專利名稱：一種細胞核移植方法
技術領域：
本發明涉及胚胎學領域，尤其涉及一種細胞核移植方法。
背景技術：
"克隆"是英文"clone"音譯，是指一個動物經無性繁殖可孤雌生殖產 生的后代，克隆的所有后代的遺傳組成是完全相同的，又稱無性繁殖細胞 系。
動物克隆是指由一個動物不經過有性生殖的方式而直接獲得與親本具 有相同遺傳同質性后代的過程，包括孤雌激活生殖、同卵雙生、胚胎分割 以及核移植等。目前動物克隆主要通過細胞核移植及胚胎分割兩種方法獲 得，正常發育為具有相同遺傳物質的新個體。
核移植是通過顯微操作，電融合等實驗室手段，將發育一定階段的核 供體，如胚胎細胞或體細胞，及相應發育階段的核受體進行體外重構，如 去核的原核胚或成熟卵母細胞。通過重構胚的胚胎移植，達到大量生產遺 傳同質哺乳動物的一種生物工程技術。運用核移植方法，成功的獲得一只 克隆動物，需有效地完成下述過程供體細胞的選擇和處理、受體卵母細 胞的獲得與處理、在顯微操作儀下用顯微操作針顯微取核或用刀片切除法 去核，進行注射細胞、核質融合和卵母細胞激活、重構胚的體外培養以及 胚胎移植和體內發育。
以上方案中，細胞核移植過程中去核步驟采用了用顯微操作針顯微取 核，或用刀片切除法去核，這種操作步,驟不僅繁瑣，而且需要手工進行， 容易導致操作失誤，不能很好的保證細胞核移植的成功率。因此，現有技術還有待改進和提高。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的上述缺點，提供一種無需采用顯微 操作儀機械法，或刀片切除法去除受體卵母細胞細胞核的，易于操作、且 能快速準確去核的細胞核移才直方法。
本發明的技術方案如下 一種細胞核移植方法，包括以下步驟
A、 構建卵母細胞；
B、 采用濃度為0.05 ~ 20ug/ml的去核試劑，將所述卵母細胞處理0.5 ~ 26小時，獲得細胞質體；
C、 構建具有所需遺傳特性的供體細胞或細胞核，將細胞質體與所述供 體細胞或細胞核融合，得到重建的胚胎。
本發明所述的方法，其中，所述卵母細胞為需透明帶附著的卵母細胞。 本發明所述的方法，其中，所述卵母細胞為去透明帶的卵母細胞。 本發明所述的方法，其中，所述步驟B中，所述去核試劑的濃度為0.1~
10ug/ml，處理所述卵母細胞的時間為0.5~20小時。
本發明所述的方法，其中，所述去核試劑為防線菌素、阿霉素、柔紅
霉素、普卡霉素、光輝霉素、蠅蕈素和二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷中的一
種或幾種。
本發明所述的方法，其中，所述卵母細胞來源于哺乳動物。 本發明所述的方法，其中，所述哺乳動物是豬。
驟，簡化了該步驟的操作，可廣泛應用于多種物種的細胞核移植操作中。
圖1是本發明實施例的細胞核移植方法流程圖。
具體實施例方式
以下結合附圖，對本發明的較佳實施例加以詳細說明。
本發明提供的細胞核移植方法流程圖如圖l所示，具體包括以下步驟
5101、 構建卯母細胞；
.本發明方法的所有實施例中，卵母細胞可以是任何物種的卵母細胞。 通過活體采集成熟哺乳動物卯母細胞，或從離體卵巢上抽出后，經過體外 成熟獲得。本發明的具體實施如J中，哺乳動物優選為豬。從離體卵巢上采 集卯子，包括卵巢的采集，卵子的采集和卵子的成熟培養。
5102、 采用去核試劑處理所構建的卯母細胞，獲得細胞質體； 本發明中去除受體卵細胞的細胞核所采用的試劑，除包括以下實施例
中所列舉的試劑外，還包括發揮類似功能的全部可代替的試劑，包括大多 數抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin )、防線菌素A/D (Actinomycin A/D )、 柔紅霉素(daunorubicin )、普卡霉素(plicamycin )、光輝霉素(mithramycin )、 蠅蕈素(a-amanitin)和二氯苯并咪唾p夫喃型核糖苷(5， 6-dicWoro畫l陽P -D-ribofiiranosylbenzimidazole)等。該去除受體細胞核所釆用的試劑，以下 均稱為去核試劑，其對卵母細胞的處理濃度為0.05~20ug/ml,作用時間為 0.5~26小時，優選為0.1 ~ 10ug/ml,作用時間優選為0.5 ~ 20小時。
