一種乙型肝炎病毒基因分型的方法

專利名稱：一種乙型肝炎病毒基因分型的方法
技術領域：
本發明涉及病毒鑒定，更具體涉及乙型肝炎病毒的基因分型。
技術背景一、乙型肝炎病毒(HBV)及MASA液相芯片技術乙型肝炎病毒(HBV)簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科。 根據目前所知，乙肝病毒只對人和猩猩有易感性，引發乙型病毒性肝炎疾病。完 整的乙肝病毒成顆粒狀，直徑為42納米，是英國科學家Dane于1970年首先發 現，故又稱Dane顆粒(丹氏顆粒)。Dane顆粒由外膜和內核兩部分組成，外膜厚 7納米，由蛋白質和膜脂質組成，稱作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的 直徑約28納米，為病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg),病毒基因組DNA 和合成病毒基因組的DNA多聚酶。乙肝病毒基因組編碼四個基因，表面抗原基因 (S、 PreSl及PreS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基 因(C及PreC基因)。根據乙肝病毒基因組變異性大于8%,乙肝病毒分為A H 八個基因型。這些基因型在全球有顯著的地域分布。A型和D型主要分布在歐洲 和地中海地區，B型和C型主要分布在亞洲，E型主要分布在西非，F型和H型 主要分布在中美洲及南美洲，G型主要分布在美國。乙肝病毒感染是一個嚴重的公共衛生問題。全球60億人口中，約20億人曾 感染過乙肝病毒，其中3. 5 4億人為慢性乙肝病毒感染，約占全球人口 6%。 在這3.5 4億慢性乙肝病毒感染者中，約15% 25%最終將死于與乙肝病毒感 染相關的肝病。而我國屬于高流行區，根據2002年全國乙型肝炎血清流行病學 調査表明，我國一般人群中HBsAg流行率為9.09X,估計約1.2 1.3億人為慢 性乙肝病毒感染，占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全國每年死于與乙肝相關肝病約30萬例。根據研究，不同的基因型將導致不同的臨床結果。例如在亞洲，乙肝病毒基 因型以B和C為主，大量的研究發現，嚴重肝病的發生與基因型C的關系比基因 型B的關系更密切。因此，對病人體內的乙肝病毒進行基因分型，將有利于對 疾病的進程進行預測。此外，大范圍的對乙肝病毒進行基因分型，可以用于研究 乙肝病毒的進化與發展。MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array,多功能懸浮點陣儀)技 術是美國納斯達克市公司上研制出的新一代生物芯片技術平臺。它是一個非常靈 活的多功能技術平臺。其關鍵是把微小的乳膠顆粒(Beads,微球)分別染成不同 的熒光色，然后再把針對不同檢測物的核酸或蛋白以共價方式結合到給定顏色的 微球上。應用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入 被檢測物(被檢測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等，也可以時PCR產物)。 在懸液中的微球與被檢測物特異性地結合，并加上熒光標記。然后，微球成單列 通過兩束激光， 一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測 定微球上的熒光標記強度從而決定被測物的量(定量)。所得的數據經電腦處理后 可以直接用來判斷結果。美國納斯達克市公司生產的Luminex儀器可以讀取由藻紅蛋白標記的基因 產物的熒光強度。二、現有乙肝病毒基因分型方法及其不足之處1.基因序列測定法1.1全基因序列測定法是根據乙肝病毒基因組變異性大于8%進行分 型,Okamoto這種方法區分出A D型，E、 G、 F、 H也通過序列分析得以證實,初 步建立了基因分型體系，該方法直接可靠，但繁瑣費時，不適宜廣泛開展。1.2表面抗原基因(S基因)序列測定法Norder通過對乙肝病毒攜帶者S 基因序列測序結果分析，證實了 Okamoto的結果,還發現了兩個新的基因型E、 F， 經證實，S基因序列分型最接近全基因組序列分型，初步簡化了HBV基因分型方 法。但相對而言，該方法仍然比較繁瑣費時。2. 聚合酶鏈反應一限制性酶長度多態性分析(PCR—RFLP): Lindh通過PCR 擴增出目標基因片段(通常為S基因或PreS/S基因)，然后用給定的限制性內切 酶進行酶切，根據酶切圖譜進行基因分型。這種方法簡明，但有時結果比較模糊， 甚至完全不能判斷。3. 基因型特異性引物PCR法Naito等設計了A F六種基因型的型特異性 引物，并進行套式PCR，保證了同一基因型內核苷酸序列差異《2，不同基因型 間核苷酸序列差異^3,并使不同基因型擴增產物的相對分子質量不同，在電泳 后得出結果，可用于乙肝病毒感染的分子診斷和大范圍調査。但是這種方法可能 會出現假陽性，而且無法區分基因型F和基因型H。4. 基因型特異性線性探針檢測法目前有兩種， 一種采用線性探針的反向 雜交，將PCR擴增的乙肝病毒基因片段與被膜上的特異性探針雜交,另一種為PCR 微板核酸雜交法,通過探針包被的微核板，PCR擴增產物與之雜交，從而確定基 因型。