專利名稱：一個感受dna損傷因子的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術，涉及環境生物工程領域中一種DNA損傷感應相關及 其應用，特別涉及耐輻射球菌一個可以感受DNA損傷因子的啟動子及其在生 物感應器上的應用。
背景技術：
耐輻射球菌(De/"ococcw ra力oc wrara)是已知生物中最耐電離輻射的之 一，其電離輻射抗體是大腸桿菌的100倍，人類的1000倍。該細菌在劑量為 5kGy的Y射線急性輻照后可以不受影響的生長，它還可以正常生長于60Gy/h 高輻射背景環境。另外，半個多世紀的研究已經建立了一套成熟耐輻射球菌的 遺傳操作體系。因此，已有一些研究小組成功對該細菌進行遺傳改造，嘗試性 得使得其具備清除高電離輻射背景下的生物修復能力。已有的研究表明，經遺 傳改造后的耐輻射球菌可降解甲苯等芳香烴、可還原高生物毒性的二價汞成相 對低毒的汞、可富集放射性鈾化合物等等。
被污染環境中超標的遺傳毒物作用于生物體內遺傳物質，使其發生損傷 (點突變、解聚、單鏈斷裂、雙鏈交聯，甚至雙鏈斷裂等)。這種損傷一旦超 出了細胞自身的修復能力，就會造成細胞死亡，或是多細胞生物的致畸和癌變。 所以，傳毒物往往是強誘變劑。環境中的遺傳毒物包括各種無機或有機化學誘 變劑，其種類非常多樣。典型的如絲裂霉素C(MMC)、甲基汞化硫酸酯(MMS)、 N-甲基-N'-硝基—N-亞硝基胍(MNNG)等等。這些毒物大都來自環境中微生物 釋放，化工污染，農藥殘留等。
日益嚴重的環境污染及其嚴重后果已經驅使人們進行環境污染物監測及 修復方法的探索。現在監測環境中化學物質主要有兩種方法，其一是基于物理 及化學作用原理的傳統檢測手段，及基于體外生物酶學作用的傳統生物學傳感 器，這類方法可以精確地檢測污染物質成分，從而了解污染原因及其程度；其 二則是基于活細胞的生物分析系統。第一種方法費錢耗時而且需要特殊的分析 儀器，更重要的是通過這種方法無法了解污染物對活體生物的生物學效應以及 污染物互作后對活細胞的影響，而后者恰好在此點上對前者作了補充。
發明內容
本發明的目的是提供一個感受DNA損傷因子的啟動子。本發明提供的一 個可以感受DNA損傷因子的啟動子源于耐輻射球菌，名稱為Pc^M (promoter of DNA damage repair protein A)， 來源于而才福身寸球菌菌株(Z)e/wococc附 mAo^raraRl， ATCCNo.13939，購自美國菌種保藏中心)，具有SEQIDNo: 1的核苷酸序列。
本發明的感受DNA損傷因子的啟動子包含與SEQIDNQ: 1限定的DNA 序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
SEQIDN化1序列由221個堿基對組成，該啟動子從5端第1到221個
堿基o
含有本發明核苷酸序列的表達載體、細胞系和轉基因生物體均屬于本發明 的保護范圍。
本發明的另一個目的是提供所述的感受DNA損傷因子的啟動子在制備生 物感應器中的應用。本發明所涉及的DNA損傷感應因子P^/M可以感應造成 DNA損傷的物理化學因子，將該啟動子與相關報告基因和宿主菌結合可以形 成生物感應器，并利用相應的檢測手段，可以監視環境遺傳毒物以及其生物學 效應。
將該段DNA序列克隆到帶有報告基因的質粒中，用該啟動子來驅動報告 基因的轉錄，將重組質粒導入到宿主細菌中，即可以構建一個可以感受環境 DNA損傷因子的生物感應器。另外，通過檢測報告基因的表達水平，就可以 了解被測環境中DNA損傷因子含量以及生物學效應。
本發明所涉及的可以感受DNA損傷因子的啟動子PddrA對環境DNA損 傷脅迫物理和化學因子相對之前發現的DNA損傷感應因子更加敏感，而應用 于生物感應器則更加靈敏。
圖1為耐輻射球菌P^/M的PCR凝膠電泳圖。 圖2為限制性內切鑒定重組質粒pRADZ3::PddrA。 圖3為生物傳感器DRZ423對低劑量y輻照脅迫的響應。 圖4為生物傳感器DRZ423對絲裂霉素C不同脅迫時間的響應。 圖5為生物傳感器DRZ423對不同濃度絲裂霉素C脅迫的響應。 圖6為生物傳感器DRZ423對N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍脅迫的響應。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明。 實施例1:耐輻射球菌基因啟動子PC^M的克隆
