專利名稱：一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法
技術領域：
本發明涉及一種去除小鼠卵母細胞核的方法，具體的說是一種采用透明帶溶洞法 去除小鼠卵母細胞核的方法。
背景技術：
隨著生物技術的發展，哺乳動物體細胞核移植技術作為生產轉基因動物、制作乳 腺生物反應器、治療性克隆等前沿領域的一個不可替代的技術平臺，雖然在綿羊、牛、豬和 小鼠上取得了巨大進展，但由于體細胞核移植的整個技術體系涉及眾多環節，而且各個環 節效率低下，最終導致體細胞克隆技術的總體效率較低，還未超過10 %。通過顯微操作構建 重組胚是核移植研究中普遍采用的經典方法，其中卵母細胞的去核是細胞核移植中的重要 步驟之一，也是能否成功完成核移植的一個重要限制因素，直接關系到核移植實驗的成敗。 一種快速、準確的去核方法將無疑會提高核移植技術的整體效率。小鼠作為是最為常用的 實驗動物，然而，小鼠卵母細胞的特性與家畜(牛、羊和豬)差異很大。小鼠卵母細胞的直 徑相對較小，透明帶薄而軟，這種特性使小鼠卵母細胞在顯微操作去核時難度增大。傳統的核移植技術中，主要是通過顯微操作機械性去除卵母細胞中的染色質而獲 得受體胞質，但存在耗費時間長、對細胞損傷大等缺點，而且第1極體與核的相對位置易變 動，以致去核率較低。目前，小鼠卵母細胞去核多借助Piezo裝置，去核率高達99%，但這種 方法需要昂貴的儀器設備，同時對研究員有很高的技術要求，大多數實驗室不易實現。而 且，所用針管也不能吸出極體，極體的存在將影響供體細胞和細胞質體的電融合。另外，還 有化學去核法，透明帶穿孔擠壓去核法，透明帶磨口換平口針兩步去核法等。不同的去核方 法有各自的優缺點，在操作時間、去核成功率、成本花費及損傷程度上有所不同。兩步法操 作步驟繁瑣，耗費時間長，對卵母細胞產生不利影響。穿孔擠壓法極易導致細胞變形，胞質 散掉。而且有的去核方法技術要求很高，方法不易掌握，不利推廣。
發明內容
本發明主要針對上述問題，而提供一種操作簡便，消耗時間少，對細胞膜造成的損 傷小，成本低廉，去核成功率高的方法。本發明為解決上述問題，所采用的技術方案為 步驟一選取基礎酸性臺氏溶液，備用；
步驟二 酸性臺氏溶液的改良利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的pH值，后用 0. 22 μ m的微孔濾器進行過濾，于_20°C凍存，備用；
步驟三損傷微滴制備在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每 個區域內制作1個30 μ 1的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個 20 μ 1的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；
步驟四卵母細胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母細胞置于塑料皿的周邊 顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使每個中心微滴中至少含有15個含第1極體的卵母細胞；
步驟五調整顯微操作針將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固 定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵 母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；
步驟六去核在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前 端，利用平口針吸取酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利用平口 針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母細胞第 一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明帶反應， 至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋平口針注 射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；
步驟七去核后卵母細胞活性鑒定將去過核的卵母細胞置于0. 3%臺盼藍染色液中， 染色3—4分鐘，后用M2液洗滌4一6次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡， 不著色者判定為存活。所述的酸性臺氏溶液由NaCl、KCl、CaCl2 · H2CKMgCl2 · H20、葡萄糖、聚乙烯基吡咯 烷酮和超純水組成，各成份的重量百分比為NaCl 0. 8%,KCl 0. 02% ,CaCl2 ·Η20 0. 024%、 MgCl2 · H2O 0. 01%、葡萄糖0. 1%、聚乙烯基吡咯烷酮0. 4%，余量為超純水。所述的超純水為去除水中的導電介質、不離解的膠體物質、氣體及有機物，其電阻 率大于18ΜΩ*ο 。所述的禮液的主要成分為在IOml的超純水中加入0. 5533g的NaCl, 0. 0356g的 KCl, 0.4969g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0. 0036g的丙酮酸鈉，0. 261g的乳酸鈉，0. 4g的
牛血清白蛋白，余量為超純水。所述的0.3%臺盼藍染色液為稱取0.03g臺盼藍，將其溶于IOml的M2液中， 0. 22 μ m的微孔濾器過濾除菌，-20°c凍存備用。所述的顯微操作液為基礎的M2液添加5 μ g/ml的細胞松弛素Β、5 μ g/ml Hoechst 33；342、10%的胎牛血清、0. 01%的聚乙烯醇。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛，是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有各種 血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等細胞生長必須的營養成份，對 動物細胞體外生長發育具有極為重要。Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低，常用 于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。本發明的有益效果
