lie Glu Leu 60
He Glu Asp Ser Gin Arg Arg Lys Leu Lys Thr Arg Gin Cys Leu 75
Ser Phe Cys Pro Ala Gly Val Pro lie Arg Asp Pro Asn lie Arg 90
Glu Arg Thr Ser Cys Cys Ser Glu Asp Leu Cys Asn Ala Ala Val 105
Pro Thr Ala Gly Ser Thr Tip Thr Met Ala Gly Val Leu Leu Phe 120
Ser Leu Ser Ser Val Val Leu Gin Thr Leu Leu 13權利要求
1、一種肝炎基因Ly6c1編碼的蛋白質，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權利要求1所述蛋白質的基因，其特征在于所述基因具有SEQIDNO: 1 所示的核苷酸序列。
3、如權利要求2所述基因的用途，其特征在于用于制備能早期診斷重癥肝炎的基因芯片。
全文摘要
本發明公開了一種肝炎基因Ly6c1編碼的蛋白質，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發明還同時公開了一種編碼上述蛋白質的基因，該基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。該基因可用于制備能早期診斷重癥肝炎的基因芯片。
文檔編號C12Q1/68GK101602797SQ20091009983
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月22日 優先權日2009年6月22日
發明者周林福, 朱海紅, 峰 陳, 智 陳 申請人:浙江大學