以耐輻射球菌野生型菌株(De/朋coccay ra&o^ram Rl ， ATCC No. 13939， 購自中國國家菌種保藏中心)基因組DNA為模板，以耐輻射球菌Rl基因組 為模版，采用以下所列引物，分別進行PCR擴增獲取候選基因啟動子片段。 以弓I物對5 ，AGTATCGCAGATCTCATAGGACGAAGGTAGAGGCG 3 ， ( SEQ IDNq: 2)和5ttgtctgtactagtctggacatcgctcagcttcat 3， (SEQ IDNq: 3),獲得了帶有DR0423基因預測啟動子的DNA片段P必m (SEQID
1)， "/。瓊脂糖電泳分離PCR產物，EB染色后用凝膠成像系統(Bio-rad， 美國)拍照觀察，結果如圖l所示。在確定所克隆的DNA片段大小后，在紫 外透射儀(Welltech，中國)上割下目標DNA條帶，并用凝膠DNA回收試劑 盒(百泰克，北京)純化回收。
實施例2:以Pt^M為感應元件的DNA損傷感應器DRZ423的構建 在Pt^M的PCR產物回收純化之后，用限制性內切酶Sgffl和酶切 PCR產物，并以同樣限制性內切酶消化耐輻射球菌/大腸桿菌穿梭質粒pRADZ3
(pRADZ3具體信息參考文獻Meim， 2001)，在用1%瓊脂糖凝膠電泳將酶切 產物分離后，紫外透射儀下割膠，用凝膠DNA回收試劑盒純化回收目標DNA 片段。將純化回收的P必M和線性化的pRADZ3按比例混合，用T4連接酶
(NEB，英國)，在16°C反應16小時后，轉化到DH5a感受態細胞，用50|ig^l 氨芐青霉素篩選陽性克隆。將陽性克隆轉移至含相同濃度的氨芐青霉素的液體 LB培養基，在37°C中培養10小時后，取1.5ml菌液用質粒提取試劑盒(百 泰克，北京)提取質粒。取少量質粒用BglII/Spel酶切1小時后，1%瓊脂糖凝 膠電泳分離，EB染色，在凝膠成像系統中成像，結果顯示P^/d已經成功構 建到了 pRADZ3質粒上(圖2)，將該重組質粒命名為pRADZ3::PddrA。將 pRADZ3::P6^M質粒用CaC12法導入到耐輻射球菌Rl菌株中，用氯霉素篩選 陽性克隆，得到生物感應器DRZ423。在該生物感應器中，PA/M啟動子可以 感應環境中的DNA損傷因子，即環境DNA損傷因子造成宿主菌DNA的損傷， 而這種損傷信號導致P必"驅動/^Z基因轉錄，而借助Beta-Glo 檢測系統
(Promega，美國)，可以快速檢測宿主菌中P-半乳糖苷酶的含量。實施例3: DNA損傷生物感應器DRZ423感應低劑量y射線 耐輻射球菌DRZ423菌株在TGY培養基(0.5%蛋白胨，0.3%酵母粉，0.1% 葡糖糖)中培養到指數生長期(OD6(xr 0.8)，細胞經離心收集后，被懸浮在10ml 磷酸鈉緩沖液中，對其中lml菌液在室溫下以不同劑量水平進行輻照l小時。不
同劑量水平通過調整樣品同Y射線放射源之間的距離來實現，輻照實驗在浙江 大學輻照中心進行。輻照處理后，細菌在32。C下的新鮮TGY培養基中培養1小 時，之后收集菌體，重新懸浮于lml0.9。/。的NaCl溶液中，稀釋1000倍后取25u l菌液，其中的(3-半乳糖苷酶用Beta-Gk^檢測系統(Promega，美國)檢測。 根據廠家產品使用說明書，將上述25 u l菌液在專用石英管中與試劑盒中等體積 的發光試劑混合，避光靜置lh后用測定發光值。每個樣品進行了三次平行實驗。 所有發光值均扣除了本底。
由于在DRZ423菌株中，啟動子活性體現在/""基因的表達量。而在 Beta-Glo 檢測系統中，被檢測到的熒光量同(3-半乳糖苷酶的量呈比例。因此， 檢測到的熒光量同啟動子活性在一定范圍內線性相關。
這里我們在DRZ423菌株中，測定了熒光強度同低劑量Y射線輻照劑量的 相關性。結果顯示，在不同劑量的Y射線照射后，DRZ423顯示出不同的熒光 誘導特性。其中，DRZ423菌株在50GyY射線輻射下便開始表達P-半乳糖苷酶， 隨后隨著輻射劑量增加，熒光產生強度相應增加，并呈現了一定的線性關系(圖 3)。
實施例4: DNA損傷生物感應器DRZ423感應絲裂霉素C 根據例3中所述的檢測原理和方法，本例演示了DNA損傷生物感應器 DRZ423對絲裂霉素C脅迫的響應情況。在實驗中，指數增長期的DRZ423菌液 以100uL分裝，在室溫下分別加入luL不同濃度的絲裂霉素C (Roche,美國) 處理1小時，并隨后在32。C下后培養0.5、 1、 1.5和2小時。處理過的樣品離心收 集菌體，重新懸浮于lmL0.9e/。的NaCl溶液中，稀釋1000倍后取25 u L菌液，在 專用石英管中與25 y L發光試劑混合，避光靜置lh后用Beta-Glo敷險測系統測定 發光值。每個樣品進行了三次平行實驗。所有發光值均扣除了本底。
實驗結果顯示，在絲裂霉素C濃度0.001 pg/mL到1 lag/mL之間，熒光 強度同濃度劑量始終呈線性關系(圖4和圖5)。最大值出現在用10 |Lig/mL 劑量處理后。在更高的濃度下，由于細胞毒害效應，熒光誘導曲線不再上升并 保持穩定。更高濃度的絲裂霉素C也導致細胞生存力顯著下降，這也導致了熒光強度顯著減少。這些結果表明，利用啟動子Pc/c/^可以感應化學毒物絲裂霉