1.設備簡易無需昂貴的Piezo裝置，在顯微操作儀下即可完成去核操作；
2.試劑(酸性臺氏溶液)成份簡單絕大部分為無機試劑，易于購買，配置簡單，成本低
廉；
3.操作難度低，易掌握只需將去核針口對準透明帶，輕輕釋放少許酸性臺氏溶液，將 其溶解出一個小孔洞，再將去核針順勢插入這個孔洞吸出極體及細胞核即可，操作難度比 其它去核方法小得多，初學者就能很快掌握；
4.去核操作輕柔，機械損傷小在卵母細胞相對安靜狀態下既能完成去核損傷，克服 了其它去核方法將卵母細胞擠壓變形去核時對細胞骨架及細胞膜所帶來的機械損傷；5.去核快，效率高平均每個卵母細胞去核所用時間為1一6秒，卵母細胞的去核后存 活率均在97%以上，去核成功率在99%以上；
6.去核液細胞毒性小，緩沖能力強去核操作在M2液中進行，不需加入專用的去核試 劑，細胞毒性小；另外，M2液里面的緩沖成分能中和酸性臺氏溶液中多余的H+,穩定去核過 程中操作液的PH值不發生劇烈變化，從而保護卵母細胞活性免受酸堿度變化的侵害。
圖1顯微操作微滴圖2透明帶溶洞前卵母細胞圖； 圖3透明帶溶洞后卵母細胞圖； 圖4去核卵母細胞圖； 圖5去核卵母細胞臺盼藍染色圖。
具體實施例方式實施例一
步驟一選取基礎酸性臺氏溶液，備用；
步驟二 酸性臺氏溶液的改良利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的pH值為 1. 5，后用0. 22 μ m的微孔濾器進行過濾，于-20°C凍存，備用；
步驟三損傷微滴制備在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每 個區域內制作1個30 μ 1的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個 20 μ 1的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；
步驟四卵母細胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母細胞置于塑料皿的周邊 顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使 每個中心微滴中含有17個含第1極體的卵母細胞；
步驟五調整顯微操作針將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固 定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵 母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；
步驟六在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前端，利用 平口針吸取PH值為1.5的酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利 用平口針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母 細胞第一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明 帶反應，至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋 平口針注射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；
步驟七去核后卵母細胞活性鑒定將去過核的卵母細胞置于0. 3%臺盼藍染色液中， 染色4分鐘，后用M2液洗滌6次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡，不著 色者判定為存活，去核成功率為99. 8%，去核后存活率為97. 3%。實施例二
步驟一選取基礎酸性臺氏溶液，備用；
步驟二 酸性臺氏溶液的改良利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的pH值為2. 0，后用0. 22 μ m的微孔濾器進行過濾，于_20°C凍存，備用；
步驟三損傷微滴制備在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每 個區域內制作1個30 μ 1的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個 20 μ 1的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；
步驟四卵母細胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母細胞置于塑料皿的周邊 顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使 每個中心微滴中含有16個含第1極體的卵母細胞；
步驟五調整顯微操作針將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固 定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵 母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；
步驟六在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前端，利用 平口針吸取PH值為2. 0的酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利 用平口針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母 細胞第一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明 帶反應，至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋 平口針注射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；
步驟七去核后卵母細胞活性鑒定將去過核的卵母細胞置于0. 3%臺盼藍染色液中， 染色3. 5分鐘，后用M2液洗滌5次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡，不 著色者判定為存活，去核成功率為99. 3%，去核后存活率為97. 4%。