但這種方法特異性不高，且實現過程中可能會出現很多問題，例如雜交溫 度難以控制。5. 基因型特異性表位單克隆抗體的酶聯免疫熒光(ELISA)法Usuda等制備 前S2區域基因型特異性表位單克隆抗體，并用辣根過氧化物酶進行標記，對68 例乙肝病毒陽性攜帶者血清檢測，該方法分型結果與S基因測序分型完全一致， 適用于大規模的流行病學調査，但單克隆抗體的制備比較復雜，而且費用昂貴。6. 基于熒光定量PCR(rea1-timePCR)的方法這種方法利用各種基因型特 異的引物和探針，進行熒光定量PCR，從而確定基因型。該方法比較靈敏，并 且可以同時對乙肝病毒進行定量，但在基因分型中，熒光定量PCR結果容易受 基因位點突變的影響而使得結果不確定。發明內容本發明的目的是，提供一種乙型肝炎病毒基因分型的方法。該方法基于 MASA液相芯片技術對乙肝病毒基因進行分型，主要根據乙肝病毒八種基因型 的特點設計基因型特異的引物及探針，通過兩輪PCR，分子雜交，再用Luminex 儀器進行檢測，從而確定乙肝病毒屬于八種基因型的哪一種。本發明的優點是操作簡單、結果明確、假陽性少、費用較低，適合大范圍的推廣應用。 為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案。一種乙型肝炎病毒基因分型的方法，該方法按下列步驟順序進行。a、 提取樣品中的DNA;b、 以步驟a中提取的DNA為模板進行第一輪PCR，在PCR管中加入25uL 下列物質IOXPCR緩沖液2.5uL四種脫氧核糖核苷酸(dATP, dTTP， dGTP， dCTP): 0.5uL 濃度為20umol/L所有型引物F: 0. 25uL 濃度為20umol/L所有型引物R: 0. 25uL Taq (Thermus aquaticus，水生嗜熱菌)DNA聚合酶0. 5uL DNA模板(template): 0. 5 5uL 余者為超純水(ddH2'0); 其中所有型弓I物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGc、 將PCR管放入PCR儀，條件如下cl、 94'C 5分鐘 c2、 94。C 30秒 c3、 57 。C 30秒 c4、 72'C 30秒 c5、重復29次步驟c2 c4 c6、 72'C 15分鐘 c7、降到4。C 得到第一輪PCR的產物為擴增的目標基因溶液；d、 以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR,在PCR管中再加入50uL 下列物質IOXPCR緩沖液5uL 四種脫氧核糖核苷酸luL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物F: 0.5uL 濃度為20咖ol/L第二輪PCR引物R: 0.5uLTaqDNA聚合酶luL 擴增的目標基因溶液0.1~0.5uL 余者為超純水；其中第二輪PCR引物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二輪PCR引物R為生物素(biotin) -CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、 將PCR管放入PCR儀，條件如下el、 94°C 5分鐘e2、 94。C 30秒e3、 60。C 30秒e4、 72°C 30秒e5、重復29次步驟e2 e4e6、 72。C 15分鐘e7、將溫度降到4'C; 這樣就將生物素加到擴增的目標基因的一端，得到第二輪PCR的產物為帶有生 物素標記的目標基因溶液；f、 把所有型探針以共價方式結合到給定顏色的微球(微小的乳膠顆粒)上， 用雜交緩沖液(1.5xTMAC，氯化四甲銨)稀釋，使得每微升含有100個微球， 其中所有型探針的序列為NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG ;g、 在棕色容器中加入TE緩沖液(1XTE buffer, PH=8. 0): 12uL 帶有生物素標記的目標基因溶液5uL微球33uL ;h、 將棕色容器置于94'C 5分鐘，再移至57'C溫育15分鐘，然后移到冰上， 加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57'C溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基 因與探針結合的產物；i、 用Luminex儀器讀取給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與探針結合 的產物的熒光檢測值；j、當熒光檢測值〈100時，說明樣品中基本不含乙肝病毒DNA,停止檢測； k、當100《熒光檢測值<200時，樣品中是否含乙肝病毒DNA不確定；當熒光檢測值》200時，確定樣品中含有乙肝病毒DNA;對這兩種情況都用下列步驟作進一步的檢測；1、分別用八種基因型的第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R，以步驟a 中提取的DNA為模板分別進行第一輪PCR，各引物對序列如下 基因型A引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG 基因型A引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT 基因型D引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA 基因型D引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG 基因型G引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT 基因型G引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCC m、在PCR管中加入25uL下列物質IOXPCR緩沖液2.5uL四種脫氧核糖核苷酸0.5uL濃度為20umol/L第一輪PCR引物F: 0. 25uL濃度為20umol/L第一輪PCR引物R: 0.25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5 5uL余者為超純水； n、將PCR管放入PCR儀，條件如下cl、 94'C 5分鐘c2、 94。C 30秒c3、 57 。C 30秒c4、 72 。C 30秒c5、重復29次步驟c2 c4c6、 72°C 15分鐘c7、降到4'C 得到第一輪PCR的產物為擴增的目標基因溶液；o、以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR,在PCR管中再加入50uL 下列物質IOXPCR緩沖液5uL 四種脫氧核糖核苷酸luL濃度為20umol/L第二輪PCR引物F: 0.5uL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物R: 0. 5uL Taq DNA聚合酶luL 擴增的目標基因溶液0.1~0.5uL 余者為超純水；其中第二輪PCR引物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二輪PCR引物R為生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG p、將PCR管放入PCR儀，條件如下 el、 94'C 5分鐘 e2、 94 °C 30秒 e3、 60°C 30秒 e4、 72'C 30秒 e5、重復29次步驟e2 e4 e6、 72°C 15分鐘 e7、將溫度降到4'C; 得到第二輪PCR的產物為帶有生物素標記的目標基因溶液q、把與步驟n相同基因型的探針以共價方式結合到給定顏色的微球上，用 雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個微球；八種基因型的探針序列如下 基因型A探針NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC 基因型B探針NH2-TTTnTTTTnTGGGCAGGTTCCIGTGGGC 基因型C探針NH2-TTTTTTnTnTRGGCAAGACCTGGYGGGC 基因型D探針NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC 基因型E探針NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG 基因型F探針NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC 基因型G探針NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC 基因型H探針NH2-TTTTTTTTmTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGC r、在棕色容器中加入TE緩沖液12uL帶有生物素標記的目標基因溶液5uL微球33uLs、將棕色容器置于94'C 5分鐘，再移至57'C溫育15分鐘，然后移到冰上， 加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57'C溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基因與探針結合的產物；t、用Luminex儀器分別讀取八種給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與 探針結合的產物的熒光檢測值；u、當熒光標記的目標基因與探針結合的產物是由步驟m所使用引物及步驟 q所使用探針的基因型得到，則當該熒光標記的目標基因與探針結合的產物的熒 光檢測值<100時，說明樣品中基本不含該基因型的乙肝病毒DNA;v、當100《該熒光標記的目標基因與探針結合的產物的熒光檢測值〈200時， 樣品中是否含該基因型的乙肝病毒DNA不確定；當熒光檢測值^200時，確定 樣品中含有該基因型的乙肝病毒DNA。因為有些樣品中含有一種以上的基因型乙肝病毒DNA,因此，即使已檢測到某一種基因型乙肝病毒DNA,還需要檢測其是否還含有其它基因型的乙肝病 毒DNA。與現有技術相比，本發明具有操作簡單，特異性髙，假陽性少，靈敏度高， 結果用數字表示，非常明確，對目前已知的所有8種基因型乙肝病毒都可進行明 確的區分，且費用較低，適合大范圍的推廣應用。
