一種乙烯應答因子基因OsERF3及其啟動子在調控水稻根發育中的用途
【專利摘要】本發明公開了一種乙烯應答因子基因OsERF3在調控水稻根發育中的應用，通過酵母雙雜交的方法，篩選到了一個與已經公開發表的OsWOX11蛋白互作的乙烯應答因子OsERF3。通過超表達和人工小干擾RNA的方法，得到該基因相應的轉化水稻，發現超表達該基因后植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株增長、增多，而主根的增長是由于根尖成熟區細胞的長度增長引起的；而人工小干擾RNA轉基因植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株變短、變少，主根的變短是由于分生區和成熟區細胞的長度變小引起的。表明該基因具有促進水稻根發育的功能。該基因啟動子與報告基因β-葡萄糖苷酸酶融合的結果表明該基因在根尖分生區中表達。
【專利說明】—種乙稀應答因子基因0sERF3及其啟動子在調控水稻根發育中的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物基因工程【技術領域】。具體涉及一種調控水稻根部發育的乙烯應答因子基因0SERF3的用途，還涉及一種乙烯應答因子基因0SERF3啟動子在調控水稻根發育中的用途。
【背景技術】
[0002]根是植物適應陸生生活的重要器官，大多數生長在土壤里，構成了植物的地下部分，其主要功能是吸收、輸出、支持、合成和儲藏。因此，根對于整個植物的生長發育具有重要作用，而研究植物根的發育機制，為我們在生產實踐中改良作物習性，提高作物產量提供了重要的理論基礎與方向。
[0003]目前植物中對于根的結構和發育研究得最清楚的當屬雙子葉植物擬南芥。擬南芥的根系為直根系，主要由主根(primary root, PR)和側根(lateral root, LR)組成。相比于擬南芥而言，作為單子葉植物的水稻，其根系為典型的須根系，除了主根(primaryroot, PR)和側根(lateral root, LR)外，還具有大量的冠狀根(crown root, CR)。目前，在水稻中已經分離和鑒定出幾個根發育相關的突變體和基因，這些基因和突變體均不同程度地影響著主根(PR)、側根(LR)和冠根(CR)的發育。QHB是植物中最早報道在水稻根的不活動中心特異表達的WUSCHEL-type homeobox類基因，在其超量表達的轉基因植株中沒有冠根(CR )的形成(Noriko Kamiya et al., Isolation and characterizationof a rice WUSCHEL-type homeobox gene that is specifically expressed in thecentral cells of a quiescent center in the root apical meristem.the PlantJournal.2003，35，429-441)。在 crll，crl2 (crown rootlessl, crown rootless2)突變體中，水稻根部CR數目減少，而這主要是由于冠根(CR)發育的起始受到影響所致(YoshiakiInukai et al., Crown rootlessl, Which Is Essential for Crown Root Formation inRice, Is a Target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in Auxin Signaling.The Plant Cell2005，17，1387-1396)。ARLl (Adventitious rootlessl)編碼一個含有 LATERAL ORGANBOUNDARIES (LOB)結構域的蛋白，在側根、不定根原基，分裂原基，維管組織等中表達，參與了生長素介導的細胞分化，促進中柱鞘中原始細胞的分裂，從而參與調控水稻中不定根的產生(Hongjia Liu et al., ARLlj a LOB-domain protein required for adventitiousroot formation in rice,the plant journal 2005，43，47-56)。