實施例三
步驟一選取基礎酸性臺氏溶液，備用；
步驟二 酸性臺氏溶液的改良利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的ρΗ值為 2. 5，后用0. 22 μ m的微孔濾器進行過濾，于-20°C凍存，備用；
步驟三損傷微滴制備在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每 個區域內制作1個30 μ 1的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個 20 μ 1的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；
步驟四卵母細胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母細胞置于塑料皿的周邊 顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使 每個中心微滴中含有15個含第1極體的卵母細胞；
步驟五調整顯微操作針將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固 定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵 母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；
步驟六在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前端，利用 平口針吸取PH值為2.5的酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利 用平口針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母 細胞第一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明 帶反應，至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋 平口針注射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；
步驟七去核后卵母細胞活性鑒定將去過核的卵母細胞置于0. 3%臺盼藍染色液中，染色3分鐘，后用M2液洗滌4次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡，不著 色者判定為存活，去核成功率為99. 1%，去核后存活率為97. H
權利要求
1.一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征在于去核方法為 步驟一選取基礎酸性臺氏溶液，備用；步驟二 酸性臺氏溶液的改良利用濃度為36%的HCl調節酸性臺氏溶液的PH值，后用 0. 22 μ m的微孔濾器進行過濾，于_20°C凍存，備用；步驟三損傷微滴制備在規格為35mm的塑料皿中，將皿底均等劃分為四個區域，在每 個區域內制作1個30 μ 1的顯微操作液微滴，稱中心微滴；在每個中心微滴外周滴加2個 20 μ 1的顯微操作液和1個酸性臺氏溶液微滴，形成周邊微滴，后上面覆蓋一層礦物油；步驟四卵母細胞置于微滴中取性成熟的小鼠M II期的卵母細胞置于塑料皿的周邊 顯微操作液微滴中，在體視顯微鏡下用吸卵針洗滌5次，放入覆蓋有礦物油的中心微滴，使 每個中心微滴中至少含有15個含第1極體的卵母細胞；步驟五調整顯微操作針將塑料皿置于倒置相差熒光顯微鏡的顯微操作臺上，將固 定管和平口針安裝在顯微操作儀的固定桿上，調解螺旋，在倒置顯微鏡的視野中，觀察到卵 母細胞、固定管和平口針處于同一水平線的位置；步驟六去核在視野中找到卵母細胞、固定管和平口針，將卵母細胞置于固定管前 端，利用平口針吸取酸性臺氏溶液，后將平口針移至含有卵母細胞的中心微滴中，利用平口 針調整第1極體的位置，使平口針的針口位于第1極體透明帶前端，使固定管、卵母細胞第 一極體、平口針針口處于同一水平線位置，吹出平口針管內的酸性臺氏溶液與透明帶反應， 至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，打開顯微鏡的熒光以指示細胞核位置，回旋平口針注 射器，使其產生負壓，吸出第1極體及其周圍的胞質，去核結束；步驟七去核后卵母細胞活性鑒定將去過核的卵母細胞置于0. 3%臺盼藍染色液中， 染色3—4分鐘，后用M2液洗滌4一6次，在體視顯微鏡下查檢染色情況，藍染者判定為死亡， 不著色者判定為存活。
2.根據權利要求1所述的一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征 在于所述的酸性臺氏溶液由NaCl、KC1、CaCl2 · H2O, MgCl2 · H20、葡萄糖、聚乙烯基吡咯烷 酮和超純水組成，各成份的重量百分比為NaCl 0. 8%, KCl 0. 02%、CaCl2 · H2O 0. 024%、 MgCl2 · H2O 0. 01%、葡萄糖0. 1%、聚乙烯基吡咯烷酮0. 4%，余量為超純水。
3.根據權利要求1所述的一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，其特征 在于所述的改良后的酸性臺氏溶液的PH值為1. 5或2. 0。
全文摘要
一種采用透明帶溶洞法去除小鼠卵母細胞核的方法，在塑料皿中做中心微滴和周邊微滴，顯微鏡下用酸性臺氏溶液與透明帶反應，在1—6秒后使透明帶上溶解出一個孔洞，至透明帶變薄變軟，胞質向外凸時止，吸出第1極體及周圍胞質，釋放卵母細胞，去核后用臺盼藍染色觀察完整性，去核成功率大于99.1%。本發明的制備方法所用設備簡易，在顯微操作儀下即可完成去核操作；試劑成份簡單，配置簡單，成本低廉，操作難度低，易掌握，去核操作輕柔，機械損傷小，去核快，效率高平均每個卵母細胞去核所用時間為1—6秒，卵母細胞的去核后存活率均在97％以上，去核成功率在99％以上；本方法適用于無Piezo實驗室的小鼠核移植研究及其胚胎發育相關的早期事件研究。
文檔編號C12N5/075GK102127521SQ20101060499
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月25日 優先權日2010年12月25日
發明者付祥龍, 劉鳳軍, 張玉玲, 禹學禮, 翟小偉, 陳曉麗, 靳麗軍 申請人:河南科技大學