具體實施例方式實施例1已知樣品中含有基因型A乙型肝炎病毒，按本發明的基因分型的方法進行 檢測，具體步驟如下a、 提取樣品中的DNA;b、 以步驟a中提取的DNA為模板進行第-下列物質IOXPCR緩沖液2.5uL 四種脫氧核糖核苷酸0.5uL 濃度為20umol/L所有型引物F: 濃度為20umol/L所有型引物R: TaqDNA聚合酶0.5uL-輪PCR,在PCR管中加入25uL0. 25uL 0. 25uLDNA模板0.5 5uL 余者為超純水；其中所有型引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGc、 將PCR管放入PCR儀，條件如下cl、 94°C 5分鐘 c2、 94'C 30秒 c3、 57'C 30秒 c4、 72°C 30秒 c5、重復29次步驟c2 c4 c6、 72'C 15分鐘 c7、降到4'C 得到第一輪PCR的產物為擴增的目標基因溶液；d、 以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR，在PCR管中再加入50uL 下列物質-IOXPCR緩沖液5uL 四種脫氧核糖核苷酸luL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物F: 0.5uL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物R: 0.5uL TaqDNA聚合酶luL 擴增的目標基因溶液0.1 0. 5uL 余者為超純水；其中第二輪PCR弓I物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二輪PCR引物R為生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、 將PCR管放入PCR儀，條件如下el、 94°C 5分鐘e2、 94'C 30秒e3、 60。C 30秒e4、 72 。C 30秒e5、重復29次步驟e2 e4e6、 72'C 15分鐘e7、將溫度降到4'C; 這樣就將生物素加到擴增的目標基因的一端，得到第二輪PCR的產物為帶有生 物素標記的目標基因溶液；f、 把所有型探針以共價方式結合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液稀釋， 使得每微升含有100個微球，其中所有型探針的序列為NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG ;g、 在棕色容器中加入TE緩沖液12uL帶有生物素標記的目標基因溶液5uL 微球33uL ;h、 將棕色容器置于94°C 5分鐘，再移至57'C溫育15分鐘，然后移到冰上， 加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57'C溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基 因與探針結合的產物；i、 用Luminex儀器讀取給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與探針結合 的產物的熒光檢測值；j、熒光檢測值為732.2,大于200，確定樣品中含有乙肝病毒DNA;用下 列步驟作進一步的檢測；k、分別用八種基因型的第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R,以步驟a 中提取的DNA為模板分別進行第一輪PCR，各引物對序列如下 基因型A引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG 基因型A引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT 基因型D引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAAC A A 基因型D引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG 基因型G引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT 基因型G引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT 基因型B、基因型C、基因型E、基因型F、基因型H引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCC1、在PCR管中加入25uL下列物質 IOXPCR緩沖液2.5uL四種脫氧核糖核苷酸0.5uL濃度為20umol/L所有型引物F: 0. 25uL濃度為20umol/L所有型引物R: 0. 25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0. 5 5uL余者為超純水； m、將PCR管放入PCR儀，條件如下cl、 94°C 5分鐘c2、 94。C 30秒c3、 57。C 30秒c4、 72'C 30秒c5、重復29次步驟c2 c4c6、 72°C 15分鐘c7、降到4。