[0004]AP2/ERF (APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)家族轉錄因子是植物中重要的一類轉錄因子，廣泛參與植物各類生理過程。從秈稻品種9311中克隆得到的AP2 / ERF基因OsEATB通過與赤霉素生物合成途徑的互作發揮功能，其超量表達植株株高變矮，穗長變短，而有效分蘗和穗的發育潛能則有所提高(Weiwei Qij et al., Riceethylene-response AP2 / ERF factor OsEATB restricts internode elongationby down-regulating a gibberelI in biosynthetic gene,Plant Physiology,2011,157,216-228)。CRL5 屬于 AP2 / ERF 家族成員，其突變體 crl5 (crown rootless5)中冠根的起始受到影響，從而導致植株中冠根的數目變少(Yuka Kitomi et al.，Theauxin responsive AP2 / ERF transcription factor CROWN R00TLESS5 is involved incrown root initiation in rice through the induction of OsRRl, a type-A responseregulator of cytokinin signaling, the plant journal 2011，67，472_484)o0sERF922的轉基因抑制植株對水稻稻瘟病的抗性增強，其超表達植株則表現出對稻瘟病的易感性；同時，超量表達0sERF922后,植株對鹽脅迫的耐受力也降低(Dongfeng Liu, et al., The riceERF transcription factor 0sERF922negatively regulates resistance to Magnaportheoryzae and salt tolerance, Journal of Experimental Botany,2012)。
[0005]綜上所述，水稻根的發育是受多種機制調控的，諸如生長素及其他特定的轉錄因子復合物等，而AP2 / ERF類轉錄因子在調控水稻根發育中的作用機制目前尚未明確。本發明找到了一個來源于粳稻ZH11，與目前已發表的OsWOXll (Zhao Yu et al., TheWUSCHEL-Related Homeobox Gene W0X11 Is Required to Activate Shoot-Borne CrownRoot Development in Rice, The Plant Cell, 2009)互作，控制著水稻冠根(CR)和主根(PR)等多方面發育的轉錄因子基因。該基因超量表達后植株PR長度和CR數目明顯高于野生型，抑制表達該基因后，PR長度和CR數目則低于野生型。該基因啟動子與報告基因GUS融合及原位雜交的結果表明該基因在根尖分生區中表達。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是在于提供了一種乙烯應答因子基因0sERF3在調控水稻根發育中的應用，超量表達該基因后植株主根(PR)長度和冠根數目(CR)明顯高于野生型，抑制表達該基因后，PR長度和CR數目則低于野生型。
[0007]本發明的另一個目的是提供了一種乙烯應答因子基因0sERF3啟動子在調控水稻根發育中的應用，該基因啟動子與報告基因GUS融合及原位雜交的結果表明該基因在根尖分生區中表達。
[0008]為了實現上述的目的，本發明通過以下技術方案實現:
[0009] 申請人:通過酵母雙雜交實驗，由已報道的OsWOXll (Zhao Yu et al.，TheWUSCHEL-Related Homeobox Gene W0X11 Is Required to Activate Shoot-Borne CrownRoot Development in Rice, The Plant Cell, 2009)作為誘傅蛋白，從水稻兩分葉時期的根部酵母文庫中篩選并分離得到一個調控植物根部發育的乙烯應答因子基因0sERF3，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，由708個堿基組成，其推測的蛋白質編碼序列有708個堿基，是序列I自5’端第I位堿基到708位堿基組成。該基因在調控水稻根發育方面的功能尚未有任何文獻報道。將該基因的完整翻譯區(Coding Sequence)與玉米泛素啟動子(Ubiquitin)結合后直接轉入水稻，轉基因植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株增長、增多，而主根的增長主要是由于根尖成熟區細胞的長度增長引起的；構建該基因的人工小干擾RNA載體(序列為SEQ ID NO: 2)，轉入水稻后，轉基因植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株變短、變少，且主根的變短主要是由于分生區和成熟區細胞的長度變小引起的。構建該基因的啟動子與報告基因GUS融合的載體，轉化水稻本身，結果發現該基因在根尖分生區中表達。表明該基因具有促進水稻根發育的功能。[0010]本發明構建了一種超表達載體PU1301，獲得轉化載體PU1301-ERF3、pul301-amiERF3、pl381-ERF3promoter_GUS，利用該轉化載體轉化水稻品種“中花11”(見遺傳資源來源披露表-1 )，得到該基因的超表達轉基因水稻植株，抑制表達轉基因水稻植株和啟動子與報告基因GUS融合的轉基因植株。