5103、 構建具有所需遺傳特性的供體細胞或細胞核，將細胞質體與供 體細胞或細胞核融合，得到重建的胚胎。
以下提供IO組具體實施例，以說明本發明所提供的細胞核移植最佳實 施方法。其中，實施例l、 2、 3、 4和5是針對需透明帶附著的卵母細胞進 行細胞核移植的操作，實施例6、 7、 8、 9和10是針對去透明帶的卵母細 胞進行細胞核移植的操作。實施例1
針對需透明帶附著的卵母細胞進行克隆的才喿作一
(1)用0.1ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵 母細胞20小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，便于進行顯微操作；
(3 )將棵卵放入顯微操作盤操作滴中，用固定管從極體對側固定卵母 細胞，通過尖的去核管吸取供核細胞，直接把供核細胞注入卵母細胞質內， 退針時，順勢將第一極體一并去除，即去除極體的遺傳物質，并整理和恢 復卯膜切口。如果是采用卵周隙注入法，為有利于融合，用去核管先吸取 少量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卵周隙中，使供體細胞與 卵膜緊貼在一起；
(4) 依據不同實驗設定電融合參數，將核移植后的細胞進行融合，模 擬精子入卵時的鈣離子波動，使供體細胞充分融入卵母細胞中，電激后的 重組胚移入培養液中，于恒溫培養箱，培養40分鐘；
(5) 依據不同實馬t沒定參數，將核移植重組胚的進行化學處理，抑制 染色體排出，保證重構胚倍型，處理后的重組胚放入培養液中，在38.5。C、 5%的C02培養箱中培養5天，觀察嚢胚的發育情況良好。
實施例2
針對需透明帶附著的卵母細胞進行克隆的操作二
(1) 角10ug/ml阿霉素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵母 細胞0.5小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，便于進行顯微操作；
(3 )將棵卵放入顯孩封喿作盤操作滴中，用固定管從極體對側固定卵母 細胞，通過尖的去核管吸取供核細胞，直接把供核細胞注入卵母細胞質內，退針時，順勢將第一極體一并去除，即去除極體的遺傳物質，并整理和恢
復卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，為有利于融合，用去核管先吸取 少量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卵周隙中，使供體細胞與 卵膜緊貼在一起；
'(4)依據不同實驗設定電融合參數，將核移植后的細胞進行融合，模 擬精子入卵時的釣離子波動，使供體細胞充分融入卵母細胞中，電激后的 重組胚移入培養液中，于恒溫培養箱，培養30分鐘；
(5)依據不同實^i殳定參數，將核移植重組胚的進行化學處理，抑制 染色體排出，保證重構胚倍型，處理后的重組胚放入培養液中，在38.5。C、 5%的C02培養箱中培養7天，觀察嚢胚的發育情況良好。 實施例3
針對需透明帶附著的卵母細胞進行克隆的操作三 '(1)用5ug/ml柔紅霉素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵母 細胞10小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成凈果卯，〗更于進行顯凝:操作；
(3 )將棵卵放入顯微操作盤操作滴中，用固定管從極體對側固定卵母 細胞，通過尖的去核管吸取供核細胞，直接把供核細胞注入卵母細胞質內， 退針時，順勢將第一極體一并去除，即去除極體的遺傳物質，并整理和恢 復卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，為有利于融合，用去核管先吸取 少'量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卵周隙中，使供體細胞與 卵膜緊貼在一起；
(4) 依據不同實驗設定電融合參數，將核移植后的細胞進行融合，模 擬精子入卵時的釣離子波動，使供體細胞充分融入卵母細胞中，電激后的 重組胚移入培養液中，于恒溫培養箱，培養50分鐘；