C 得到第一輪PCR的產物為擴增的目標基因溶液；n、以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR，在PCR管中再加入50uL 下列物質IOXPCR緩沖液5uL 四種脫氧核糖核苷酸luL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物F: 0.5uL 濃度為20umol/L第二輪PCR引物R: 0.5uL TaqDNA聚合酶luL 擴增的目標基因溶液0.1 0.5uL 余者為超純水；其中第二輪PCR引物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC第二輪PCR引物R為生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG o、將PCR管放入PCR儀，條件如下-el、 94°C 5分鐘 e2、 94 。C 30秒 e3、 60°C 30秒 e4、 72。C 30秒e5、重復29次步驟e2 e4e6、 72°C 15分鐘e7、將溫度降到4'C; 得到第二輪PCR的產物為帶有生物素標記的目標基因溶液；p、把與步驟n相同基因型的探針以共價方式結合到給定顏色的微球上，用 雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個微球；八種基因型的探針序列如下 基因型A探針NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC基因型C探針NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC 基因型D探針NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC基因型G探針NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTCq、在棕色容器中加入TE緩沖液12uL帶有生物素標記的目標基因溶液5uL 微球33uLr、將棕色容器置于94'C 5分鐘，再移至57'C溫育15分鐘，然后移到冰上， 加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57'C溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基 因與探針結合的產物；s、用Luminex儀器分別讀取八種給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與 探針結合的產物的熒光檢測值；t、熒光檢測值的結果為當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型A引物F及基 因型A引物R，步驟p的探針為基因型A探針時，熒光檢測值為1197.2,確認 樣品含有基因型A乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型B引物F及基 因型B引物R，步驟p的探針為基因型B探針時，熒光檢測值為53.5,確認樣 品不含基因型B乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型C引物F及基因型C引物R，步驟p的探針為基因型C探針時，熒光檢測值為57.8,確認樣 品不含基因型C乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型D引物F及基 因型D引物R,步驟p的探針為基因型D探針時，熒光檢測值為81.4,確認樣 品不含基因型D乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型E引物F及基 因型E引物R，步驟p的探針為基因型E探針時，熒光檢測值為40.1,確認樣 品不含基因型E乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型F引物F及基 因型F引物R，步驟p的探針為基因型F探針時，熒光檢測值為42.6,確認樣 品不含基因型F乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型G引物F及基 因型G引物R,步驟p的探針為基因型G探針時，熒光檢測值為25.6,確認樣 品不含基因型G乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型H引物F及基 因型H引物R,步驟p的探針為基因型H探針時，熒光檢測值為47.4,確認樣 品不含基因型H乙型肝炎病毒。該檢測結果與樣品己知的結果完全一致。實施例2已知樣品中含有基因型B乙型肝炎病毒，按本發明的基因分型的方法進行 檢測，具體步驟與實施例l相同，熒光檢測值的結果為當引物F及引物R為所有型引物F及所有型引物R，探針為所有型探針時， 熒光檢測值為649. 