[0011]一種乙烯應答因子基因0sERF3及其啟動子在調控水稻根發育中的應用，其步驟是:
[0012]I)以已經報道的0sW0Xll(Zhao Yu et al., The WUSCHEL-Related Homeobox GeneWOXll Is Required to Activate Shoot-Borne Crown Root Development in Rice, ThePlant Cell，2009)全長蛋白作為誘餌篩選本實驗室構建的水稻兩分蘗時期酵母文庫，互作克隆經測序及序列比對后(序列比對網站NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov),發現其中一個互作克隆為數據庫中命名為0sERF3的基因的全長cDNA，登錄號為AP003299。根據該數據庫中提供的序列設計引物對，以水稻cDNA為模板，擴增了 0sERF3的全長(翻譯起始位點至下游708個堿基)，一種分離的DNA片段，乙烯應答因子基因0sERF3，其序列為SEQ IDN0:1所示的核苷酸序列，所述引物對DNA序列如下:[0013]OXERF3-F (正向引物)5 ’ -GGGGGTACCATGGCGCCCAGAGCAGCTAC-3 ’
[0014]oxERF3-R (反向引物)5 ’ -CGCGGATCCCTAGTTCTCTACCGGCGGCGG-3 ’
[0015]將數據庫中命名的0sERF3的登錄號提交到人工小干擾RNA構建網站WMD3 (http://wmd3.weigelworld.0rg / cg1-bin / webapp.cgi),數據庫自動輸出構建針對0sERF3的小干擾RNA引物的DNA序列，以水稻中通用的小干擾RNA構建載體NW55(Norman Warthmann et al., Highly Specific Gene Silencing by Artificial miRNAs inRice1PloS ONE, 2008, (3): el829)為模板，擴增了一段 DNA 序列，其序列為 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，所述引物DNA序列如下:
[0016]I miR-s:5’ -AGTAAAGTAAGGATGCGTTGCTTCAGGAGATTCAGTTTGA-3’
[0017]II miR-a:5’ -TGAAGCAACGCATCCTTACTTTACTGCTGCTGCTACAGCC-3，
[0018]III miR*s:5’ -CTAAGCATCGCTTCCTTACTTTATTCCTGCTGCTAGGCTG-3’
[0019]IV miR*a:5，_TAAAGTAGGAAGCGATGCTTAGAGAGGCAAAAGTAA_3，
[0020]G-11491’:5，-TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’
[0021]G-11494’:5’ -TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3
[0022]3)將步驟 I)中得到的全長 cDNA 序列提交到 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上進行序列比對，找到覆蓋該基因的BAC序列，登錄號為AP003299，從0sERF3的起始密碼子上游設計引物，擴增出該基因的啟動子區域，其序列為SEQ N0:3所示的核苷酸序列，所述的引物DNA序列如下:
[0023]ERF3 promoter-Fl: 5，-CGCGGATCCGCTAGCAGCGCCTGGTACAT-3，
[0024]ERF3 promoter-Rl: 5，-ACGCGTCGACGTGTTTTGGGAGGTTGGGTT-3，