(5) 依據不同實驗設定參數，將核移植重組胚的進行化學處理，抑制染色體排出，保證重構胚倍型,'處理后的重組胚方欠入培養液中，于38.5。C、 5%的C02培養箱中培養6天，觀察嚢胚的發育情況良好。 實施例4
針對需透明帶附著的卵母細胞進行克隆的操作四
(1) 用0.05ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬 卵母細胞26小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；■
(2)取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，便于進行顯微操作；
(3 )將棵卵放入顯微操作盤操作滴中，用固定管從極體對側固定卵母 細胞，通過尖的去核管吸取供核細胞，直接把供核細胞注入卵母細胞質內， 退針時，順勢將第一極體一并去除，即去除極體的遺傳物質，并整理和恢 復卵膜切口；如果是采用卵周隙注入法，為有利于融合，用去核管先吸取 少量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卯周隙中，使供體細胞與 卵膜緊貼在一起；
(4) 依據不同實驗設定電融合參數，將核移植后的細胞進行融合，模 擬精子入卵時的鈣離子波動，使供體細胞充分融入卵母細胞中，電激后的 重組胚移入培養液中，于恒溫培養箱，培養30-60分鐘；
(5) 依據不同實-*沒定參數，將核移植重組胚的進行化學處理，抑制 染色體排出，保證重構胚倍型，處理后的重組胚放入培養液中，于38.5。C、 5%的C02培養箱中培養5天，觀察嚢胚的發育情況良好。
實施例5
針對需透明帶附著的卵母細胞進行克隆的操作五 ' (1)用20ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵
母細胞10小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞，
形成棵卵，便于進行顯微操作；(3 )將棵卵放入顯微操作盤操作滴中，用固定管從極體對側固定卵母 細胞，通過尖的去核管吸取供核細胞，直接把供核細胞注入卵母細胞質內， 退針時，順勢將第一極體一并去除，即去除極體的遺傳物質，并整理和恢 復卵膜切口；如果是釆用卵周隙注入法，為有利于融合，用去核管先吸取 少量細胞質，再將細胞質連同供體細胞一起注入卵周隙中，使供體細胞與 卵膜緊貼在一起； .
(4) 依據不同實驗設定電融合參數，將核移植后的細胞進行融合，模 擬精子入卵時的釣離子波動，使供體細胞充分融入卵母細胞中，電激后的 重組胚移入培養液中，于恒溫培養箱，培養60分鐘；
(5) 依據不同實l"殳定參數，將核移植重組胚的進行化學處理，抑制 染色體排出，保證重構胚倍型，處理后的重組胚放入培養液中，于38.5"C、 5% C02培養箱中培養5天，觀察嚢胚的發育情況良好。
實施例6
針對去透明帶的卵母細胞進行克隆的操作一
(1) 用0.1ug/ml光輝霉素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵 母細胞26小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，'便于后續克隆操作；
(3) 將脫去棵卵放在鏈酶蛋白酶中消化，去除透明帶；
(4) 用口吸管反復吹打卵母細胞去掉其表面的第一極體即去除極體的 遺傳物質；
(5) 將去掉第一極體的卵母細胞用植物凝集素處理，使之表面粘度增 加，黏合一個供體細胞在細胞融合儀中，在2.0KV/cm的電擊作用下使二者 融合；
(6) 將融合后的胚胎放置在培養液中60分鐘，使供體細胞充分融入 卵母細胞中；(7 )將融合后的胚胎方文在激活液中，以0.85KV/cm的電擊進行激活， 即模擬精手入卵時的鈣波動；
(8 )將重構胚置于含有5ug/ml細胞松弛素與10ug/ml放線菌酮混合的 培養液中處理4小時，抑制染色體排出，保證重構胚倍型；
(9)4小時后，將重構胚放在微穴(well of the well)培養體系中，在 胚胎培養液中培養5天，觀察胚胎發育情況良好。 實施例7