5,確認樣品含有乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型A引物F及基 因型A引物R，步驟p的探針為基因型A探針時，熒光檢測值為59.2,確認樣 品不含基因型A乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型B引物F及基 因型B引物R，步驟p的探針為基因型B探針時，熒光檢測值為1101.3,確認 樣品含有基因型B乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型C引物F及基因型C引物R,步驟p的探針為基因型C探針時，熒光檢測值為43.7,確認樣 品不含基因型C乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型D引物F及基 因型D引物R,步驟p的探針為基因型D探針時，熒光檢測值為46.4，確認樣 品不含基因型D乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型E引物F及基 因型E引物R，步驟p的探針為基因型E探針時，熒光檢測值為40.9,確認樣 品不含基因型E乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型F引物F及基 因型F引物R，步驟p的探針為基因型F探針時，熒光檢測值為50.8,確認樣 品不含基因型F乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型G引物F及基 因型G引物R，步驟p的探針為基因型G探針時，熒光檢測值為40.3,確認樣 品不含基因型G乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型H引物F及基 因型H引物R,步驟p的探針為基因型H探針時，熒光檢測值為44.1,確認樣 品不含基因型H乙型肝炎病毒。該檢測結果與樣品已知的結果完全一致實施例3已知樣品中含有基因型C乙型肝炎病毒，按本發明的基因分型的方法進行 檢測，具體步驟與實施例l相同，熒光檢測值的結果為當引物F及引物R為所有型引物F及所有型引物R,探針為所有型探針時， 熒光檢測值為583.6,確認樣品含有乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型A引物F及基 因型A引物R，步驟p的探針為基因型A探針時，熒光檢測值為57.4，確認樣 品不含基因型A乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型B引物F及基 因型B引物R，步驟p的探針為基因型B探針時，熒光檢測值為51.3,確認樣 品不含基因型B乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型C引物F及基因型C引物R，步驟p的探針為基因型C探針時，熒光檢測值為733. 5，確認樣 品含有基因型C乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型D引物F及基 因型D引物R,步驟p的探針為基因型D探針時，熒光檢測值為41.7，確認樣 品不含基因型D乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型E引物F及基 因型E引物R，步驟p的探針為基因型E探針時，熒光檢測值為58.2,確認樣 品不含基因型E乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型F引物F及基 因型F引物R，步驟p的探針為基因型F探針時，熒光檢測值為30.7,確認樣 品不含基因型F乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型G引物F及基 因型G引物R,步驟p的探針為基因型G探針時，熒光檢測值為33.8,確認樣 品不含基因型G乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型H引物F及基 因型H引物R，步驟p的探針為基因型H探針時，熒光檢測值為51.5,確認樣 品不含基因型H乙型肝炎病毒。該檢測結果與樣品己知的結果完全一致實施例4已知樣品中含有基因型D乙型肝炎病毒，按本發明的基因分型的方法進行 檢測，具體步驟與實施例l相同，熒光檢測值的結果為當引物F及引物R為所有型引物F及所有型引物R,探針為所有型探針時， 熒光檢測值為781. 0,確認樣品含有乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型A引物F及基 因型A引物R,步驟p的探針為基因型A探針時，熒光檢測值為59.3,確認樣 品不含基因型A乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型B引物F及基 因型B引物R,步驟p的探針為基因型B探針時，熒光檢測值為55.1,確認樣 品不含基因型B乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型C引物F及基因型C引物R，步驟p的探針為基因型C探針時，熒光檢測值為40.4,確認樣品不含基因型C乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型D引物F及基 因型D引物R，步驟p的探針為基因型D探針時，熒光檢測值為1063.8，確認 