[0025]4)將步驟1)、2)中擴增的片段分別連接到超表達載體pul301 (Sun andZhou, 2008, Rice jmjC domain-containing gene JMJ706 encodes H3K9 demethylaserequired for floral organ development.PNAS.36 13679-13684)上。pul301 是由國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301 (Sun等,2004, Xa26, a gene conferringresistance to Xanthomonas oryzae pv.0ryzae in rice,encoding a LRR receptorkinase-like protein.Plant Journal.37:517-527)基礎上改造而成。獲得轉化載體pul301-ERF3和pul301-amiERF3 ;將步驟3)中擴增的片段連接到pCAMBIA1381(購自 CAMBIA公司)，獲得轉化載體 pl381-ERF3promoter_GUS。
[0026]4)利用農桿菌介導的轉基因方法(Hiei Y et.al., Efficient transformationofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.PlantJ.1994，6:271-282)將所述的載體分別導入水稻受體中花11 (詳見遺傳資源來源披露表-1)，獲得轉化植株；
[0027]5)借助PCR的方法分析鑒定陽性轉基因植株，再利用Northern blot、Realtime-PCR、⑶S染色分析轉基因植株中相關基因的表達；
[0028]6)鑒定轉基因植株的表型，并進行統計分析。
[0029]一種乙烯應答因子基因0sERF3及其啟動子的功能驗證和應用，其步驟是: 申請人:克隆得到水稻乙烯應答因子基因0sERF3及其啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQIDN0.3中所示。發明通過遺傳轉化該基因的超表達，人工小干擾RNA載體和啟動子融合報告基因GUS載體，得到相應的轉基因植株。發現超表達該基因后植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株增長、增多，而主根的增長主要是由于根尖成熟區細胞的長度增長引起的；而人工小干擾RNA轉基因植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株變短、變少，且主根的變短主要是由于分生區和成熟區細胞的長度變小引起的。該基因啟動子與報告基因GUS融合及原位雜交的結果表明該基因在根尖分生區中表達。表明該基因具有促進水稻主根伸長和冠根發生的功能。
[0030]與現有技術相比，本發明的優點如下:
[0031]水稻作為全球的主要糧食作物之一，對緩解糧食短缺，尤其是保障我國的糧食安全有著重要的意義，如何提高水稻產量已經成為一項具有重要意義的科學問題。根作為植物的重要器官，在整個植株的生長過程中發揮著重要角色，根的生長發育勢必會影響植株的產量。目前AP2 / ERF類轉錄在水稻根發育過程中作用的研究文章僅有幾例，本發明的AP2 / ERF轉錄因子0sERF3在水稻根發育過程中的作用尚未有任何報道。本發明通過遺傳轉化該基因的超表達和人工小干擾RNA載體，得到相應的轉基因植株。發現超表達該基因后植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株增長、增多一倍左右，(見圖5)，而主根的增長主要是由于根尖成熟區細胞的長度增長引起的(見圖7);而人工小干擾RNA轉基因植株主根長度和冠根數目明顯比野生型對照植株變短、變少約一倍(見圖6)，且主根的變短主要是由于分生區和成熟區細胞的長度變小引起的(見圖7)。該基因啟動子與報告基因β -葡萄糖苷酸酶融合的結果表明該基因在根尖分生區中表達(見圖8)表明該基因具有調控水稻根發育的功能。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0032]圖1為一種篩選水稻兩分蘗時期根部文庫得到的0sERF3陽性克隆酵母驗證結果示意圖。
[0033]圖2為一種超表達載體pul301的結構示意圖。
[0034]圖3為一種0sERF3在轉基因超量表達植株中的表達量示意圖。
[0035]圖4為一種0sERF3在轉基因人工小干擾RNA植株中的表達量示意圖。[0036]圖5為一種在0sERF3超量表達植株中PR，CR與野生型的形態學比較及統計學分析示意圖。
[0037]圖6為一種在0sERF3人工小干擾RNA植株中PR，CR與野生型的形態學比較及統計學分析示意圖。
[0038]圖7為一種在0sERF3超量表達植株、0sERF3人工小干擾RNA植株以及野生型植株中PR分生區、成熟區的形態學比較及細胞長度的統計學分析示意圖。
[0039]圖8為一種0sERF3啟動子融合報告基因⑶S后轉基因植株中根尖部位報告基因⑶S表達的石蠟切片圖。
【具體實施方式】
[0040]實施例1:0sERF3超表達載體的構建