針對去透明帶的卵母細胞進行克隆的操作二
(1) 用10ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵 母細胞0.5小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，，便于后續克隆操作；
(3) 將脫去棵卵放在鏈酶蛋白酶中消化，去除透明帶；
(4) 用口吸管反復吹打卵母細胞去掉其表面的第一極體即去除極體的 遺傳物質；
(5) 將去掉第一極體的卵母細胞用植物凝集素處理，使之表面粘度增 加，黏合一個供體細胞在細胞融合儀中，在2.0KV/cm的電擊作用下使二者 融'合；
(6) 將融合后的胚胎放置在培養液中60分鐘，使供體細胞充分融入 卵母細胞中-;
(7 )將融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的電擊進行激活， 即模擬精子入卵時的鈣波動；
(8 )將重構胚置于含有5ug/ml細胞松弛素與10ug/ml放線菌酮混合的 培養液中處理5小時，抑制染色體排出，保證重構胚倍型；
(9) 4小時后，將重構胚放在微穴(well of the well)培養體系中，在 胚胎培養液中培養7天，觀察胚胎發育情況良好。實施例8
針對去透明帶的卵母細胞進行克隆的操作三
(1 )用5ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵母 細胞5小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卯，便于后續克隆操作;
(3) 將脫去棵卵放在鏈酶蛋白酶中消化，去除透明帶；
(4) 用口吸管反復吹打卵母細胞去掉其表面的第一極體即去除極體的 遺傳物質；
(5) 將去掉第一極體的卵母細胞用植物凝集素處理，使之表面粘度增 加，黏合一個供體細胞在細胞融合儀中，在2.0KV/cm的電擊作用下使二者 融合5
(6) 將融合后的胚胎放置在培養液中60分鐘，使供體細胞充分融入 卵母細胞中.；
(7 )將融合后的胚胎》文在激活液中，以0.85KV/cm的電擊進行激活， 即模擬精子入卵時的鈣波動；
(8 )將重構胚置于含有5ug/ml細胞松弛素與10ug/ml放線菌酮混合的 培養液中處理4小時，抑制染色體排出，保證重構胚倍型；
(9 ) 4小時后，將重構胚放在微穴(well of the well)培養體系中，在 胚胎培養液中培養7天，觀察胚胎發育情況良好。 實施例9
針對去透明帶的卵母細胞進行克隆的操作四
(1)用0.05ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬 卵母細胞20小時，滅活卯母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2 )取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，便于后續克隆操作；(3) 將脫去棵卵放在鏈酶蛋白酶中消化，去除透明帶；
(4) 用口吸管反復吹打卵母細胞去掉其表面的第一極體即去除極體的 遺傳物質；
(5) 將去掉第一極體的卵母細胞用植物凝集素處理，使之表面粘度增 加，翁合一個供體細胞在細胞融合儀中，在2.0KV/cm的電擊作用下使二者
(6) 將融合后的胚胎放置在培養液中60分鐘，使供體細胞充分融入 卵母細胞中；
(7 )將融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的電擊進行激活， 即模擬精子入卵時的鈣波動；
(8 )將重構胚置于含有5ug/ml細胞松弛素與10ug/ml放線菌酮混合的 培養液中處理4小時，抑制染色體排出，保證重構胚倍型；
(9 ) 4小時后，將重構胚放在微穴(well of the well)培養體系中，在 胚膽培養液中培養5天，觀察胚胎發育情況良好。 實施例10
針對A透明帶的卵母細胞進行克隆的操作五
(1) 用20ug/ml防線菌素作為去核試劑，處理經體外培養成熟的豬卵 母細胞5小時，滅活卵母細胞，使之無法進行RNA轉錄和合成蛋白；