樣品含有基因型D乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型E引物F及基 因型E引物R,步驟p的探針為基因型E探針時，熒光檢測值為74.6,確認樣 品不含基因型E乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型F引物F及基 因型F引物R，步驟p的探針為基因型F探針時，熒光檢測值為37.4，確認樣 品不含基因型F乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型G引物F及基 因型G引物R，步驟p的探針為基因型G探針時，熒光檢測值為30.7,確認樣 品不含基因型G乙型肝炎病毒；當步驟1第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為基因型H引物F及基 因型H引物R,步驟p的探針為基因型H探針時，熒光檢測值為30.9,確認樣 品不含基因型H乙型肝炎病毒。該檢測結果與樣品已知的結果完全一致由于待測樣品可能含有多種基因型乙肝病毒DNA,因此，即使已檢測到某 一種基因型乙肝病毒DNA，還需要檢測其是否還含有其它基因型的乙肝病毒 DNA,即要完整地做完實施例l中的所有步驟，除非已確認樣品不含乙肝病毒 DNA。
權利要求
1、一種乙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，該方法按下列步驟順序進行a、提取樣品中的DNA；b、以步驟a中提取的DNA為模板進行第一輪PCR，在PCR管中加入25uL下列物質10×PCR緩沖液2.5uL四種脫氧核糖核苷酸0.5uL濃度為20umol/L所有型引物F0.25uL濃度為20umol/L所有型引物R0.25uLTaqDNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5～5uL余者為超純水；其中所有型引物F為CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCCTAGGACCCCTGCTCGT 所有型引物R為TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGAGGCATAGCAGCAGGATGC、將PCR管放入PCR儀，條件如下c1、94℃5分鐘c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重復29次步驟c2～c4c6、72℃15分鐘c7、降到4℃得到擴增的目標基因溶液；d、以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR，在PCR管中再加入50uL下列物質10×PCR緩沖液5uL四種脫氧核糖核苷酸1uL濃度為20umol/L第二輪PCR引物F0.5uL濃度為20umol/L第二輪PCR引物R0.5uLTaq DNA聚合酶1uL擴增的目標基因溶液0.1～0.5uL余者為超純水；其中第二輪PCR引物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC 第二輪PCR引物R為生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGe、將PCR管放入PCR儀，條件如下e1、94℃5分鐘e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重復29次步驟e2～e4e6、72℃15分鐘e7、將溫度降到4℃得到帶有生物素標記的目標基因溶液；f、把所有型探針以共價方式結合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個微球，其中所有型探針的序列為NH2-TTTTTTTTTGAGAGAAGTCCACCACGAG；g、在棕色容器中加入TE緩沖液12uL帶有生物素標記的目標基因溶液5uL微球33uL；h、將棕色容器置于94℃5分鐘，再移至57℃溫育15分鐘，然后移到冰上，加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57℃溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基因與探針結合的產物；i、用Luminex儀器讀取給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與探針結合的產物的熒光檢測值；j、當熒光檢測值＜100時，說明樣品中基本不含乙肝病毒DNA，停止檢測；k、當100≤熒光檢測值＜200時，樣品中是否含乙肝病毒DNA不確定；當熒光檢測值≥200時，確定樣品中含有乙肝病毒DNA；對這兩種情況都用下列步驟作進一步的檢測；l、分別用八種基因型的第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R，以步驟a中的提取的DNA為模板分別進行第一輪PCR，八種基因型的引物序列如下基因型A引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACTTCCGGARACTACTGTTG基因型A引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTTCTGCGACGCGGCGAT基因型D引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTCACCATATTCTTGGGAACAA基因型D引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCCAACTGRTGATCGGGRAAG基因型G引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGACTGTTCAAGCCTCCAAGCT基因型G引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGAGCAACTCCACAGTAGCT基因型B引物F、基因型C引物F、基因型E引物F、基因型F引物F、基因型H引物FCTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCT基因型B引物R、基因型C引物R、基因型E引物R、基因型F引物R、基因型H引物RTACAGTCGGTCGCGTGCCTCGACCAATTTATGCCTACAGCCm、在PCR管中加入25uL下列物質10×PCR緩沖液2.5uL四種脫氧核糖核苷酸0.5uL濃度為20umol/L所有型引物F0.25uL濃度為20umol/L所有型引物R0.25uLTaq DNA聚合酶0.5uLDNA模板0.5～5uL余者為超純水；n、將PCR管放入PCR儀，條件如下c1、94℃5分鐘c2、94℃30秒c3、57℃30秒c4、72℃30秒c5、重復29次步驟c2～c4c6、72℃15分鐘c7、降到4℃得到擴增的目標基因溶液；o、以擴增的目標基因溶液為模板進行第二輪PCR，在PCR管中再加入50uL下列物質10×PCR緩沖液5uL四種脫氧核糖核苷酸1uL濃度為20umol/L第二輪PCR引物F0.5uL濃度為20umol/L第二輪PCR引物R0.5uLTaq DNA聚合酶1uL擴增的目標基因溶液0.1～0.5uL余者為超純水；其中第二輪PCR引物F為TACAGTCGGTCGCGTGCCTC 第二輪PCR引物R為生物素-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGp、將PCR管放入PCR儀，條件如下e1、94℃5分鐘e2、94℃30秒e3、60℃30秒e4、72℃30秒e5、重復29次步驟e2～e4e6、72℃15分鐘e7、將溫度降到4℃；得到帶有生物素標記的目標基因溶液；q、把與步驟n相同基因型的探針以共價方式結合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個微球；八種基因型的探針序列如下基因型A探針NH2-TTTTTTTCTGCCTCGGTCYCGTCGTC基因型B探針NH2-TTTTTTTTTTTTGGGCAGGTTCCIGTGGGC基因型C探針NH2-TTTTTTTTTTTTRGGCAAGACCTGGYGGGC基因型D探針NH2-TTTTTTTGGAAAGATTCTGCCCCATGC基因型E探針NH2-TTTTTTTTTTCCTTGGGCAAGATTTGGTGGG基因型F探針NH2-TTTTTTTTTTTGTTGGCAAACTCCAGGGGGC基因型G探針NH2-TTTTTGGCCATATGGCAAAGTTGTTC基因型H探針NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGGCAAGTTCCAAGGGGCr、在棕色容器中加入TE緩沖液12uL帶有生物素標記的目標基因溶液5uL微球33uLs、將棕色容器置于94℃5分鐘，再移至57℃溫育15分鐘，然后移到冰上，加入10uL熒光染料藻紅蛋白，再移到57℃溫育5分鐘，得到熒光標記的目標基因與探針結合的產物；t、用Luminex儀器分別讀取八種給定顏色微球上的熒光標記的目標基因與探針結合的產物的熒光檢測值；u、當目標基因熒光標記是由步驟m所使用引物及步驟q所使用探針的基因型得到，則當該目標基因熒光標記的熒光檢測值＜100時，說明樣品中基本不含該基因型的乙肝病毒DNA；v、當100≤該目標基因熒光標記的熒光檢測值＜200時，樣品中是否含該基因型的乙肝病毒DNA不確定；當熒光檢測值≥200時，確定樣品中含有該基因型的乙肝病毒DNA。
全文摘要
本發明公開了一種乙型肝炎病毒基因分型的方法，涉及病毒分類。該方法基于MASA液相芯片技術對乙肝病毒基因進行分型，主要根據乙肝病毒八種基因型的特點設計基因型特異的引物及探針，通過兩輪PCR，分子雜交，再用Luminex儀器進行檢測，根據檢測值的大小來確定乙肝病毒屬于八種基因型的哪一種。對病人體內的乙肝病毒進行基因分型，將有利于對疾病的進程進行預測，也可用于研究乙肝病毒的進化與發展。與現有技術相比，本發明具有操作簡單，特異性高，假陽性少，靈敏度高，結果明確，對目前已知的所有8種基因型乙肝病毒都可進行明確的區分，且費用較低，適合大范圍的推廣應用。
文檔編號C12Q1/70GK101402993SQ20071005376
公開日2009年4月8日 申請日期2007年11月5日 優先權日2007年11月5日
發明者丘志娟, 王華林, 胡志紅, 麗 袁, 菲 鄧 申請人:中國科學院武漢病毒研究所