[0041]對本發明所需要的基因0sERF3，主要通過RT-PCR方法(參見:J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，北京，科學出版社，2002版)進行擴增得到0sERF3基因特異的一段序列。具體操作如下:
[0042]I)抽提來自水稻品種“中花11”(見遺傳資源來源披露表-1)幼苗葉片的RNA，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；
[0043]2) RT-PCR中反轉錄合成cDNA第一鏈的步驟如下:①配制混合液I --總RNA 4 μ g，DNaseI 2U, IOxDNaseI buffer I μ 1，加DEPC (焦碳酸二乙酯，RNA酶的強烈抑制劑)處理水(0.01 % DEPC)到10 μ 1，混勻后將混合液I在37°C放置20分鐘以除去DNA，②20分鐘后將混合液I置于65°C水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液I中加入I μ I 500 μ g / ml的oligo(dT),④將在冰上冷卻的混合液I立即置于65°C水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘，⑤配制混合液2:混合液 110 μ I, 5x first strand buffer 4 μ 1,0.1M DTT (疏基乙醇)2 μ I, IOmM dNTP mixture
1.5 μ I，DEPC處理水0.5 μ I，反轉錄酶2 μ I，混勻后將混合液2置于42°C水浴鍋內溫浴1.5小時，⑥反應結束后將混合液2置于90°C干浴3分鐘，⑦-20°C保存反應最終產物，反應中用到的試劑全部購自Invitrogen公司。
[0044]3)然后根據 NCBI 數據庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)公布的 0sERF3 基因的全長cDNA序列，設計特異引物PCR擴增特異片段。PCR用到的體系為20 μ 1，具體配法為:cDNA 第一鏈模板 I μ 1，IOxPCR buffer 2 μ I, IOmM dNTP 1.6 μ 1,2.5mM Mg2+1.5μ I,oxERF3-F和oxERF3-R引物各0.4 μ I (用于超表達的引物為oxERF3_F和oxERF3_R ；)，LATaq酶0.2 μ 1，加水到20 μ I (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應條件如下:①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③58°C 30秒，④72°C 60秒，⑤從②一④循環35次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。
[0045]用來克隆0sERF3超表達載體片段的引物為:
[0046]oxERF3-F (正向引物)5’-GGGGGTACCACTTGTAAACCTGCTGCACC-3，
[0047]oxERF3-R (反向引物)5’-CGCGGATCCCTAGTTCTCTACCGGCGGCGG-3’
[0048]最終得到的0sERF3基因的超表達載體片段的cDNA序列，一種乙烯應答因子基因0sERF3 (分離的DNA片段)，其序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0049]4)最后將擴增產物連接到T / A克隆載體pGEMT-vector (購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)上用T7和SP6引物測序驗證。
[0050]5)將擴增產物連接到超表達載體pul301得到質粒pu301-ERF3-EHA105。
[0051 ] 實施例2:0sERF3人工小干擾RNA載體的構建
[0052]I)以 NW55 質粒為模板，先以引物 I miR_s 和 III miR*s，II miR-a 和 IV miR*，IImiR-a和III miR*s擴增3組PCR反應(PCR體系及程序與實施例1中所述的PCR體系及程
序一致)。
[0053]2)從以上3組PCR反應中各取0.5μ I PCR產物為模板，以引物對G-11491’和G-11494;擴增(PCR體系及程序與實施例1中所述的PCR體系及程序一致；G_11491’和G-11494’由生工生物工程(上海)有限公司合成)。
[0054]用來構建人工小干擾RNA載體的引物為:
[0055]I miR-s:5’ -AGTAAAGTAAGGATGCGTTGCTTCAGGAGATTCAGTTTGA-3’
[0056]II miR-a:5’ -TGAAGCAACGCATCCTTACTTTACTGCTGCTGCTACAGCC-3，