(2) 取出成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞， 形成棵卵，便于后續克隆操作；
(3) 將脫去棵卵放在鏈酶蛋白酶中消化，去除透明帶；
.(4)用口吸管反復吹打卵母細胞去掉其表面的第一極體即去除極體的 遺傳物質；
(5)將去掉第一極體的卵母細胞用植物凝集素處理，使之表面粘度增 力口，黏合一個供體細胞在細胞融合儀中，在2.0KV/cm的電擊作用下使二者 融合；(6) 將融合后的胚胎放置在培養液中60分鐘，使供體細胞充分融入 卵母細胞中；
(7) 蔣融合后的胚胎放在激活液中，以0.85KV/cm的電擊進行激活， 即模擬精子入卵時的鈣波動；
(8 )將重構胚置于含有5ug/ml細胞松弛素與10ug/ml放線菌酮混合的 培養液中處理4小時，抑制染色體排出，保證重構胚倍型；
(9) 4小時后，將重構胚i文在《敖穴(well of the well)培養體系中，在 胚胎培養液中培養7天，觀察胚胎發育情況良好。
經測定，以上實施例中的細胞核移植方法，均能得到能正常發育成熟 的胚胎。
綜上^述，本發明通過使用去核試劑滅活卵母細胞來去除卵母細胞的 細胞核，取代現有技術的細胞核移植技術中需要機械操作去除卵母細胞細 胞核的步驟，簡化了該步驟的操作，可廣泛應用于多種物種的細胞核移植 操作中。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以 改進或變換，而這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1、一種細胞核移植方法，包括以下步驟A、構建卵母細胞；B、采用濃度為0.05～20ug/ml的去核試劑，將所述體卵母細胞處理0.5～26小時，獲得細胞質體；C、構建具有所需遺傳特性的供體細胞或細胞核，將細胞質體與所述供體細胞或細胞核融合，得到重建的胚胎。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞為需透明 帶附著的卯母細胞。
3、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞為去透明 帶的卵母細胞。
4、 如權利要求1、 2或3所述的務法，其特征在于，所述步驟B中， 所述去核試劑的濃度為0.1 ~ 10ug/ml,處理所述卵母細胞的時間為0.5-20 小時。
5、 如權利要求1、 2或3所述的方法，其特征在于，所述去核試劑 為防線菌素、阿霉素、柔紅霉素、普卡霉素、光輝霉素、蠅蕈素和二氯苯 并咪唑呋喃型核糖苷中的 一種或幾種。
6、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述去核試劑為防線菌 素、阿霉素、柔紅霉素、普卡霉素、光輝霉素、蠅蕈素和二氯苯并咪唑呋 喃型核糖苷中的一種或幾種。
7、 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞來源于哺 乳動物。
8、 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞來源于哺乳動物。
9、 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是豬。
10、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是豬。
全文摘要
本發明公開了一種細胞核移植方法，包括以下步驟構建卵母細胞；采用濃度為0.05～20ug/ml的去核試劑，將所述卵母細胞處理0.5～26小時，獲得細胞質體；構建具有所需遺傳特性的供體細胞或細胞核，將細胞質體與所述供體細胞或細胞核融合，得到重建的胚胎。本發明通過使用去核試劑滅活卵母細胞來去除卵母細胞的細胞核，取代現有技術的細胞核移植技術中需要機械操作去除卵母細胞細胞核的步驟，簡化了該步驟的操作，可廣泛應用于多種物種的細胞核移植操作中。
文檔編號C12N15/06GK101580828SQ20091010726
公開日2009年11月18日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者杜玉濤, 楊煥明, 建 汪, 俊 王 申請人:深圳華大基因科技有限公司