素C對細胞的損傷。
實施例5: DNA損傷生物感應器DRZ423感應MNNG
根據例3中所述的檢測原理和方法，本例演示了DNA損傷生物感應器 DRZ423對MNNG脅迫的響應情況。在MNNG處理實驗中，指數增長期的 DRZ423菌液以100 u L分裝，在室溫下分別加入l u L不同濃度的MNNG處理1 h，并隨后在32。C下復愈1小時。處理過的樣品離心收集菌體，重新懸浮于lmL 0.9。/。的NaCl溶液中，稀釋1000倍后取25"L菌液，在專用石英管中與25 u L發 光試劑混合，避光靜置lh后用Beta-Glo 檢測系統測定發光值。每個樣品進行 了三次平行實驗。所有發光值均扣除了本底。
實驗結果如圖6所示，生物感應器DRZ423在低濃度MNNG (0-20nmol/L) 脅迫下，呈現了MNNG濃度與發光信號強度的線性正比關系；而較高濃度 MNNG (100-400^imol/L)的脅迫下，DRZ423產生的發光信號與MNNG濃度也 呈現了較好線性正比關系。這些數據表明，生物感應器DRZ423可以檢測DNA 損傷因子N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)以及其生物學效應。
綜合實例3、實例4以及實例5，本發明所涉及耐輻射球菌DNA損傷感受 因子P^/M可以結合報告基因/^Z，并導入到宿主細菌耐輻射球菌野生菌株 Rl中，得到生物感應器DRZ423。 DRZ423中P-半乳糖苷酶的含量可以顯示環 境中DNA損傷因子，包括Y射線、絲裂霉素C和N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍 等存在和相對定量，同時也可以反應活性細胞內DNA損傷的情況和生物學效 應。另外，也可以將報告基因&cZ換成其他報告基因，比如熒光蛋白，同時檢 測方法也可相應改變。總之，本發明所涉及的DNA損傷感應因子P^^4可以 感應造成DNA損傷的物理化學因子，將該啟動子與相關報告基因和宿主菌結 合可以形成生物感應器，并利用相應的檢測手段，可以監視環境遺傳毒物以及 其生物學效應。<210> 1 <211> 221 <212> DNA
<213>而摘射球菌(De/"ococczw raii/o血raw) <■> 1
CATAGGACGA AGGTAGAGGC GGCGGTGGAG
CCCGCGTCAG TGCGCCGGAG CCGGGGCCCA
CAGAGCAGGC AGGGGCCGCC CCGAACCCCT
CTGGCGTTTT ATGTCTTGAC CGTAATGTTA
ATGAAGCTGA GCGATGTCCA G
<210> 2 <211> 35 <212> DNA
<213>耐輻射球菌(Dez'MOCoccus ra&)血raws) <400> 1
AGTATCGCAG ATCTCATAGG ACGAAGGTAG AGGCG
<210> 3 <211> 35 <212> DNA
<213>而寸輻射球菌(De/"ococcM"Wo血ra"s) <400> 1
TTGTCTGTAC TAGTCTGGAC ATCGCTCAGC TTCAT
GGCGGCGCGG GAGGGTCTAG 50
CTCTGCCGAA AGCTGGCCGA 100
CTCCATTTCC CCTTAATCAA 150
TTCTGTTCTA AACTAAATGC 200
權利要求
1.一個感受DNA損傷因子的啟動子，名稱為PddrA，來源于耐輻射球菌菌株，由221個堿基對組成，該啟動子從5端第1到221個堿基，具有SEQ IDNo1的核苷酸序列。
2. 權利要求1所述的感受DNA損傷因子的啟動子在制備生物感應器中的 應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述生物感應器在監視環 境遺傳毒物以及其生物學效應中應用。
全文摘要
本發明提供一個可感受DNA損傷因子的啟動子，來源于耐輻射球菌菌株(Deinococcus radiodurans R1)，具有SEQ ID No1的核苷酸序列。本發明提供的啟動子，與一些報告基因相結合，并導入到相關宿主細胞得到生物感應器。這些生物感應器可以感受環境中DNA損傷因子，不僅可以相對定量，而且可以了解環境有害物理和化學因子的生物學效應。本發明形成的生物感應器，可廣泛用于DNA損害因素相關的定性、定量的檢測以及環境有害因子的活體生物學效應的觀察，可以監視環境遺傳毒物以及其生物學效應。
文檔編號C12N15/11GK101619314SQ20091010097
公開日2010年1月6日 申請日期2009年8月6日 優先權日2009年8月6日
發明者華躍進, 陸 范, 陸輝明 申請人:浙江大學