[0057]III miR*s:5’ -CTAGCATCGCTTCCTTACTTTATTCCTGCTGCTAGGCTG-3’
[0058]IV miR*a:5’ _TAAAGTAAGGAAGCGATGCTTAGAGAGGCAAAAGTA_3，
[0059]G-11491’:5’ -TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3J
[0060]G-11494’:5，-TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3，
[0061]最終得到的0sERF3基因人工小干擾RNA載體片段的cDNA序列，其序列為SEQIDN0.2 所示。
[0062]3)將擴增產物連接到T / A克隆載體pGEMT-vector (購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)上用T7和SP6引物測序驗證。
[0063]4)將擴增產物連接到超表達載體pul301得到質粒pu301-amiERF3-EHA105。
[0064]實施例3:0sERF3啟動子融合報告基因⑶S的載體構建
[0065]I)抽提水稻品種“中花11”((見遺傳資源來源披露表-1)葉片總DNA。DNA抽提方法為 CTAB法(Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonicarice detected by RFLP analysis, 1992, Theor Appl Genet, 83，495-499)，以葉片總 DNA為模板，以啟動子擴增引物擴增ERF3啟動子序列(PCR體系及程序與實施例1中所述的PCR體系及程序一致)。
[0066]用來構建啟動子融合報告基因GUS的載體的引物為:
[0067]ERF3 promoter-Fl: 5，-CGCGGATCCGCTAGCAGCGCCTGGTACAT-3，
[0068]ERF3 promoter-Rl: 5，-ACGCGTCGACGTGTTTTGGGAGGTTGGGTT-3，
[0069]最終得到的0sERF3基因啟動子融合報告基因⑶S的cDNA序列，其序列為SEQ IDNO:3所示。
[0070]2)將擴增產物連接到T / A克隆載體pGEMT-vector (購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)上用T7和SP6引物測序驗證。
[0071]3)將擴增產物連接到載體pCAMBIA1381 (購自CAMBIA公司)，獲得轉化載體pl381-ERF3promoter-GUS-EHA105o
[0072]實施例4: 一種乙烯應答因子基因0sERF3在調控水稻根發育中的用途，其步驟是:
[0073]A、 雙元Ti質粒載體的轉化及轉基因植株陽性和表達量檢測:
[0074]I)將 pu301-ERF3-EHA105 (來自實施例 1)，pu301-amiERF3_EHA105 (來自實施例2)，pl381-ERF3Promoter-GUS-EHA105(來自實施例3)向水稻受體品種“中花11”(見遺傳資源來源披露表-1)轉化，轉化方法參照Hiei等人報道的方法(Hiei等，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J, 1994，6:271-282)進行。所獲得的TO代轉基因植株命名為0xERF3-n或amiERF3-n，其中n=l，2，3…代表轉基因的不同家系。
[0075]2)取TO代轉化植株葉片抽提總DNA (DNA抽提方法同實施例3)。然后用PCR方法對超表達TO代轉化植株和啟動子轉化植株用β_葡萄糖苷酸酶基因(GUS)引物進行陽性檢測，用G-11491’和G-11494’引物對人工小干擾RNA植株進行陽性檢測。
[0076]⑶S弓丨物的序列如下:
[0077]⑶S-LF:5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’
[0078]⑶S-LR:5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC-3，
[0079]G-11491，和 G-11494’ 引物序列如下:
[0080]G-1I49I’:5， -TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3’
[0081]G-11494’:5，-TCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3，
[0082]以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0083]PCR 反應總體積為 20 μ 1，具體配法是:模板 lOOng，IOxPCR buffer 2 μ 1，IOmMdNTP 1.6 μ 1,2.5mM Mg2+1.5 μ 1，左、右引物(⑶S-LF 和⑶S-LR)各 0.4 μ 1，r_Taq 酶
0.2 μ 1，加去離子水到20 μ I (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、r-Taq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應條件如下:①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③57°C 30秒，④72°C I分鐘，⑤從②一④循環32次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。PCR產物在1% (質量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測。因為⑶S基因和G-11491’和G-11494’引物片段為轉化載體所特有，這樣能擴增出⑶S基因或者G-11491’和G-11494’特異條帶的轉基因植株即為陽性植株。對TO代陽性植株收種子(Tl代)，為Tl代的大田種植和性狀調查做準備。
[0084]3)為了檢測超表達植株中的目標基因的表達量， 申請人:采用Northern-blot的方法對轉基因TO代植株進行了表達分析。實驗所用的總RNA來自分蘗期的水稻葉片，RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；Northern轉膜上樣量為15_μ g,探針標記采用隨機引物標記的方法,所使用的同位素標記物為a -32P_dCTP，膜在雜交管中先預雜交3個小時左右，然后加入同位素標記的探針，繼續雜交12個小時；雜交結束后，用2X檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，0.1%(體積/體積)十二烷基硫酸鈉(SDS)常溫下將雜交膜漂洗10分鐘，然后用同樣的洗膜液在65°C漂洗，每次兩分鐘，直到信號值合適為止。洗完膜以后將膜置于干凈的濾紙晾干，用保鮮膜包好，然后用磷屏(Phosphorimage，FUJI,日本)壓片6-9小時最后用FUJIFILMFLA5100掃描讀取結果。最終的到的TO代轉基因植株中0sERF3表達結果見圖3。其中，WT代表野生型水稻品種ZHll (見遺傳資源來源披露表-1)，0E3、0E4、0E8、0E9、0E10, 0E12, 0E14為0sERF3陽性超表達家系0xERF3-3、0xERF3-4、0xERF3_8、0xERF3_9、0xERF3_10、0xERF3_12、0xERF3_14 的縮寫，上排顯示各個轉基因家系中0sERF3的表達量，下排為rRNA上樣量。由此Northern-blot結果可以看出，與野生型ZHll相比，0E3、0E4、0E9、0E10、0E12、0E14家系中0sERF3的表達量均有提高，在這些家系中超表達ERF3有效果。[0085]4)為了檢測人工小干擾RNA植株中的目標基因表達量， 申請人:采用Real-timePCR的方法對轉基因TO代植株進行了表達分析。抽提了 TO代轉基因植株的總RNA，按照實施例I的方法進行反轉錄，得到產物后用實時熒光定量PCR的方法檢測0sERF3的表達量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應體系參見說明書。PCR儀為美國ABI公司的7500，PCR參數為95°C預變性10秒，進入循環后95°C變性5秒，60°C退火延伸40秒，45個循環。Real-time PCR所用引物序列為:
[0086]ERF3amiRT-F: 5，-GGCGTTCGCTTTCCTTTCA-3，
[0087]ERF3amiRT-R:5’ -CGGTGCAAGCTTCATCATACG-3’
[0088]最終得到的TO代轉基因植株中0sERF3表達結果見圖4。amiERF3_l到amiERF3_10為最終得到的10個轉基因家系，其中amiERF3-6為轉基因陰性，Real-time PCR結果顯示在轉基因材料中，0sERF3的表達與野生型ZHll相比，下降了約70%，抑制效果很好。
[0089]B、Tl代性狀調查和表達分析:
[0090]a:轉基因植株PR，CR表型分析及統計
[0091]I)將Tl代種子，超表達植株4個家系，分別為0xERF3-3，0xERF3_4，0xERF3_9，0xERF3-12 人工小干擾 RNA4 個家系，分別為 amiERF3_5，amiERF3_7，amiERF3_9，amiERF3-6(陰性對照)于含有50 μ g / ml潮霉素(Roche公司生產，50mg / ml)的盛有生根培養基的平皿上發芽3天，挑選根長勢一致的種子轉移到不含潮霉素的盛有生根培養基的方皿上繼續培養4天。
[0092]2)將方皿中的植株取出，水洗掉培養基后，觀察根部表型并照相。測量PR長度，記錄CR數目，結果見圖5和圖6。由圖5可以看出，發芽一周后，ERF3超量表達的各個家系0xERF3-3,0xERF3-4,0xERF3_9，0xERF3_12 植株 PR 長度和 CR 數目比野生型 ZHll (control)長、多(圖5左)，統計后發現，發芽一周的野生型ZHlI中，PR平均長度為2.15cm, CR平均數目為 1.4 個，而 0xERF3-3，0xERF3_4，0xERF3_9，0xERF3_12 中，PR 平均長度分別為 4.14cm,
3.55cm, 3.71cm, 2.12cm, CR數目分別為2.86個，2.81個，3.6個，1.7個，為圖5右所示。而抑制ERF3表達后，轉基因陽性家系amiERF3-5，amiERF3_7，amiERF3_9中PR長度，CR數目與野生型(WT)和陰性對照amiERF3-6均下降了一半左右(圖6)。可見，ERF3后可以促進主根的伸長和冠根的發生。
[0093]b:轉基因植株根部半薄切片分析
[0094]將Tl代種子超表達植株4個家系，分別為0xERF3-3，0xERF3_4，0xERF3_9，0xERF3-12 人工小干擾 RNA4 個家系，分別為 amiERF3_5，amiERF3_7，amiERF3_9，amiERF3-6(陰性對照)于含有50 μ g / ml潮霉素(Roche公司生產，50mg / ml)的盛有生根培養基的平皿上發芽3天，切取主根(PR)根尖l-2cm組織于50% (體積/體積)甲醛溶液(甲醛5ml，冰醋酸5ml，50% (體積/體積)酒精90ml)中固定，在真空干燥箱(HotpackVacuum OVEN)中抽真空30min至根尖組織不再有氣泡冒出。室溫下于50% (體積/體積)甲醛溶液中繼續固定24小時。挑取根尖于尚未凝固的1% (質量/體積)的瓊脂糖中包埋，待完全凝固后修塊。包埋有根尖的瓊脂糖塊于75%，85%，95% (體積/體積)乙醇溶液中脫水I小時，最后于100% (體積/體積)乙醇中加入曙紅染料后繼續脫水I小時，重復此步驟一次。滲透液預滲透1-2小時，加入硬化劑后滲透1-2小時(小于5小時)，65°C展片臺上，往半薄切片專用模具中加入聚合液包埋根尖材料，65°C烘干2小時，(半薄切片中所用到的樹脂，硬化劑，滲透劑等均購自Heraeus Kulzer Dental公司)。轉入37°C恒溫箱(電熱恒溫隔水式培養箱，黃石恒豐醫療器械有限公司生產)中聚合3-4天，超薄切片機上切片，切片后于展片臺上烘干切片，固綠染色5min，單蒸水票洗掉染料，再于顯微照相機上照相分析。選取清晰、可分辨根尖組織的切片對根尖分生區、成熟區細胞長度及細胞數目進行統計分析。結果及其統計學分析見圖7。半薄切片結果可見，轉基因抑制植株中，伸長區及成熟區細胞長度均比野生型下降，而超表達植株中成熟區細胞的長度與野生型相比有較大的伸長，伸長區不明顯。
[0095]c:0sERF3啟動子融合報告基因⑶S轉基因植株根部石蠟切片分析
[0096]將Tl代種子于含有50 μ g / ml潮霉素(Roche公司生產，50mg / ml)的盛有生根培養基的平皿上發芽3天，切取主根l_2cm于⑶S染料中染色過夜，95% (體積/體積)乙醇脫色后將根轉入含50% (體積/體積)乙醇的FAA (甲醛5ml，冰醋酸5ml，50%酒精90ml)中固定過夜，再分別用50%，60%，70%，80%，90% (體積/體積)脫水各I小時后，加入曙紅染色過夜，出去染液后，用無水乙醇洗兩次，每次I小時徹底出去水分，再依次用乙醇:二甲苯=1:1和1:3，以及純二甲苯透明各I小時，再向其中加入碎的石蠟，待石蠟慢慢溶于二甲苯后再繼續添加石蠟并置于37°C溶解，飽和后再置于60°C，直至飽和后再依次用溶于二甲苯的50% (體積/體積)，75% (體積/體積)和純的石蠟替換，最后將材料包埋在純的石蠟中，冷卻后用于石蠟切片。結果見圖8。石蠟切片結果顯示GUS染色區域主要集中于根尖伸長區，表明0sERF3在根中有表達 。
【權利要求】
1.一種乙烯應答因子基因0SERF3在調控水稻根發育中的應用。
2.—種乙烯應答因子基因OsE`RF3啟動子在調控水稻根發育中的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK103525856SQ201210224636
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月2日 優先權日:2012年7月2日
【發明者】趙毓, 程賽鳳, 周道繡 申請人:華中農業大學